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要約

手足の注意深い調整を要求される自然主義的な環境での複雑な運動には、頭頂の皮質の領域が含まれます。次のプロトコルでは、歩行の猫の記憶誘導性障害物回避の頭頂領域 5 の役割を示す可逆冷却誘起非アクティブ化の使用について説明します。

要約

複雑な自然の地形に急速に回避のため歩行運動を調整する環境障害に関する感覚の情報を使用できます。たとえば、猫の差し迫った障害の視覚については回避のためのステップ調節することが。運動適応ビジョンの独立したまた場合が発生、予想される障害物の脚に突然触覚入力回避のためすべての 4 つの足のステップを変更できます、します。このような複雑な運動の調整には、棘上構造、頭頂連合野などが含まれます。このプロトコルでは、猫の記憶誘導性障害物歩行へ頭頂連合野の貢献を評価するために、冷却誘起可逆的皮質非アクティブ化の使用について説明します。小さな冷却ループ、cryoloops、として知られているは、あからさまな行動への貢献を評価する離散領域を非アクティブ化する特殊形状します。このような方法は、猫の記憶誘導性障害物回避の頭頂領域 5 の役割を明らかに使用されています。

概要

自然主義的なでこぼこの地形で、ビジョンやタッチを介して得ることができる、障害に関する感覚の情報は急速に回避のため歩行を変更できます。ステッピング運動のこの慎重に調整を含む複数の皮質領域1,2。たとえば、運動野3,4と頭頂連合野5,6、7のエリアは障害物回避などの複雑な運動の中に関与しています。四足動物の障害物回避に必要なステップの変調は、前脚と後ろ脚の両方に拡張する必要があります。ガイドに、メモリ内に保持障害に関する情報が使用されます (これは、動物が獲物をストーカーする複雑な自然環境を慎重にトレッドを生じることがあります) 前脚と脚の障害物除去の前方移動が遅れた場合一度歩行障害をステップ オーバー後ろ足を再開します。

記憶誘導性障害物歩行への皮質の貢献を研究する別々 の皮質領域を非アクティブ化することを目的と実験技術を使用できます。冷却誘起皮質非アクティブ化は、あからさまな行動8への皮質の貢献を評価するためリバーシブル、信頼性と再現性のある方法を提供します。ステンレス鋼チューブから作られた Cryoloops の興味の皮質領域に特定遺伝子座の高選択的および離散非アクティブ化を確保する整形します。一度注入、冷やしたメタノール、cryoloop のルーメンを通して励起冷却するループの下に直接皮質の地域 < 20 ° Cこの臨界温度以下ループの下に直接皮質の領域でシナプス伝達を抑制します。このような非アクティブ化は、メタノールの流れを終えることによって単に取り消すことができます。このメソッドは、感覚情報処理と行動9,10、11,12,13,14,15皮質貢献を研究に使用されています,16,衝動性眼球運動18および記憶誘導性障害物歩行19の運動制御と同様、 17日。

このプロトコルの目的は、猫の運動の調整のため頭頂皮質の関与を評価する可逆冷却誘起 deactivations を使用することです。具体的には、記憶誘導性障害物歩行はアクティブの頭頂連合野の有無を検討した.これらのメソッドは、正常に歩く猫19の記憶誘導性障害物回避の頭頂領域 5 の役割を示すために使用されています。

プロトコル

ケアと実験動物の使用のため国立研究評議会のガイドに準拠してすべての手順を行った (第 8 版; 2011) とカナダ評議会は、動物愛護の介護および実験動物の使用 (1993 年) へのガイドと動物愛護に関する大学理事会のウェスタン オンタリオ大学動物利用小委員会によって承認されました。

次の手順は、皮質への歩行の猫の運動制御を勉強して実験に適用できます。

1. 装置

  1. メモリ障害を評価するために使用される装置を構築します。
    注: 装置から成ります、2.43 m 長い、29 cm の広い通路 18 cm 高透明なアクリルの壁 (図 1) で囲まれています。狭いスロット装置の途中では、25.8 cm 幅 x 3 mm の厚い障害に発生または通路歩行面の下に取り付けられたレバーを使用してから削除することができます。
  2. 確実に食べることに動物の注意を維持を障害物を上げ下げする手を使用しないでください。代わりに、障害が発生するか下げる実験者の脚を使用して動物の給餌を続行する実験者をできるように、通路の下にレバーを移動します。
  3. 正しく、障害の発生または音もなく下げることが、できるようにレバー システムを維持します。
  4. 小高架のプラットフォームを使用して (23 cm 高さ 23 cm 幅 x 16 cm x 長さ) 柔らかい食品を配置すると、動物の動きを導くために。
  5. 通路の正中線から離れて 1.85 m 三脚にマウントされているイーサネット カメラ (54 フレーム/秒) を使用してすべての試験を記録します。

2. トレーニングの手順

注: 成功したデータ集録、行動テストの前の訓練の期間によってそれぞれの動物がテスト ルーム、器具に順応され正しく。新奇環境への繰り返された露出は驚くべきまたは他のストレス行動を減らすことに役立ちます。 馴化動物によって異なりますおよびトレーニングの 1-2 ヶ月を必要とする場合があります。初期順化セッションはフォーカスとを食べる動物の動機によって長さを 5 分程度にあります。以降のセッションは、動物は (通常約 20-25 分) を仕事にやる気時間の持続期間を増加する目指すべきであります。

  1. 成熟を取得 (> 生後 6 ヶ月) 体重や性別の商業研究所ブリーダーから国内短い毛の猫。
    注: 研究に動物を含めるかを検討する際、食品と共同廃棄のために働く動機は選択基準を構成します。
  2. 1 m 長い鎖が接続されているハーネスを着てそれぞれの動物に適応します。通路の中間に、通路の上の棚にリーシュを固定します。
    注: これは装置のこの部分にとどまろうとする動物を促します、緊張することがなく装置の中央部分に沿って歩いて動物をことができます。そのような境界を確立するテストに動いている被写体での作業に便利です。
  3. 柔らかい食べ物を配置するプラットフォームから食べること、通路上に動物を配置します。
    注: この初期研修の目的のひとつは動物が容易に転送、移動時の食品プラットフォームを準拠させるためには、ハーネスとリードを快適に歩くことができます。肯定的な補強とソフト食品の使用は各訓練やテストのセッションを通して焦点を維持する動物を奨励し、快適な作業環境を促進します。
  4. 動物が遊歩道のスタート エリアに動物を移動する必要がありますインスタンスを含む処理と快適であることを確認します。

3. 行動トレーニング セットとプロトコルをテスト

注: 障害メモリは 2 つのパラダイムの評価: 視覚依存性障害メモリ タスクと依存触覚障害メモリ タスク。両方のパラダイムを使用して、初期の訓練と後続のテスト中にください。

  1. 視覚障害メモリ
    1. 視覚障害メモリを評価するには、(図 2 a) 通路に障害を発生させます。障害物の向こう側にプラットフォームを配置します。遊歩道のスタート エリアに動物を配置します。
    2. プラットフォームから食べるためにその前足のみで障害物をステップ オーバー、食べ物に近づくには、動物を許可します。
    3. 動物は食べるし続けており、さらに視覚や触覚入力を防ぐために通路と同じ高さになるような障害物を下げます。
    4. 可変遅延期間後再びウォーキング; を再開する動物を奨励する食品の転送を移動します。この遅延が 1 未満にすることができます上向きに 2 分する s。
    5. 重要なは、障害物が障害物と学んだ回避の応答の開発への慣れを防ぐために欠席裁判を実行します。試験ではそのような視覚障害の不在、遊歩道のスタート エリアの動物を配置する前に、通路に障害は発生しませんを確認します。
    6. 典型的な運動動作と冷却前にそのまま視覚障害メモリを確認する障害の現状と障害の不在の試験でステップ脚を観察します。動物、接触することがなく障害物にすることができます障害現在試験で上昇はすべての 4 つの足のステップ実行ことを確認します。
      注: この確認に役立つ訓練試験のビデオを見てします。
  2. 触覚障害メモリ
    1. 触覚障害メモリを評価するには、(図 2 b) 通路のスタート エリアの動物を配置する前に、通路に障害は発生しませんを確認します。
    2. 障害物スロットの反対側に置かれた食品プラットフォームに向けて歩いて動物を許可します。
    3. 動物が食べると、障害物の視覚入力できなく餌皿の下にある通路に障害物を発生させます。
    4. 食べ物を前方移動すると、動物がそれをまたぐ前に彼らの前脚の障害を連絡する必要があります注意してください。
    5. その前面と後肢の間の障害物をまたぐながら食べ続けるには、動物を許可します。この時間の間に、さらに視覚や触覚入力を防ぐために通路と同じ高さになるように障害物を下げます。
    6. 可変遅延期間後もう一度歩いて再開する動物を奨励する食品の転送を移動します。
    7. 重要なは、障害物が存在しない試験を実行、障害学習回避反応の開発に慣れを防止するため前肢の接触が発生しません。
      1. 触覚障害の不在、これらの試験で動物のアプローチを持っている、3.2.1 の手順で説明するように食品のプラットフォームから食べる。ただし、上下させる障害物 (ステップ 3.2.2) 3.2.3 のステップで進む食品を移動する前に。歩行 (ステップ 3.2.5) の最終的な継続を動物は (ステップ 3.2.4) を食べ続けることは同様の遅延期間に前を確認します。
    8. 正常な歩行動作と冷却前にそのまま視覚障害メモリを確認する障害の現状と障害の不在の試験でステップ脚を観察します。

4. ビデオ解析

初期の訓練と冷却ループ注入後の後続のテストの間に分析のメモ: メモリ障害を評価するためにピーク ステップ高さ、ステップのクリアランス、およびつま先と各ステップのためのピーク時に障害物との間の水平方向の距離を定量化含む視覚と触覚の両方のパラダイム (図 2)。

  1. カスタム スクリプトを使用してビデオを分析します。
  2. 毎回毎回、それぞれの足を各ステップを通してカメラに最も近いつま先の位置をマークすることによって追跡します。
  3. つま先と各ステップ軌道 (図 2) で最高点で通路の表面との間の垂直距離としてピーク ステップ高さを測定します。
  4. 障害現在試験で障害物の高さによって、減算障害スロット上に直接ステップの高さとステップ クリアランスを測定します。
  5. さらに、つま先と障害現在試験の各ステップのピーク時に障害物との間の水平距離を測定します。
  6. ピークのステップ高さは障害欠席裁判でステップと比較して障害現在試験で上昇しているを確認することによって障害メモリ機能が冷却のループ注入前にそのままであることを確認します。

5. 冷却ループ (Cryoloop) 注入

  1. インプラント cryoloops 両側エリア 5 と 7 によると以前に報告された手術8 (図 3)。
  2. 簡単に言えば、各半球の開頭術および実行痛覚ホースレイ クラーク座標20 A15 から A25 ansate と外側溝の連接を公開するために。
  3. 23 サージカル ステンレス製皮下チューブ 5 または 7 頭頂部皮質の表面に直接接触してループから形ループの冷却が個々 の位置。
  4. 歯科アクリル ステンレス鋼製ネジに固定で頭蓋骨に各 cryoloop のベースを固定します。
  5. その他歯科アクリル; craniotomies を閉じる一緒に縫合糸とアクリルの端まで皮膚の余白を描画します。

6. 皮質の冷却のプロトコル

  1. 実験のセットアップ
    注: 前に動物を実験室に持ち込み、冷却回路は準備、テストします。メタノール貯水池取水管 (3.2 mm 外径、内径 1.6 mm)、往復動ピストン ポンプ、ポリテトラフルオロ エチレン チューブ (1.6 mm 外径 0.5 mm 内径; を介して接続されているドライアイス浴の冷却回路します。図 4)。さらに、デジタル温度計が必要です。
    1. 500 cc のドライアイスを 200 mL の氷浴でメタノールに追加します。入口と出口の冷却回路を完成するダミーの cryoloop にぴったりとフィット チューブを終了します。
    2. 連続温度の 2 つの男性の熱電対コネクタ、熱電対線の構成ケーブルを使用して監視用デジタル温度計熱電対プラグを取り付けてください。このケーブルの長さは 1 つの端は、温度計に差し込まれている動物の頭に到達する十分なことを確認します。
    3. ピストン ポンプのスイッチを使用してオンにします。
      注: メタノールされなければならない-75 ° c の管で流れるメタノールの冷却、ドライアイス浴にポンプを介して渡される貯水池から冷やしたメタノール氷浴を終了し、メタノール貯水池に戻る前に接続されている cryoloop を実行します。
    4. ポンプ設定、氷浴内チューブの長さとダミーのループに氷風呂からチューブの長さが最適なようなダミー cryoloop 温度が定常-5.00 ° c. に達することができることを確認します。
      注: この最初のセットアップ中に達成したそのような温度が同じシステムを使用して注入 cryoloop を冷却する場合に 3.0 ± 1.0 ° C の温度を達成するために十分な多い。十分な冷却を達成するための難しさは、氷浴に浸漬チューブや、cryoloop に氷風呂からチューブの長さを最小限に抑えることの長さを増やす、ポンプの速度を調整することによって解決できます。
    5. 必要に応じて、管端部管継手からのチューブの端をスレッドでチューブのセクションが長く、フランジング ツールでチューブの端をフランジします。コネクタを使用して同様にフランジ端点で希望の長さのチューブを接続します。
    6. すべての接続がぴったりのリークが存在しないことを確認します。初期セットアップに満足して、一度ポンプのスイッチを切るとダミーの cryoloop; を削除実験動物では、回路は準備が整いました。
  2. 行動テスト
    1. 試験装置に動物を配置します。頭の上、ハーネスをスライドさせ、保護動物の周りのストラップぴったり。ひもを添付します。
    2. 入口と出口の管を公開する注入の cryoloop の保護キャップを取り外します。フィット チューブは、cryoloop の管の入口と出口の上ぴったりに終了します。デジタル温度計、熱電対プラグを接続します。
    3. ビジュアル (ステップ 3.1) でのテスト セッションまたは触覚 (ステップ 3.2) 障害メモリ トライアルを開始します。全 4 種類の追加試験とフォロー (視覚障害現在、視覚障害の不在、触覚障害現在、触覚障害-欠席) ランダムなファッションで。
      注: 典型的なテスト セッションは、試験では、基準となる測定を確立する冷却の不在で記憶誘導性障害物回避を観察する場所の '暖かい' ブロックで構成されています。
    4. ピストン ポンプのスイッチ、cryoloop 3.0 ± 1.0 ° C (1-2 分) までの温度に達するまで待ちます。その後、ピストン ポンプがオンになっている後に試験の 'クール' ブロックを実行します。試験のこのブロックの中に必要な場合は、記憶誘導性冷却領域の貢献を評価します。3.0 ± 1.0 の ° C ブロック全体を通して、cryoloop の温度が維持されることを確認します。
      注: すべての 4 つのトライアル タイプは、ランダムにブロック全体で散在する必要があります。
    5. ピストン ポンプをオフにされているし、cryoloop、元の温度に戻った後は、試験の最後の 'rewarm' ブロックを実行します。
      注: ベースラインのステップ実行の動作がこのブロックの間に再確立されました。再度、ブロック全体でトライアル 4 種類、すべてをランダムに散在する必要があります。
  3. クリーンアップ
    1. 行動テストの締結時、入口と出口の管から管を取り外します。管端から滴り落ちることがありますし、動物を刺激する残留メタノールを意識します。
    2. 保護キャップを置き換えることを確認します。植民地に動物を返す前に、リーシュ、ハーネスを取り外します。次の試験日に漏れの接続を防ぐためにパイプ カッターを使用して管端 (3-4 mm) をトリムします。

7. 冷却の範囲の確認

  1. 行動テストの終わりに、非アクティブ化の範囲が以前に報告されたテクニック8を使用して各 cryoloop の直下に皮質の領域に制限されているを確認します。
    注: これは水温躍層マッピング12サーマル イメージング カメラ13,14,19確認することができます。

結果

このプロトコルは、頭頂連合野への歩行の猫19障害メモリを調べるに正常に使用されています。本研究では、cryoloops が頭頂領域 5 と 7 の 3 大人二国間移植された (> 生後 6 ヶ月) メス猫 (図 5 a)。動物は冷却 (暖かく、コントロール状態)、または 5 または 7 の領域だった二国間非アクティブ化されたときの不在で触覚障害メモリ ?...

ディスカッション

記述のパラダイムでは、猫の記憶誘導性障害物歩行を研究するために、cryoloop を使用して個別の皮質の冷却誘起 deactivations を採用しています。視覚と触覚の障害メモリ パラダイムは、彼らは動物は移動食料源に従うときに最小限の労力で発生する自然主義的な運動行動を悪用を実行する動物にとって極めて単純です。このように、研修期間の大半は試験室および冷却装置、動物を順化に捧げ...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は健康の研究のカナダの協会、自然科学・ エンジニア リング研究会のカナダ (レベル)、革新のためのカナダの基盤のサポートを感謝します。C. w. によって、アレクサンダー グラハム ベル カナダ大学院奨学金 (レベル) に対応しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CameraIDS Imaging Development Systems GmbHModel: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubingRestek25306Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
PumpFluid Metering, Inc.Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flaskSigma-AldrichF9401
Teflon tubingEzkemA051754
Microprobe thermometerPhysitempModel: BAT-12
Flanged tube end fittingsValco Instruments Co. Inc.CF-1BKAssorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
WashersValco Instruments Co. Inc.CF-W1Extra washers
Flanging kitPro Liquid GmbH201553
Tubing connectorRestek25323
Tubing cutterRestek25069
Male thermocouple connectorOmegaSMPW-T-MUsed to make cable connection to thermometer
Thermocouple wireOmegaPP-T-24SUsed to make cable connection to thermometer
MATLABMathWorksn/a

参考文献

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