共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

要約

PHluorin、pH に敏感な緑色蛍光タンパク質を用いたそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン分泌の可視化のためのプロトコルについて述べる。膵島は、小胞貨物ニューロペプチド Y に結合された pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しています。これにより、共焦点顕微鏡によるインスリン顆粒の融合イベントを検出するため。

要約

インスリン分泌は、病気のようにも通常生理条件下でのグルコース恒常性で中心的な役割を果たしています。インスリン開口分泌電気生理学や顕微鏡蛍光レポーターの式に結合を使用するかを検討する現在のアプローチ。しかしこれらの技術のほとんどはクローン細胞株に最適化されています。 または膵島を分離を必要とします。対照的に、ここで紹介した方法はそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン開口分泌のリアルタイム可視化できます。このプロトコルでまずエンコード pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 (GFP)、pHluorin、神経ペプチド Y(NPY) と結合したアデノ ウイルスの単離膵島のウイルスの感染を示します。第二に、我々 は、共焦点イメージング島 5 日間後ウイルス感染とインスリン顆粒分泌を監視する方法について説明します。簡単に言えば、感染した小島をイメージング室 coverslip のされされて継続的に様々 な刺激を含む細胞外の溶液を灌流中の直立レーザー走査型共焦点顕微鏡の下でイメージを作成します。高速共鳴スキャナーを使用して時間経過の録音として膵島の 50 μ m にまたがる共焦点画像を取得します。インスリン顆粒細胞膜との融合は、時間をかけて続けることができます。この手順は、単一の実験で刺激のバッテリのテストが可能になりますまた、マウスと人間の島の両方と互換性のある、機能イメージング (例えば膜の潜在性またはゾル性細胞質カルシウム染料) のための様々 な染料と組み合わせることができます。

概要

インスリンは膵島のベータ細胞によって生成される、グルコース代謝¹の重要な調節因子であります。死またはベータ細胞の機能不全はグルコース恒常性を乱すし、糖尿病²に 。Ca^{2 +}でリリースされている芯顆粒中にインスリンがパック-に依存する方法³。インスリン開口分泌の調整方法を解明理解何がインスリン分泌を決定し、糖尿病の治療のための新規治療標的の同定のための新しい道を開くに不可欠です。

インスリン分泌は、蛍光分子との組み合わせで, 膜容量測定と顕微鏡的アプローチなどの電気生理学的アプローチを使用して幅広く研究されています。膜容量測定時間分解能が良いがあるし、単一セルの録音を許可します。ただし、静電容量の変化セルの純表面変更を反映し個々 の融合イベントをキャプチャか他の非インスリン分泌小胞³からインスリン顆粒の融合を区別します。蛍光プローブと小胞積荷タンパク質との組み合わせで 2 光子または全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの微視的アプローチは、追加の詳細を提供します。これらの技術は、分泌の単一イベントとも前と後に分泌の段階をキャプチャし、セル³の人口の分泌パターンを勉強するため。

蛍光レポーターを 3 種類にすることができます: 1) 細胞外、2) 細胞質、または 3) 小胞。1) 細胞外記者が極地のトレーサー (例えばdextrans、sulforhodamine B (SRB)、黄色、ルシファー ピラニン)⁴細胞外の環境を導入することができます。極のトレーサーの使用は細胞の人口の融合細孔の調査では、し、血管など様々 な細胞構造をキャプチャします。しかし、彼らは小胞貨物に関する報告はしません。2) 細胞質の記者は、細胞質に直面、ドッキングと開口放出に関与する膜準蛋白質に結合する蛍光プローブです。神経科学神経伝達物質のリリース⁵を勉強するために正常に使用されている水溶性Nエチルマレイミド感受性因子添付ファイル蛋白質受容体 (スネア) 家族のメンバーがあります。そのような蛋白質は複数の結合パートナーがあり、インスリン顆粒特定。3) 小胞の記者は、貨物固有ベシクル挙動の調査を可能にする小胞貨物蛋白質に融合した蛍光プローブです。インスリン顆粒特定貨物蛋白質は他の間でインスリン、c-ペプチド、膵島アミロイドポリペプチド NPY を含める^6,7。NPY は、インスリン顆粒を含むであるのみ、共同蛍光レポーター⁸の優秀なパートナーとなってインスリン、解放されます。

NPY を異なる蛍光タンパク質の融合は特定シナプトタグミン アイソ フォーム^9,10の要件などの神経内分泌細胞の開口放出の様々 な面を調査する以前採用されている方法リリースの時間コースには、アクチン細胞骨格とミオシン II^11,12によって異なります。本研究では非蛍光性は、変更された GFP 蛍光レポーターとして pHluorin を選んだ内部コアの密度の高い酸性 pH で顆粒は、中立的な細胞外 pH¹³への露出に鮮やかな蛍光なります。成熟したインスリン顆粒 5.5 以下の酸性の pH があります。顆粒は細胞膜と開きますヒューズ、一度その貨物が 7.4,^7,14でレポーターとして pH 感応蛋白質 1p-169 利用できるの中立的な細胞外 pH に公開されます。

1p-169 pH の敏感な性質とインスリン顆粒中の NPY の選択式、NPY pHluorin 融合コンストラクトを使用してインスリン開口分泌のさまざまなプロパティを研究できます。融合コンストラクトのウイルスの伝達は高いトランスフェクション効率を確保し、一次ベータ細胞または細胞や膵島を動作します。このメソッドは、NPY を含む小胞を持つ他の細胞型で開口放出を勉強するためのガイドラインとして使用できます。それは、特定の条件(ノックダウン、過剰発現等)の影響を検討する任意のトランスジェニック マウス モデルによる開口放出に組み合わせることもできます。この手法は、以前インスリン顆粒分泌 β 細胞膵島¹⁵の時空間パターンを特徴付けるために使用されています。

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プロトコル

マイアミ大学の動物倫理委員会は、すべての実験を承認した

。

1 です。 ウイルス感染のそのまま分離人間またはマウスの膵島

1. 島文化: 膵島培養メディアを準備: コンノート医学研究所 (CMRL) 1066、10% (v/v) FBS と 2 mM L グルタミン。
   1. ヒト膵島は、統合された膵島配布プログラム (NIDDK, NIH) から取得されます。到着時に転送島 (~ 500 アイレット同等) に 35 mm 組織培養処理 2 mL CMRL 培養基で 37 ° C、5/95% CO ₂/O ₂ ウイルス感染前に 24 h のペトリ皿
   。
   2. マウス膵ランゲルハンス島を分離以前に確立されたプロトコル ¹⁶ 次にすることができます。次の分離、培養 〜 200 島同等の 35 mm 組織培養処理 2 mL CMRL 培養基で 37 ° C、5/95% CO ₂/O ₂ ウイルス感染前に 24 h のペトリ皿
      。 注意: NPY pHluorin と蛍光の重複を避けるために島に表明した GFP や YFP の記者とトランスジェニック マウスは使用しない
   。
2. ウイルス準備
   注: NPY pHluorin 融合 pcDNA3 ベクトル ¹⁰ に複製され subcloned アデノウイルスベクター アデノ ウイルスの生産のために [アデノ ウイルス血清型 5 (コピー DE1/E3)] 組換えアデノ ウイルスによる製造会社。ウイルスが避けようと-80 ° C で保存されます。ウイルスの在庫は 10 の抗体で会社によって提供 ¹² 10 ¹³ ウイルス粒子 (〜 3 × 10 ¹⁰ - 3 x 10 ¹¹ PFU)。
   1. 体外 膵感染、使用 10 ⁶ PFU/mL 約 2 (詳細については 議論 を参照) の感染 (MOI) の近似的多様性に終って
3. 膵島のウイルス感染
   注意: バイオ セーフティ レベル 2 (BSL2) プロシージャおよび証明にアデノ ウイルスでの作業が必要です。ガイダンス ・ BSL2 手続きに関する研修制度バイオ セーフティに関する役員に確認してください。
   1. 上記のように人間/マウス島を準備します
   。
   2. (10 %fbs と 2 mM L グルタミン) と CMRL 培地 2 mL に人間/マウス島を含む各 35 mm のペトリ皿にストック ウイルスの 5-10 μ L を追加します
      。 注: ウイルス会社データシートで定めるウイルス力価によると使用量を調整する
   。
   3. ウイルスを含んでいる、島の文化メディア 37 °C/5% CO ₂ 24 時間で
   4. 24 h 後吸引ウイルスを含むメディアと 2 mL CMRL 培地 (10 %fbs と 2 mM L グルタミン) で置き換えます
   。
   5. 37 °C/5% CO ₂、3 日おき、メディアの交換で 4-6 日の小島を文化します
   。
   6. 後 4 - 養殖の 6 日間は、約、30% 膵島細胞に感染するを期待しています。小島は、ライブ イメージング実験のため使用できます
   。

2。感染している小島の共焦点イメージング

注:、共焦点レーザー顕微鏡に必要な資機材の 材料表 を参照してください

。

1. 試薬調製と実験装置
   1. 細胞外のソリューションの準備: pH 7.4、滅菌フィルターの 125 mM の NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl ₂、1 mM MgCl ₂、25 mM HEPES、0.1 %bsa を追加
      。 注: このバッファーは通常ブドウ糖を使わず、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。グルコースは、所望の最終濃度に到達する実験の日に追加されます。
      1. 準備基底グルコース (3 mM) 培地: 細胞外液 50 mL に 2 M グルコース株式 75 μ L を追加します
      。
      2. 高血糖 (16 mM) 媒体: 細胞外液 50 mL に 2 M グルコース ストックの 400 μ L を追加
   2. 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液中の任意の追加刺激 (例えば、KCl またはアデノシン三リン酸 (ATP)) を希釈します
   。
   3. 1 h の coverslip にポリ-D-リジン溶液 (1 mg/mL) の 30 μ L を追加し、徹底的に H ₂ o. 洗浄ポリ-D-リジンと coverslips を前処理実験を開始する前に
      注: ポリ リジン コーティング coverslips 格納できる常温 6 ヶ月です
   。
   4. 1 mL ピペットを使用して、実験の前に少なくとも 1 時間は 3 mM グルコースを細胞外の溶液を含む 35 mm のペトリ皿に小島を転送します。37 ° C、5% CO ₂ で小島を維持します
      。 注: 必要に応じて、細胞膜がこの手順でラベル付けできます。細胞膜にラベルを付ける、3 mM グルコースを細胞外の溶液に 2 μ M ・ ディ ・ 8 ANEPP 染料を追加します。37 °C/5% CO ₂ で 1 h の色素溶液中の小島を孵化させなさい。膜色素は、488 で励起されることが nm と 620 で検出された nm
   。
   5. 分、実験を開始する前に、真空のシリコン グリスをシール イメージング室に、coverslip を取り付けます。イメージング プラットフォームにイメージングの商工会議所を修正します。小島は 20 分を表面に付着させ coverslip のポリ D リジン扱われる領域に 20-30 の小島を配置、ピペットを使用して
      注: coverslip 膵損傷を避けるために完全に乾燥させることが重要です
   。
   6. 小島、coverslip に付着している間は、水ですすぐ灌流システムを準備します。別のチャンネルに各ソリューションを追加: 3 mM グルコース (1 チャンネル)、16 mM グルコース (チャネル 2)、100 μ M 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) と 10 μ M フォルスコリン (チャネル 3) 3 mM グルコース (チャネル 4) 3 mM グルコース (10 μ M ATP の 25 mM KCl 16 mM グルコースチャネル 5)。各チャンネルを個別に開くと、数分間ソリューション フローをさせることによって、システムからすべての泡を削除し、流れが一貫性のある (0.5 mL/分) と管が漏れていないことを確認してください
   。
   7. 灌排水チューブに単一インライン ソリューション ヒーターを接続し、37 止水バッファーの温度を調整する ° C
   8. は、吸引ポンプを準備します。システムからすべてのバブルを削除して、流れが一貫した管が漏れていないことを確認します
   。
   9. 島は、coverslip 表面に付着後は優しく 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液でのイメージングの商工会議所によって埋めます。洗浄、カバーガラスの表面から島を避ける
   。
   10. 顕微鏡ステージ上に小島とイメージング プラットフォームを配置し、灌流システムと吸引ポンプに接続します
   。
   11. ターン流れ、常に 3 G 細胞外の溶液で小島を灌流します。システム共焦点レーザー顕微鏡の準備が整いました
   。
2. 共焦点イメージング
   1. 低倍率の顕微鏡分野で小島を探します。小島に焦点を当てて後は、高い倍率の目標に切り替える (例えば、63 X 水浸対物レンズ (63 X/0.9 NA)).
   2. ソフトウェア (資材表) を使用して取得を開き、共振型スキャナー モードを有効にします
   。
   3. XYZT 画像モードを選択し、取得設定を次のように:
      1. ターンではアルゴン レーザーおよび 488 nm レーザー ライン、50 %phluorin 励起レーザー パワーを調整します
      。
      2. 505 555 nm の発光を収集します
      。
      3. は、512 × 512 ピクセルの解像度を選択します。プレス、" ライブ " イメージングを起動し、(典型的な利得は約 600 V) 利得レベルを調整します
      。
      4. 設定の開始と z スタックの末尾: 小島の上に焦点を当てるし、選択 " 開始 " 最後集中することができますを選択する平面の移動と " エンド "。5 μ m の z ステップ サイズを使用します。共焦点平面の数が自動的に算出されます
      。
      5. 1.5-2 秒近くそれぞれの z の取得時間間隔を設定し、オプションを選択 " を停止するまでを取得 " 連続イメージング
      。
      6. プレス、" 開始 " ini ボタンtialize.
   4. 必要な刺激と小島を灌によって開口分泌を誘導するさまざまな刺激のプロトコルを使用します。刺激のプロトコルを (次に見なさい) 目的の科学的な目的に合うようにカスタマイズできます
   。
3. 刺激のプロトコル
   注: すべての刺激のプロトコルでは 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液に一定の血流中に膵島バック グラウンド アクティビティの少なくとも 2 分を記録することによって開始します。必要な期間が覚醒剤を灌流します。覚醒剤の注文、刺激の持続時間と同様、録音の期間は、必要な科学的な目的に合うようにカスタマイズできます。新しい刺激を開始する前に 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液で小島を徹底的に洗浄することを確認します。以下のメソッドの機能を示すために使用されているサンプル刺激のプロトコルを見つけます。
   PHluorin ph 非感受性とウイルス感染効率 ( 図 3) のための肯定的な制御として塩化アンモニウム (NH ₄ Cl) と
   1. 活性化: 3 mM グルコース (2 分) → 50 mM NH ₄ 3 mM グルコース Cl (2 分)→ 3 mM グルコース (2 分)
      注: で、NH ₄ Cl ソリューションはモルごとに NaCl を取り付けます
   。
   2. ( 図 5 および 図 6) グルコース濃度を増やすことによって刺激するインスリン開口分泌: 3 mM グルコース (2 分) → 16 mM グルコース (15-30 分) → 3 mM グルコース(2 分
      注: 活動のいくつかのバーストを見るために少なくとも 15 分の 16 G ソリューションを継続的に島を灌流
      注: 分泌応答 ¹⁷ の一貫性を高めるために追加キャンプ調達エージェント (IBMX 100 μ M と 10 μ M フォルスコリン) 3 G と 16 G の両方のソリューションにします。顆粒の分泌の一時的なパターンは変わりません。詳細は、 ¹⁵ と ディスカッション を参照してください
   。

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結果

技術の全体のワークフローは、図 1に示すです。簡単に言えば、マウスまたは膵島 NPY pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しているできイメージ、共焦点顕微鏡のカルチャで数日後。顆粒は細胞膜と開くヒューズ、蛍光性の増加が観察される、定量化することができます (図 1)。どう NPY pHluorin は確かにインスリン顆...

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ディスカッション

本稿では、共焦点顕微鏡による内そのままの膵島 β 細胞でインスリン顆粒の開口放出を視覚化するために使用できる手法について説明します。高いトランスフェクション効率を確保するためにアデノ ウイルス複製蛍光レポーターとして NPY pHluorin を使用します。

メソッドは私たちの手で非常に効率的なそれは主に 2 つのパラメーターに依存するいくつかの変更を必要が?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Upright laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS-SP5	includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamber	Warner instruments	RC-26
Imaging chamber platform	Warner instruments	PH-1
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA
Multichannel perfusion system	Warner instruments	VC-8
Single inline solution heater	Warner instruments	SH-27B
Temperature controller	Warner instruments	TC-324C
Peristaltic Suction pump	Pharmacia	P-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treated	VWR	10861-586
CMRL Medium, no glutamine	ThermoFisher	11530037
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
3 M KCl solution	Sigma	60135
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
Vacuum filter	VWR	431098
D-Glucose	Sigma	G8270
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-aldrich	P6407
Di-8-ANNEP	ThermoFisher	D3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I5879
Forskolin	Sigma	F3917