その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

要約

ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型特性を決定する使用です。

要約

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。フローサイトメトリーで分析した抗原特異的 T 細胞の MHC テトラマー染色の開発研究し、T 細胞の免疫生物学を理解する当社の能力をもたらしました。フローサイトメトリーは、抗原特異的 T 細胞を他の細胞や組織、および現在の分解技術の構造の空間定位を判断できない量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、T を抽出するセル必要とフローサイトメトリー限られている非リンパ系組織の有効性。その場でMHC テトラマー染色 (IST) は、組織の興味の抗原のために特定が T 細胞を可視化する手法です。免疫組織染色 (IHC) と組み合わせて、IST は、豊かさ、場所、および組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型を決定できます。ここでは、染色し、特定の組織のコンパートメント内にある特定の表現型を持つ抗原特異的 CD8 T 細胞を列挙するプロトコルについて述べる.これらの手順は、李ら、権利によって我々 の最近の出版物で使用した同じ「卵胞は CD8 によって抑制されます部分的にサル免疫不全ウイルス産生細胞細胞の⁺ In Vivo。」説明する方法は、彼らは、表現型のローカライズに使用することができ、本質的に、抗原特異的 CD8 T 細胞 MHC テトラマーは任意の組織で利用可能なを定量化に広範に適用されます。

概要

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。ペプチド/MHC のクラス I のテトラマー CD8 T 細胞の抗原特異的染色¹と MHC クラス II 四量体染色の CD4 T 細胞²のフローサイトメトリーによる最近の開発研究し、理解する当社の能力に革命をもたらしました、T 細胞の免疫生物学。量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、他の細胞や組織、現在構造に抗原特異的 T 細胞の空間定位の検出でフローサイトメトリーは、します。T 細胞を抽出する分解テクニック必要フローサイトメトリー限られている非リンパ系組織³で有効性。

私たちと他の人は私とクラス II 四量体や多量体試薬ペプチド負荷 MHC のクラスを使用して組織^4,5,6,7,抗原特異的 CD8 および CD4 T 細胞を染色する方法を開発しました。^{8,9,10,11,12,13}。 これら IST メソッドの場所、豊富、と組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型の定量を可能にすると、他の細胞や組織の構造を基準にしてこれらの細胞を検出する手段を提供します。当社グループは、広く MHC を使用います-私四量体でひと免疫不全ウイルス (HIV) - とサル免疫不全ウイルス (SIV) - 染色 HIV と SIV の免疫病態の理解を得るためにリンパ、生殖器、直腸の組織における特定の CD8 T 細胞成功した予防接種戦略^14,15,16,17の関連要因を識別します。さらに、組織と生体内でエフェクタ-ターゲット レベルを決定する我々 はもイストを組み合わせたものの in situハイブリダイゼーション (っぽい) をローカライズし、ウイルス特異的 cd8 陽性 T 細胞、ウイルス感染細胞を定量化する技術を開発しました。^18,19。

ここでは、用いたペプチド負荷プロトコルについて述べる-私テトラマー IHC を使用して対比染色組織に新鮮な組織切片の抗原特異的 CD8 T 細胞を染色して特定の組織コンパートメントにおける特定の表現型と細胞を定量化します。これらの手順は、李ら、慢性 SIV 感染サル²⁰時、場所、豊富とリンパ組織における SIV 特異的 T 細胞の表現型を決定私たちによる私たちの最近の出版物で使用されたと同じです。

この手順では、新鮮な組織を断面し、ペプチド負荷 MHC で夜通し孵化-私テトラマー共役フルオレセイン チオシアン酸分子 (FITC)。彼らは、パラホルムアルデヒドで固定されます。組織を固定した後は、ウサギ抗 FITC 抗体を使用し、さらにバインドされたテトラマーからの信号を増幅、蛍光タグの抗うさぎ IgG 抗体とインキュベート MHC テトラマーからの信号は増幅されます。IHC は、抗原特異的 T 細胞と周囲の細胞を特徴付ける IST と組み合わせて使用です。細胞外空間、細胞表面上のエピトープを認識する抗体は、テトラマーとプライマリの孵化に含まれます。細胞エピトープを認識する抗体染色前に細胞壁の透過性が必要です。染色組織切片を共焦点顕微鏡を用いたイメージングが行い共焦点ソフトウェアを使用しています。ラベル付きセルは、共焦点顕微鏡によるソフトウェアや ImageJ を用いた定量化しました。どの MHC の本質的に抗原特異的 CD8 T の任意のセルの任意の組織を染色する記述のプロトコルを使用できます-私テトラマーがあります。

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プロトコル

1 です。 一日 1: 新鮮なティッシュの区分と主なインキュベーション

1. 使用メス小 (約 0.5 センチ幅 0.5 cm 背の高い) 部分に新しいティッシュをカットします。別にプランジャーを各組織を接着し、4% 低溶解アガロースの 3-5 mL の PBS に埋め込みます。ステッカーを使用して組織情報にプランジャーをラベルします。固めるため氷バケットにチルド ホルダーに入れています
。
2. ミクロトームとインストール ミクロトームと挿入ピストンにかみそりの刃は、200 μ m にセクションの厚さはティッシュ ミクロトーム風呂でマウント セットを有効にします
。
3. は、RNA を維持するために、潜在的なっぽいアプリケーション下流を許可する pbs 100 μ g/mL または 18.7 U/mL のヘパリンを追加してリン酸緩衝生理食塩水 (PBS H) とを準備します。埋め込まれた組織は、チルド、滅菌 PBS H の 100-120 mL をカバー、ミクロトーム風呂します。0 - で温度を維持するためにお風呂に PBS H アイス キューブを追加 2 ° c. の開始ミクロトームとカット 200 μ m のセクションに組織します
   。 注: 組織内で細胞の活動を最小限に抑えるため氷の上冷蔵組織を維持することが重要だ、新鮮な組織は、冷やされてセクションに簡単に。下流 ISH のための計画がない場合に単独で PBS を使用できます
。
4. (例えば 腸と肺)、ミクロトームでうまく切れない組織として細い短冊状に組織を切断するメスや剃刀の刃を使用して、または、200 μ m まで可能な限り近い
。
5. 実験的サンプル情報 24 ウェル培養プレートの蓋のラベルし、対応する井戸における組織室を配置します。セクションを組織の商工会議所に転送するペイント ブラシ セット 1 mL を含む 24 ウェル培養プレートの井戸に使う冷蔵 PBS H.
   注: 再利用可能な組織のチャンバーは染色を開始する前にすべきであります。組織 14 mL ポリプロピレン製丸底スナップ キャップ チューブを使用して行うことができ、ワイヤー メッシュ。14 mL ポリプロピレン製丸底スナップ キャップ チューブの下部を切断するのに鋭いかみそりの刃を使用します。管の下部にある穴に合わせて輪にワイヤー メッシュをカットします。熱赤熱するまでにブンゼン バーナーを使ってワイヤ メッシュ サークル。非常に迅速にワイヤー メッシュ丸を設定し、メッシュにチューブをプッシュします。ワイヤー メッシュをチューブの底にしっかりと接続するか、慎重に鋭いかみそりの刃を使用して、3 mL マーク チューブの上部を切断し、確認してください。各組織の商工会議所または最大 1 cm ² あたりも組織の組織切片を最大 3 を置きます。交差汚染を避けるために異なる抗体併用井戸間少なくとも 1 つの空井戸を維持します
。 プライマリ
6. 進む四量体と抗体の組織の部屋にすべてカット セクションの転送を終えた後すぐに染色します。浸漬し、すべての回で 1 ml の PBS H 冷蔵セクションを維持します
。
7. インキュベート 0.5 μ G/ml の FITC 結合、ペプチド負荷の MHC と一晩ティッシュ セクション-私テトラマー 2% ヤギ血清 (NGS) で H PBS で希釈します。マウスまたはウサギ以外がこの培養に興味の細胞外の抗原に抗体が含まれます (例えば ラット抗 CD8 抗体希釈 2% PBS H でレバレッジ NGS)。各ウェルに 1 mL の希釈した抗体を配置します
   。 注: いくつかを強化することができ、T 細胞受容体 ^{4 , 21} にバインド MHC テトラマーを抑制することがいくつか CD8 抗体を選択するときは、注意をすべき。ここで説明したラット抗 CD8 抗体は不安定なので、場合によってはやや弱い染色結果します。それは唯一の非-ウサギ、マウス非 CD8 抗体テストそのステンド グラス アカゲザル マカクザル CD8 T 細胞をラベル付けトリプル使用します
。
8. 一次抗体とそれ以降のすべての孵化、ウェルあたり溶液 1 mL を使用し、このそのロッキング プラットフォーム上のプレートの 4 ° C ですべての後続孵化します
   。 注: 組織は、商工会議所で自由にフロートする必要があります
。

2。2 日目: 固定および二次培養

1. 主なインキュベーション後洗って 1 mL で 2 回 20 分冷やした PBS H 部各洗浄。組織の部屋を対応する井戸で冷やした PBS H の 1 mL を含む異なる 24 ウェル培養プレートに転送することによってこれを行うにします
   。 注: 組織の部屋間を移動するとき別のものに 1 つの実験試料から内容を流れないように気をつけてください。すべての後続の孵化および洗浄、同様に組織のチャンバーを適切なソリューションを含むきれいなプレートに転送します。節に立ち往生が組織の部屋の側面にしていないことを確認する手順の中に組織の部屋でセクションを監視しなければなりません。彼らは戻ってソリューションにそれらをプッシュ、場合
。
2. は、室温で 2 時間の新鮮な PBS バッファー 4% パラホルムアルデヒドの ml の 1 セクションを修正 (過剰修正しない)。5 分間 2 回冷 PBS h 洗浄
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します
   。 注: 抗原検索、透過は、細胞内の抗原を検出する必要がある場合抗原によって取得できますパラホルムアルデヒドの固定後 0.01 mol の尿素のセクションを沸騰します
。
3. は 0.01 mol の尿素を含む 24 ウェル培養皿にセクションを転送し、電子レンジでこれらのプレートを配置します。3 回約 10 のセクションを沸騰 s ごとに、合計 30 s.
   注: 非常に注意して、沸騰としてソリューションは井戸の断面を強制的ことができます。このような場合かをプッシュするセクション組織チャンバーの側面からプレートの蓋から戻って適切な組織チャンバーの底に絵筆を使用します
。 二次抗体の孵化する前に
4. を permeabilize し、ブロッキング溶液 2%、0.3% 洗剤 (PBS H T) PBS H にそれらをインキュベートしティッシュ セクションをブロック 4 ° C とその後抗体の孵化を実行で 1 時間ロッカーに NGSPBS-H-T/2% NGS
。
5. 二次培養組織チャンバー内のセクションを PBS-H-T/2% NGS でウサギ抗 FITC 抗体希釈 1: 10,000 を含んでいる井戸に転送します。一晩インキュベートします
。
6. 実行 counterstaining を用いたマウス抗 CD20 抗体希釈 1: 200 PBS-H-T/2% NGS で。必要なら、このオプションのエピトープを取得、細胞に浸透、前述のようにこの培養する前にブロックします
。

3。3 日目: 第三紀インキュベーション

2 番目の培養後 3 回、少なくとも 20 分のための 4 ° C で PBS H 内のセクションを洗う

1. は、蛍光標識抗体 (例えば ヤギ抗うさぎ共役の緑がかった黄色、ヤギ抗ラット共役遠赤色染料、およびヤギ抗マウス共役緑色素抗体希釈 1:5, 000、適切な最終的なインキュベーションを実行します。1:5, 000 と 1:2, 000 PBS-H-T/2% NGS でそれぞれ)。一晩インキュベートします
   。 注: この時点で、孵化の延長が可能 3 日間必要な場合。このインキュ中にスズ箔のプレートをラップすることによって光から保護されたセクションを維持します。マリファナのステップとその後、光消光 fluorophores
。

4。4 日目: マウント セクション

1. 洗浄セクション 3 回で少なくとも 20 分 PBS h
   注: 下流っぽい ¹⁹ の計画、テトラマーと場所で抗体を確保し 5 分 PBS H で二回セクションを洗う 1 h の 4% のパラホルムアルデヒドのセクションを修正します
   。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します
。
2. は、顕微鏡のスライドにセクションを転送するのに絵筆を使用します。あまりにも多くの組織を突くをつけてください。グリセリン/ゼラチン 4 mg/mL n-プロピルガ レートまたは fluorophore 防腐剤が含まれている別のマウント媒体含むで各セクションをコートします。観察でカバーします
。
3. -20 の光保護スライド容器でスライドを保存する ° c. 組織培養プレートを洗浄し、アルコールを使用して蓋のラベルを削除します
   。 注: プレートは再利用することができます
。

5。共焦点顕微鏡画像の取得

1. ( 図 1 a と B) 各 fluorophore の適切なレーザーとフィルターを使用して、共焦点顕微鏡を用いた高解像度画像をキャプチャします
   。 注: この例では、共焦点顕微鏡が使用された (材料の表 を参照してください)。画像は、緑がかった黄色標識抗原特異的 T 細胞、グリーン ラベルの CD20 を表現する B 細胞の 10% の電力で 488 nm レーザーまで赤札 CD8 T 細胞の 15% の電力で 640 nm レーザーの 20% の電力で 561 nm のレーザーを使用して収集されました。客観的かつ開口 0.8 X 20 が使用された
。
2. は、順番に複数の 800 x 800 ピクセル フィールドで 3 つのチャンネルで z-シリーズ 3 μ m (または他の) 間隔を収集します。収集されたフィールドのモンタージュを作成 ( 図 1 -E)。対応するスライドの情報に基づいて各モンタージュ画像を名前を付けて解析します
。
3. それぞれの共焦点顕微鏡分析・数量化ソフトウェアを使用してまたは ImageJ を用いた定量的画像解析を実行します
。

6。定量的画像解析

注: 共焦点の顕微鏡分析・数量化ソフトウェアを使用して、定量的画像解析を行うことができますまたは ImageJ ソフトウェアを使用しています。ここでは、ImageJ は例として使用された

。 ImageJ の] ウィンドウ ( 図 2 a) にドラッグすることによって

1. オープン共にモンタージュ
   。 注: ImageJ 直接多くの異なる共焦点顕微鏡によって収集されたモンタージュを開くことができます。モンタージュは、ImageJ で直接開くことができません、それを開くには TIFF ファイルとしてエクスポートして選択した z スキャン
2. 分析のため選択した z スキャンを複製 (" 画像 "-> " を複製する ") ( 図 2 b).
3. 別のチャンネルに分割 (" 画像 "-> " 色 "-> " チャンネルの分割 ") ( 図 2).
4. と押すことによって ROI マネージャーに追加対応するチャネルでの定量分析のための投資収益率の描画 " T " キーボード上。面積を測定します
   。 注: ImageJ の ROI マネージャー μ m ² ( 図 2 D) の領域を示しています
。
5. 蛍光明るさと分析するチャンネルのコントラスト調整 (" 画像 "-> " 調整 "-> " 明るさ/コントラスト ") ( 図 2 e).
6. 画像の ROI を平らにする (" ROI マネージャー "-> " フラット ") ( 図 2 f).
7. 画像で陽性細胞を定量化、" 多点 " ツール ( 図 2).

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結果

図 1は、共焦点顕微鏡を用いた共焦点画像を収集する方法を示します。図 2は、ImageJ を用いた定量的画像解析を示しています。図 3と4 SIV からリンパ節組織の画像感染アカゲザル MHC テトラマー、CD8 抗体、CD20 抗体で染色代表を示すし、MHC テトラマー染色の特異性を示すためになります。

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ディスカッション

IHC と組み合わせて IST は、検出、特性評価、および他の細胞や組織構造のコンテキストでネイティブ環境での抗原特異的 CD8 T 細胞の定量化のために不可欠なツールを提供します。ここでは、イストの IHC、定量的画像解析に続いての場所、豊富とアカゲザルからリンパ節における抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型を決定するために結合用の詳細な手順を説明します。ヒトに応用マウス、またはど?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MHC-I monomer	NIH tetramer core facility		Materials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITC	Sigma-Aldrich	E2716	Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Low melt agarose	Promega	V3121
Heparin	Sigma-Aldrich	SLBL6391V
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-6878
Urea	J.T.Baker	4204-05
Glycerol gelatin	Sigma-Aldrich	SLBH2672V
n-propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130
rat-a-h-CD8 (1:500)	Acris	0714	Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500)	NOVOCASTRA	6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)	Vector	6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000)	Jackson Immunoresearch	124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)	Jackson Immunoresearch	106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)	Jackson Immunoresearch	118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)	Jackson Immunoresearch	86579
Compresstome: VF-300 Microtome	Precisionary Instruments, LLC	1079
Quick Set Instant Adhesive	Loctite	46551
24-well flat bottomed tissue culture plates	Falcon	353226
Microscope slide	Globe scienfitic Inc.	#1321
Razor  blade	Ted Pella, Inc	121-6
Feather Disposable Scalpel	FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.	No. 21
Round paintbrush #2	PRINCETON ART & BRUSH CO.	4350R	Can trim as needed with razor
Confocal Microscope	Olympus	FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0	Olympus