繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

要約

本研究では、オゾンの高濃度にマウスを繰り返しさらすことによって新しい慢性閉塞性肺疾患 (COPD) の動物モデルが正しく生成について説明します。

要約

慢性閉塞性肺疾患 (COPD) は、永続的な気流制限や肺実質の破壊によって特徴付けられます。それは人口高齢化における発生率が非常に高いです。COPD フォーカスを中心に症状変更薬; 現在の従来の治療法したがって、新しい治療法の開発が急務します。COPD の修飾の動物モデルは基になるメカニズムを特徴付けるために助けることができるし、新しい薬物スクリーニングに使用することができます。リポ多糖 (LPS) など、現在の COPD モデルやブタ膵臓エラスターゼ (PPE)-誘導肺気腫モデル肺と気道における COPD のような病変を生成が、そうでなければ人間 COPD の病因を似ていません。タバコの煙 (CS)-誘導モデルのまま 1 つの最も人気のあるのでそれはだけでなく呼吸器系における COPD のような病変をシミュレートしますが、それは人間の COPD を引き起こす主な有害物質の一つに基づいています。ただし、CS 誘発モデルの時間のかかり、労働集約的な側面は、劇的に新しい創薬スクリーニングへの応用を制限します。この研究では、正常に高濃度のオゾンにマウスを公開することによって新しい COPD モデルを生成しました。このモデルは次を示した: 1) 強制呼気量 25、50、75/強制肺活量の減少 (fev 社₂₅/FVC、fev 社₅₀/FVC と fev 社₇₅/FVC)、肺機能の悪化を示す2) 拡大肺肺胞、肺実質の破壊;3) 削減疲労時間と距離。・ 4) 炎症を増加します。一緒に取られて、これらのデータは、オゾン暴露 (OE) のモデルがオゾン露出オーバーは COPD の病因の要因の一つは、人間に同じような信頼性の高い動物モデルであることを示します。さらに、6-8 週間、OE モデル COPD 研究の良い選択であるかもしれないことを示すタバコの煙モデルを誘発する 3-12 ヶ月を必要とするのに対し、純正モデルを作成する私たちの前の仕事に基づくだけかかった。

概要

それは、COPD、肺気腫と慢性気管支炎を含むかもしれない 2020年^1,2の世界の死の 3 番目の主要な原因をこと推定されています。人口の 40 歳以上の COPD の潜在的な発生率は、男性で 12.7%、次の 40 年の³で女性の 8.3% と推定されます。COPD 患者⁴の進行悪化を逆に現在利用できる薬はありません。COPD の信頼性の高い動物モデルだけでなく病気の病理学的プロセスの模倣の需要、また短い世代期間が必要。LPS または PPE 誘発モデルを含む、現在の COPD モデルは、肺気腫のような症状^5,6を引き起こすことができます。単回投与または LPS または PPE の一週間にわたる課題著明な BALF の血清、プロ炎症性メディエーター (例えばTNF-α や il-1 β) を増加、気管支肺胞洗浄液 (BALF) でマウスやラットの結果を生成する肺実質の破壊拡大の空気のスペースと制限気流^5,6,7,8,9,10。ただし、組合や PPE 人間 COPD の原因ではない、従って¹¹病理学的プロセスを模倣しません。CS 誘起モデルは、永続的な気流制限、肺実質の破壊を生産し、機能的運動能力を削減します。しかし、伝統的な CS プロトコルには、COPD モデル^12,13,14,15を生成するため、少なくとも 3 ヵ月が必要です。したがって、2 つの要件を満たしている新しいより効率的な動物モデルを生成する重要です。

最近では、タバコを吸う、に加えて大気汚染や職業暴露は COPD^16,17,18のより一般的な原因になっています。主要な汚染物質の一つとして、オゾン (ただし大気汚染の主要なコンポーネントではなく)、することができます直接気道反応し、子供や若い大人^{19,20,21 の肺組織の損傷 ,22,23,24,25}。組合、PPE は、CS などその他の刺激と同様に、オゾン、深刻な肺の酸化ストレスや DNA の損傷の生化学的経路に関与しているし、開始と COPD^26,27のプロモーションにリンクしています。別の要因は、オゾン、オゾンが肺機能^18,28,29を破壊できることを示すにさらされた後いくつかの COPD 患者の症状が悪化することです。したがって、我々 は繰り返し 7 週間のオゾンの高濃度にマウスを公開することによって新しい COPD モデルを生成これは気流の欠陥や肺実質損傷前調査^30,31,32のものと同様で起因しました。本研究では雌マウスに OE プロトコルを拡張し、私たち以前研究^30,31,32の雄マウスにみられる肺気腫を再現します。COPD 死亡率は男性で減少したが、多くの国の³³の女性で増加、ためメカニズムの研究と女性の COPD 患者の治療法を開発する女性の COPD モデルが必要です。すべての性別に OE モデルの適用性は、COPD モデルとしての使用にさらにサポートを貸します。

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プロトコル

注:、純正モデルが生成されて、以前に報告された研究 ^{30 , 31 , 32} で使用します。すべての動物実験は機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 上海交通大学によって承認されました

。

1 です。 マウス

1. 家病原体フリー、7-9 週齢女性 BALB/c マウスで動物の個別換気ケージ施設制御温度 (20 ° C) と湿度 (40-60%)。12 h 光と施設で 12 h 暗いサイクルを提供します。食品を提供し、広告自由 水します
。

2。オゾンや大気暴露

1. シール (例えば 風防) アクリル ボックスに電動発電機とオゾンを生成します。内側に、箱の外側に接続されているエアコン通気管を通じて小さな空気送風機を使用して箱から出して空気を吹きます。オゾン プローブを使用してボックスにオゾン濃度を監視します。ボックスでのオゾンの濃度に達するあたり 2.5 部品までを待つ百万 (ppm) です
   。 注: オゾン プローブ オンまたはオフに自動的にオゾン発生器を切り替えることができます、2.5 ppm のボックスにオゾン レベルを維持できます
。
2. は、2.5 ppm のオゾンのレベルに達したら、ボックスにマウスを配置します。オゾンにそれらを公開するたびに 3 h のボックスにマウスを保持します
   。 注: ボックスは自動的にオンまたはオフにオゾン発生器を切り替えることにより 3 h 中に 2.5 ppm のオゾン濃度を維持できるし、箱から出してマウスによって生成される CO ₂ を吹いています
。
3. 7 週間 (3 日に 1 回) 週 2 つのオゾン露出 (3 時間を持続させるそれぞれの暴露) を与える; 同時にそして同じ期間の空気コントロール マウスを公開します
。

3。マイクロ コンピューター断層撮影

1. 7 週の終わりには、pelltobarbitalum natricum の腹腔内注入マウスを麻酔 (1%、0.6 - 0.8 ml/100 g) マウスがないことを確認する個々 の状況に応じて投与量を調整つま先ピンチ。 モニターに対応し、安定した呼吸の頻度でマウスを維持手続き中に自主的な動きがないかどうかを確認します
。
2. マイクロ コンピューター断層撮影 (µCT) の商工会議所に麻酔下のマウスを配置します
。
3. 調整、メーカー標準のプロトコルを使用して µCT ' の指示。X 線管を設置 50 kV と 450 μ A の電流
   。 注: 両方、マウスを中心に x 線と検出器回転します
。
4. µCT 解析を行う 1 つのスライスの 300 ms の露光時間と 0.093 mm スライス厚 0.092 mm 有効画素サイズ 515 予測を取得します
。
5. は、ソフトウェアを使用して取得した画像で肺を再構築します。それぞれ-750 -550 ハンス台で最小値とグレースケールの最大を設定することでグレースケール画像の明るさを調整します
   。 注: ソフトウェアが自動的に肺実質と低吸収域 (LAA) ^{34 , 35} のボリュームを計算します
。
6. LAA ボリューム総肺気量で割ることによって LAA (LAA %) の割合を計算します

。

4 トレッドミル テスト

1. 適応マウスの上実行しているトレッドミル マシン注 10 分間 10 m/分の速度でテストを与える: 電気は、常にオフの手順が実施されている場合。
2. 管理、。マウスに疲労試験。
3. ウォーム アップ 5 分 10 m/分の速度でマウス
1. 15 m/分で 10 分間に速度を上げる
2. 運動強度を高める: 20 m/分、開始 5 m/分まで速度を上げるマウスまで 30 分毎の ³⁶ を実行する続行できません
。
4. 走行距離、距離疲労と疲労時間として時間を実行すると、それぞれの合計を記録します

。

5 肺機能測定

1. pelltobarbitalum natricum の腹腔内注入マウスの麻酔 (1%、0.6 - 0.8 ml/100 g) マウスを見るのは個々 の状況に応じて投与量を調整。つま先のピンチに応答しないと、マウスは自発呼吸。 モニターを維持し、安定した呼吸の頻度でマウスを維持するを待つ手続き中に自主的な動きがないかどうかを確認します
。
2. は慎重にマウスを tracheostomize し、コンピューター制御の人工呼吸器に接続されている体プレチスモ グラフでそれらを配置します
   。 注: 換気、気管内チューブに近位に位置する弁を介して制御されます。セットアップは、準静的圧力ボリュームの演習、高速水流量の演習を含む別の半自動操縦を提供します
。
3. 平均通常呼吸パターンまで圧力制御の換気麻酔下マウスに 150 の呼吸/分の呼吸を課すし、各呼吸サイクルの完全な有効期限を取得します
。
4. プレチスモで生成された負圧を使用して、デバイスと準静的圧力ボリューム操作を実行します
。
5. は、声帯と fev 社を記録する準静的圧容積ループ内で速い流れボリューム操作を実行します。+30 cm H ₂ 肺を膨らませる O およびすぐにその後まで残留量-30 cm H ₂ o ・ レコードで、最初の 25、50、75 ms 呼気 (fev 社 ₂₅ の fev 社は有効期限を設けるに高い負圧に接続、Fev 社 ₅₀、と fev 社 ₇₅、それぞれ)。最適な演習を拒否します。ひとつひとつのマウスと各テストでは、すべての数値パラメーターの信頼できる平均を取得する 3 つの許容される作戦の最低です
。

6。BALF コレクション

1. pelltobarbitalum natricum ターミナル麻酔後 ((1%、1.8 2.4 ml/100 g)、マウスはないつま先ピンチに対応し、息を失うことを参照してくださいに個々 の状況に応じて投与量を調整)、洗浄、2 ml の PBS の 1 mm の気管内チューブと、取得 BALF ¹⁰ を介してマウスします
。
2. 取得した洗浄因数をプール、それら 4 ° C で 250 x g で 10 分間遠心
3. 即座の使用のための上澄みを集め、-80 ° C または液体窒素で残りの部分を格納します
。
4. 診断を使用してセルの合計数をカウントします
。
5. PBS で、スピン (1,400 x g、6 分) 250 μ L のスライド スピンの遠心分離機を使用してスライド上に細胞を再懸濁細胞ペレットを再懸濁します
。
6. 製造業者に従ってスライド細胞適用ライト染色 ' s プロトコル
。
7. マウスあたり 200 セルをカウント; 400 倍の倍率での標準的な形態によるとマクロファージや好中球、セルを識別し、その番号をカウントします
。

7。心臓採血

1. 心臓穿刺による採血、1.5 mL チューブにそれを読み込む、氷上で 30 分間それを維持
2. G × 2,000 と 4 で 5 分間の血液サンプルを遠心分離機 ° C
3. 新しいチューブに上清 (血清) を転送し、-80 ° C または液体窒素で保存します
。
4. Il-1 β の血清を準備 IL-10 ・ TNF α 検出テストのそれぞれの ELISA キットを使用しています
。

8。肺木股

1. マウスから気管、肺を解剖。
   1. 犠牲後すぐに手術のボードの上にそれぞれの euthanized マウスを配置します
   。
   2. 広頸筋を離れて分析と視覚化し、気管軟骨輪をアクセスする前脛骨気管筋
   。
   3. 、胸部を開く空洞。解剖肺と、気管が肺から心臓を区切らないでください
   。
2. PE90 ポリエチレン管を通って 4% パラホルムアルデヒドの入った注射に気管内カテーテルを接続します
   。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。手袋と安全メガネを着用、ヒューム フード内部ソリューションを使用します
。
3. は、気管内カテーテルを 4% パラホルムアルデヒド (10 滴、〜 200 μ L) を使用して完全に肺を膨らませます。インフレの完了後中心部を削除します
。
4. 少なくとも 4 時間のための 4% のパラホルムアルデヒドの 10 mL を含む 15 mL チューブに肺を維持
5. はパラフィンに肺を埋め込みます。回転式ミクロトームで、セクショニング パラフィン ブロックで 5 μ m のセクションを取得します。断面、肺の気管支領域内の最大の表面積を公開します
。
6. 形態計測学的解析、実行ヘマトキシリンとエオシン (H & E) セクションに染色します
。
7. 明るいフィールド正立顕微鏡 (対物レンズ 20 X; 露光時間、1.667 ms) とセクションのイメージします
。
8. がある 2 つの調べ治療プロトコルに目がくらんで組織切片を別々 にカウントします。間肺胞中隔の壁までの距離を測定するためのパラメーターとして平均線形インターセプト (L _m) を使用します。L _m 次の手順を使用してを決定する:
   1. セクションのイメージを Photoshop で開き、5 550 μ m の長い行のイメージにレティクル グリッドを描画します
   。
   2. グリッド線上に肺胞の数をカウントします
   。
   3. は、グリッドの行の長さを肺胞の数で割ることによって L _m を計算します。定量化, 画像のマウスごとの 5 つのセクションを実行します。各セクション (フィールド 1 つのイメージ) の 10 の画像を取得し、ランダムに評価します。フィールド選択中に前方または別の方向に 1 つのフィールドを移動することによって航空・船舶分野を避ける
      。 注: データは、平均 ± S.E.M. として記載して非対応の t 検定は空気にさらされたマウスとマウスのオゾン暴露間の比較を行った。各グループの 3 つの動物は、有意の差の計算に使用されました。P-値 < 0.05 が重要視され
   。

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結果

各グループの 3 D µCT 画像の例としては、図 1に表示されます。オゾン暴露マウスが大きく総肺気量 (図 1と b) と LAA % (図 1c) 空気露出コントロール マウスよりも。肺気量と LAA % に残ったオゾン露出^31,32の 6 週後上昇。LAA ...

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ディスカッション

この研究では、COPD の新しいモデルを生成するための信頼性の高い方法を提案する.この OE モデル (すなわち、 LPS または PPE モデル) の他のモデルと比較して、COPD 患者の病理学的プロセスを繰り返します。タバコの煙は、人間の患者⁴⁰で COPD を引き起こす主な有害物質は、最も人気のある COPD モデル^41,42のまま CS モデルです?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.