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要約

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA 式システムを使用して、細胞間相互作用を調査する方法について説明します。

要約

セルには、異なる形態と複雑な解剖学的関係が表示されます。細胞彼らの隣人との対話の方法相互作用は細胞のタイプ間または特定の種類の内であっても異なる?彼らは空間のルールの種類が従うか。このような基本的な質問体内への回答は、これまでのところ高解像度 1 つのセルのラベルのためのツールの欠如によって妨げられています。ここでは、多色 FlpOut (MCFO) を用いた単一細胞をターゲットに詳細なプロトコルを提供しています。このメソッドは、3 つ異なるタグ記者 (HA、旗、V5) UA 制御の下で 2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターで静かに保管されているに依存します。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する熱衝撃波の Flp リコンビナーゼの発現を誘導する: 式は、GAL4 ドライバーを表すセルでのみ発生します。これは、高解像度で個々 の細胞の形態の可視化を可能にする特定の細胞型の別様に着色されたセルの配列に します。例として、MCFO 技術は大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を視覚化するための特定のグリア GAL4 ドライバーと組み合わせることができます。

概要

グリア細胞、神経系 (NS) の非神経細胞集団はニューロンの静的なフレームワークを提供するために長い間信じられていた、したがって詳細に至りませんでした。ただし、ヒトでは、グリアは NS (~ 90%) のセルの大部分を構成する、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、シュワン細胞を含むいくつかの異なるカテゴリに分類されます。ショウジョウバエグリアは、NS で細胞の約 10% を構成します。興味を持って、その形態と機能が脊椎動物1,2で見つけられるそれらに非常に類似します。その形態には、血液脳関門 (BBB) アストロ サイト様細胞、神経鞘、上皮形成が含まれます。

ショウジョウバエ中枢神経系 (CNS) は次の主構造体で構成されています:; 神経細胞の細胞体を含む皮質領域ハーバーのシナプス接続 neuropils接続別 neuropiles; 小規模および大規模な軸索路(図 1) 中枢神経系と感覚器官や筋肉を接続する末梢神経。すべてのこれらの解剖学的構造に関連付けられているグリア細胞が見つかった: 皮質領域、アストロ サイトのようなグリア細胞 (ALG), 脊髄グリア細胞 (EG) 構造の領域、脊髄グリア細胞の皮質グリア (CG) は中央軸索路と周辺機器に関連付けられているも神経 (EGN)、そして最後に、グリア細胞シートのような 2 つ、perineurial グリア (PG) と subperineurial (SPG)、これは一緒に全体の NS (図 2) をカバーする連続した層を形成します。

前の研究は、そのグリアを示されている; NS の開発に重要な役割を果たすインスリン様ペプチドを全身循環に反応して神経細胞の数を監視、ニューロン、グリア-ニューロン乳酸シャトルなどに栄養サポートを提供して貪食3,4で死にかけている神経細胞を排除,5,6成熟した NS でグリア BBB を維持、神経伝達物質を取るとイオンの恒常性を維持、マクロファージできません、BBB に違反し、動物の行動の6と同様、シナプスの活性を調節するので、NS で主要な免疫細胞として機能。,7,8,9,10,11。

グリア細胞のサブタイプが異なるが特殊な機能を実行するかどうか重要な未解決の問題に残る。ただし、成体における特にグリア細胞の体系的なゲノム解析は、その操作に対応する遺伝的ツールの欠如によって妨げられています。ここでは、複雑な細胞間相互作用を研究するセル形状の効率的かつ簡単な評価を可能にする手法を提案します。この手法は、大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を特徴付けるに適用されていますが、ニューロン12,13 を研究に使用される特定の GAL4 ドライバー、に応じて合わせることができます。、混ざり細胞と原則としていかなる任意の発達段階内の任意組織。

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プロトコル

1。 多色 FlpOut (MCFO) 実験用のハエの準備

注:、MCFO 技術と呼ばれる Flp を介した停止カセット切除 (FlpOut) の修正バージョンを指します。MCFO ハエの遺伝子を運ぶ熱ショック プロモーター (hsp)-Flp リコンビナーゼや UA の下で別の記者を制御します。各レポーターから成っているエピトープ タグを 10 枚でにおける (myr) スーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) の共通バックボーン (e.g。、HA、旗または V5) が挿入されています。結果の非蛍光性タンパク質は、名前付き " スパゲッティ モンスター受けた " (smGFPs) 14 と異なるエピトープ タグに対して特定の抗体を使用して検出することができます

。
  1. クロス MCFO カセットと hsp Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) (材料表参照) 適切なグリア GAL4 ドライバー行へ飛ぶ.
    1. Hsp が 25 ° C でアクティブになって、いくつかの細胞が非特異的ラベル付けにつながる再結合を受ける可能性がありますは、水漏れしたため、システムを避けるために 18 ° C の交点を設定します。F1 世代を取得する 18 の ° C で約 20 日間を待ちます。熱後 (手順 2 を参照) に衝撃を与える、25 ° C ( 図 3) でハエを維持します
      2. 。

2。衝撃を熱

注: 挿入部位によって hsp Flp の効率は異なります; したがって、最適な熱衝撃時間が最適化するようにしました。このプロトコルでは、hsp Flp が X 染色体に挿入された MCFO フライのストックが使われています (材料の表 を参照してください).

  1. 転送の子孫ステップ 1.1 十字架 (F1 世代ハエ、3-4 日古い) 食品と熱を含む新しいバイアルには、37 の ° C の水浴中で彼らを驚かせた
    。 注: 若いハエ (1-2 日古い)、熱衝撃に非常に敏感。1 または 2 の治療による死亡率を減らすためにヒート ショックを実行する前より多くの日を待ちます。F1 世代のいくつかは熱ショックなしのコントロールとして飛ぶ使用します
    2. 。
  2. 熱ショック時のストレスによる死亡率を減少させるために食物と一緒に普通のバイアルにハエを維持します。女性と男性、別のバイアル
    3. 。
  3. 均一熱ショックのように水に全体のバイアルを浸すことを確認してください。適切な出発点として多く GAL4 ドライバー行とグリア細胞の疎ラベルに 5-8 分ショックを使用します。ショック期間に各ドライバーおよび実験 (短いまたは長い熱衝撃時間が必要になる場合があります) の最適化しなければなりません
    4. 。
  4. 熱衝撃から回復するハエを許可するために数分間ベンチに水平にバイアルを置く熱ショック後
    。 注: バイアルを変更する必要はありません
    5. 。
  5. 25 ° C でハエを維持し、解剖 (手順 3 と 4 を参照してください) に最適な記者式の熱ショック後の日が 2 以上
    6. 。

3。解剖準備およびソリューション

  1. 、解剖の日は、20% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 %pfa 解を得るための 20 μ L で S2 細胞培養液 180 μ L を混合することによって 200 μ L の PCR チューブに新鮮な固定液を準備します。前に、解剖中に氷の上固定液を維持します
    。 注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります
    。 注: を混ぜて 2% 溶液の代わりに 4 %pfa ソリューションを準備する 200 μ L の PCR チューブで 20% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 μ L 160 μ L の S2 細胞培養培地
    2. 。
  2. 最適な染色結果最大管あたり 8-10 脳の遺伝子ごとの 1 つの PCR チューブを使用します
    3. 。
  3. ソリューションを洗う大人の脳の準備: 0.5% 0.5% ウシ血清アルブミン PBS でトリトン X-100
    。 注: 染色液 1% トリトン X-100 を必要ことがあります。トリトン X-100 の高濃度増加抗体の組織への浸透と、深い組織 (大人の ショウジョウバエ 脳におけるシナプス領域 など) の内側にある染色領域する必要がある
    4. 。
  4. ブロック ソリューションを準備: 3% ヤギ血清, 3% 通常ロバ血清と 0.5 %pbs でトリトン X-100
    5. 。
  5. 洗浄ソリューションとブロッキング液成人の脳を数週間の 4 ° C で保存ことができます
    6. 。
  6. 氷の上の深いうつ病井戸ガラス板を置くし、フィル各次のソリューションとも: pbs と S2 細胞培養培地使用の 70% エタノール 1 つ
    7. 。

4。大人の脳解剖

  1. 3 cm の皿を解剖顕微鏡のステージ上の位置し、冷たい S2 細胞培養培地でそれを埋めます。解剖手順中に組織が健康な状態であることを確認するこの中にすべての解剖を実施します
    。 注: ブラック シリコーン (イメージ) で良い背景のコントラストを提供する複数のミリメートルと並んで解剖皿を使用し、解剖時に鉗子を保持します
    2. 。
  2. CO 2 と目的遺伝子型のハエを麻酔します
    3. 。
  3. 鉗子、翼で飛ぶをつかむ 30 の冷たい 70% エタノールで洗うと s 追加 30 冷 PBS とし、s.
  4. S2 細胞培養液で満たされている井戸の深い不況に、フライを転送します
    5. 。
  5. 同じ遺伝子型のすべてのハエについて同じ手順を繰り返します、解剖、組織を保持するまで冷たい S2 細胞培養培地でそれらを維持します
    。 注: 麻酔だけで S2 セル培地の培養時間が長く約 30 分の時間内に解剖することができますハエの数はティッシュを傷つけることがあります
    6. 。
  6. 鉗子でハエをつかむし、顕微鏡下で S2 細胞培養培地でその場が水没します
    7. 。
  7. は、体の残りの部分から頭をデタッチします。体を破棄し、S2 細胞培養液中に浸漬頭を維持します。解離の全体の持続期間のための鉗子で頭を保持するために非常に重要です。組織を損傷することがなく取得することは困難であろう頭にフロートする起動する場合
    8. 。
  8. は、すべての回で、少なくとも 1 つの鉗子で頭を押しながら 1 つ目を引いて、郭清を開始します。鉗子の先端は避けるために網膜のすぐ下の損傷の下に組織されていることを確認します。もう片方の目を抜くし、脳が表示されるまでにキューティクルを削除を開始します
    9. 。
  9. は、すべての気管組織と脳の周りの表皮組織がきれいに表示されますまでを削除します。最適な染色結果を得る脳の周りのすべての気管組織を削除することを確認します。組織は固定し、染色する準備が整いました
    10. 。
  10. タイム固定ステップするために PFA ソリューションに転送する前に冷たい S2 解剖脳細胞の培維持します
    11. 。

5。大人の脳の染色

< ol>
  • は、室温 (RT) で PFA ソリューションに P10 ピペットと分離脳を転送します。組織の損傷を避けるためには、鉗子を郭清後脳を転送するため使用しないでください。200 μ L PCR チューブ、nutator ですべての手順を実行します
    • 。
  • の手順をすべて P200 ピペットと古いソリューションを破棄する前にチューブの底に解決する脳を可能。組織を吸引せず、上澄みを削除してください。露光量から組織を保護します
    • 。
  • 修正 2% の 200 μ L で脳 S2 細胞培養培地の 1 時間または 4% PFA PFA 30 分。再現性を高めるためにサンプル間同じ固定にしてください
    • 。
  • 3 (またはそれ以上) を洗う洗浄ソリューションでは、成人の脳の 200 μ L で 15 分の後は、30 分間ソリューションをブロックの 200 μ L で組織をブロックします。解決を妨げるの長い培養時間可能です
    • 。
  • 200 μ L の総ボリュームで大人洗脳ソリューションで希釈した一次抗体と脳が 4 ° C で一晩加温
    。 注: インキュベーション時間は、使用される抗体の種類によって異なる場合があります。長い孵化必要があります。
    1. 3 MCFO マーカーのラベルは、アンチの頭脳を孵化させなさい-HA (1: 500)、反フラグ (DYKDDDDK epitope) (1: 100) と反 V5 一次抗体
      2. 。
    2. プライマリ直接された抗体は通常プライマリ + セカンダリの組み合わせの代わりにされる可能性があります (e.g。、反-V5:DyLight 549 (レバレッジ))。この場合、二次抗体と直接標識抗体を処理します
      。 注: 各遺伝子型の染色の特異性を確認するためのコントロールとして、いくつかの脳をしてください。一次抗体の孵化をスキップし、次の手順に進みます
      3. 。
  • 洗浄ソリューション (ステップ 3.3) 成人の脳の 200 μ L で 3 回 1 h の組織を洗うし、洗濯ソリューション一晩 4 で大人の脳で希釈した二次蛍光体の抱合体/プライマリ直接共役抗体とそれらを孵化° C、200 μ L の総ボリュームで常温では、4 h
    注: 適切な抗体の例: AlexaFluor 488 (1: 250) 反-V5:DyLight 549 (レバレッジ) と DyLight (1: 100) 647-標識抗体
    • 。
  • の 1 h アダルト洗脳で 200 μ L の PBS 一晩で 4 ° C または RT で 1-2 時間の最終的な洗浄に続いて、ソリューションの 200 μ L で 3 回脳を洗う; PBS の最終的な洗浄ステップ トリトン X-100 の痕跡を削除し、必要があります。最適な染色結果。ガラス coverslips に耐フェード エージェントでメディアをマウントで脳をマウントします
    • 。

    6。脳のイメージング用マウント

    はさみを使用して適切なサイズに
    1. トリム イメージングのスペーサー。高分解能顕微鏡の 2 つのガラス coverslips 間標本とイメージングのスペーサーをサンドイッチします
      。 注: イメージング スペーサーは薄い (0.12 mm 厚) 供試体圧縮なしの実装可能皮およびガラス coverslips または顕微鏡のスライドする棒を接着スペーサー
      2. 。
    2. 使用鉗子は 1 つの表面から接着性ライナーを取り外してガラス カバーガラス (22 mm × 60 mm) の表面にスペーサー、ダウン、接着面を適用します。メディアをマウントの 10 μ L を新しいガラス基板に適用します
      3. 。
    3. で、P10 のピペットは、メディアをマウントの横にある、coverslip に 200 μ L 管から脳を転送します。一緒に組織ソリューションで脳を維持するためにいくつかの PBS を転送します
      4. 。
    4. で、P10 のピペットは、PBS の量を制限しようとすると、メディアをマウントのドロップに PBS から脳を移動します。イメージングのスペーサーと coverslip でメディアをマウントで標本を転送します。見本をカバーするのに十分なメディアをマウントを使用します
      5. 。
    5. は、スペーサーの上から他の接着性ライナーを取り外して、標本上にガラス基板を追加します。鉗子の先端でシール接着領域の上穏やかな圧力を適用します。すぐにマウントされている組織を画像または後で分析のための-20 ° C でスライドを保存します
      6. 。

    7。画像取得

    1. 40 X を用いた共焦点顕微鏡共焦点蛍光画像の取得スタック (NA = 1.2、水浸漬) 目的または 63 X (NA = 1.4、オイルの液浸) 目的 (ピクセル サイズ = 1,024 x 1,024 xy 平面で共焦点の 2 つのセクション間の距離 = 0.5 μ m)。検出器ゲインとない飽和ピクセルとピクセル値は、画像内に存在するように各チャネルのオフセットを調整します。これは情報の損失を回避し、検出器のダイナミック レンジの使用を保証します
      。 注: 3 D イメージングは時間がかかるため、測定値は別の場所で同時に複数のサンプルをスキャンすることによって自動化できます。水浸対物レンズで蒸発を防ぐには、屈折率 n と特別な油浸漬媒体を使用して = 1.33
      2. 。
    2. チャネル色相と輝度の調整に変更、最大密度予測の共焦点スタックを処理し、標準的な画像解析ソフトウェアを使用して対照的 (材料の表 を参照してください).

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    結果

    このセクションでは、大人のショウジョウバエ脳における MCFO 技術を使用して得られる結果の例を示しています。メソッドの概略図を図 3に示します。3 異なる膜タグ記者 (myr smGFP HA、myr smGFP フラグ myr smGFP V5) UA コントロールの下で、2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターが黙っていた。熱衝撃パルスは...

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    ディスカッション

    このプロトコルでは、高解像度で興味の組織内の別のセル型の形態を研究する簡単で効率的な方法について説明します。MCFO を用いた異なるエピトープ タグで複数の記者は多色確率ラベル (図 2) の組み合わせで使用されます。Brainbow/Flybow15,16,17などの他のメソッドと同様に、MCFO よりラベル多様化マ?...

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    開示事項

    作者は、競合または競合する興味を持ちます。

    謝辞

    著者は、アルニム Jenett、Aljoscha ナーンサイ、アドバイスのルービン研究室の他のメンバーと未発表試薬および共焦点画像を生成するため Janelia 飛ぶ光プロジェクト チームの共有をありがちましょう。著者も原稿のコメントをガリア研究室のメンバーに感謝します。

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    資料

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Water bathGrantGD100
    PCR tubesSarstedt72.737.002
    ForcepsDumont11251-20
    Dissecting dish 30 mm x 12 mmmElectron Microscopy Sciences70543-30Glass dissection dish
    Pyrex 3 Depression Glass Spot PlateCorning7223-34Glass dissection plates
    Sylgard BlackSYLGARD, Sigma-Aldrich805998home made with charcoal
    ExpressFive S2 cell culture mediumInvitrogen10486-025
    20% PFAElectron Microscopy Sciences15713
    Triton X-100Roth3051.3
    Normal goat serumJackson Laboratories005-000-121
    Normal donkey serumJackson Laboratories017-000-121
    Bovine Serum AlbuminSigmaA9647
    Rabbit HA-tagCell SignalingC29F4Primary antibody, dilution 1:500
    Rat FLAG-tagNovus BiologicalsNBP1-06712Primary antibody, dilution 1:100
    Mouse V5-tag:DyLight 549AdSerotec0411Conjugated antibody, dilution 1:200
    anti-rabbit AlexaFluor 488InvitrogenA11034Secondary antibody, dilution 1:250
    anti-rat DyLight 647Jackson Laboratories712-605-153Secondary antibody, dilution 1:100
    Vecta ShieldVector LaboratoriesH-1000
    SlowFate GoldInvitrogenS36937
    Secure Seal SpacerGrace BiolabsContact company for ordering
    Microscope cover glass 22 X 60 mmMarienfeld101152
    Microscope cover glass 22 x 22 mmRothH874
    Stereo Microscope, Leica MZ6Leica
    Confocal laser scanning microscope LSM710Zeiss
    ImmersolZeiss518 FImmersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
    ImmersolZeissW 2010Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
    R56F03-GAL4 (EG)Bloomington Stock Center39157GAL4 driver
    R86E01-GAL4 (ALG)Bloomington Stock Center45914GAL4 driver
    hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5Bloomington Stock Center64085UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
    Fiji (Image J)Image analysis software
    Multi Time MacroZeissSoftware for automated scanning

    参考文献

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    128 FlpOut MCFO GAL4 UAS

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