解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

要約

このビデオでは、後期胚と早期出生後のマウス皮質からニューロン培養を生成するための手順を示しています。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムとナトリウムのイメージングに使用され、出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供することができます。

要約

このビデオでは、後期胚と早期出生後マウス脳から皮質ニューロン培養を生成するためのプロセスをガイドします。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムやナトリウムイメージング、蛋白質および/またはRNA分離など、様々なアプリケーションに使用することができます。これらの文化はまた、後期胚または出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供しています。手順は比較的単純であり、組織培養技術のいくつかの経験を必要とし、あなたが適切に準備されている場合2〜3時間を上回ってはいけません。視床皮質線維路から皮質外皮を慎重に分離が不要な非神経細胞の数が削減されます。上げるには神経細胞の収量は、酵素インキュベーションステップの後に優しく皮質組織片を砕いて粉にする。それが細胞や未熟神経細胞死への不必要な傷害を防ぐため、これは不可欠です。これらの文化は、グリア細胞のフィーダー細胞の非存在下で維持されているので、彼らはまた、神経細胞に富む成長する文化の付加的な利点を提供します。

プロトコル

培養の一日前の準備：

• 無菌解剖ソリューション（DS）を準備する。
• NBM/B27（B27サプリメントとNeurobasal Mediom）を準備する。
• オートクレーブのddH ₂ O及び必要に応じて、ガラスのcoversilpsを滅菌する。
• ポリ- D -リジンでコーティングの組織培養皿またはガラス製カバースリップ。

ポリ- D -リジンコーティング：

無菌条件下で培養前日に準備します。

• 氷上で10倍PDLと場所のアリコートを解凍。
• PDLの1mlに9 mlの滅菌超ろ過水を追加し、（1X）よく混ぜる。
• 次のように、室温で一晩1X PDLとコートサーフェス：
  • ガラスカバースリップ（Bellcoガラス、株式会社カタログ番号1943から00012まで。）：75μlの/カバースリップ
    OR
  • 24ウェル培養プレート：300μL/ウェル
    OR
  • 35mmの培養皿：1ml/dish
• 滅菌水で5倍リンス（液体を吸引するために滅菌パスツールピペットを使用）。
• 表面が完全に乾くまで水を取り外します。

培養の手順（無菌条件下で層流フードで行われている）

1. スーパー接着剤を使用してミクロトームVibraslicer（カムデンインスツルメンツ社）の支持ブロックの上に寒天とのり、それのブロックをカット。
2. 後期胚のステージ（E17 - 18）マウス胎児、euthaniseダムを使用する場合は、胚性袋から子宮と無料の個々の胎児を削除します。場所は、滅菌シャーレに胎児​​と、下記のとおり継続する。
3. 首を切るのマウスの胎児や子犬（あなたの動物実験使用の委員会で承認された以下のガイドライン）。
4. 冷たいDSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿にワットマン濾紙ディスクに皮膚や頭蓋骨と場所の脳を取り外します。
5. 滅菌カミソリの刃を使用して小脳を切り取ります。
6. スパチュラを用いて脳をピックアップし、ろ紙上に余分な水分を排出し、代わりにVibraslicerの支持ブロックと接着剤の脳（尾側を上にして寒天が直面している腹側の部分）に脳を転送する。
7. 冷たいDSでチャンバーを埋める。 8-9速度のセレクタを設定します。
8. 嗅球から始まる、200から400μmのセクションをカット。 Vibraslicerの刃が皮質に入ると、600μm冠状セクションに切断開始。 P0マウス脳では4月5日使用可能なスライスをもたらす間、E17 - 18マウスの脳は、通常、3-4使用可能なスライスが得られます。
9. 10ミリリットルのガラスパスツールピペットをアンプラグインの逆の端を使ってDS 2とラベル付けさ35ミリメートルのペトリ皿に脳スライスを転送する。
10. 大脳皮質を摘出し、キャピラリーチューブから引き出さガラス針を用いて髄膜を除去。
11. 小片、長さは0.5〜1ミリメートルに皮質rindsをカット。
12. 0.2μmのフィルターESは、35mmシャーレに5ccのシリンジに接続されたフィルタ。
13. フィルタ処理されたESを含むペトリ皿に皮質組織片を移し。
14. 37℃で30分間インキュベートします。

一方で：

1. フード、Vibraslicerと解剖ツールをクリーンアップします。
2. 60ミリメートルのペトリ皿に暖かいNBM/B27 5 mlを加える。

30分後。インキュベーション：

1. 10 mlのDSに組織を移す。 1分間のために解決しましょう​​。
2. 第一こんにちはチューブの渦に組織を移し、2〜3分のために解決しましょう​​。
3. 第二Hiに転送する。上記のように繰り返す。
4. 第一リーに転送する。上記のように繰り返す。
5. 第二リーに転送する。上記のように繰り返す。
6. 第三リチウムに転送する。上記のように繰り返す。
7. メディア60 mmディッシュに組織を移す。

解剖顕微鏡の下で：

1. 組織からごみを清掃し、そっとティッシュをほぐすためにプルアップガラスピペット（減少ボアサイズを使用）を通過させることによって、各部分を砕いて粉にする。
2. NBM + B27の残りを含む15 mlのコニカルチューブに細胞懸濁液を移す（24ウェルプレートまたは5の11ミリリットル、13 mlの合計を作る - 35 mmの培養ディッシュ穏やかに混合し、解決するために組織の大部分を待つ）。
3. 転送細胞懸濁液（24ウェルプレートあるいは2 ml / 35 mmの培養ディッシュ/ウェル0.5ml）を。
4. ガラス製カバースリップを使用する場合は、カバースリップあたり80μlの細胞懸濁液を追加し、細胞がより多くのNBM/B27メディアでチャンバーをフラッディングする前に付着するための組織培養インキュベーターで1時間を可能にする。
5. 37℃、5％CO ₂で培養を維持する。

次の日

24ウェルプレート：（cNBM/B27; cNBM/B27培地の調製のための議定書下に表示される）NBM/B27培地を条件付け0.5ミリリットル非神経細胞の各ウェルをフィード

35ミリメートル料理：cNBM/B27培地に0.5 mlを交換してください。

新鮮なcNBM/B27ごとに2〜3日で培地の0.5ミリリットルを置き換えることにより、文化を維持する。

培養培地は、グリア細胞の増殖を促進しないが、培養は、必要に応じてさら​​にグリア細胞の数を減らすために、文化の日3月5日で5μMFDU（5 - フルオロ-2' - デオキシウリジン、シグマF0503）で処理することができます。

セット - UP解剖と文化のための

70％EtOH中で解剖ツールを殺菌したり、それらをオートクレーブ：

• はさみ（med.と小）ヘラ（med.と小）
• ピンセット（med.と小）レーザーブレード
• vibraslicerバッファ風呂用ブレード
• 脳のためのブレードをサポートするための小さな金属製のくさび

その他の材料：

• ペトリ皿（60 mm）の
• ペトリ皿（35ミリ）
• ろ紙
• ガラスピペット10ミリリットル
• 滅菌ディスポーザブルピペット、5,10および25ミリリットル
• シリンジフィルター、0.2μmの
• シリンジ5ccの
• 遠心分離チューブ、15ミリリットル
• 滅菌パスツールガラスピペット
• PDLコート培養皿またはガラス製カバースリップ

ラベルsix 15 ml遠心チューブと準備は、次のとおりです。

チューブ＃1：酵素溶液：

を含む5mlのDSにパパイン（ワーシントンLS 03126）の50 Uを追加します。

• L -システインの100μL（0.8mg）
• 7μlの0.1N NaOHを
• 50μlのAPV（5mm）で

クリアするには、室温でソリューションを残す。酵素溶液は、最初は"曇り"に表示され、使用前にクリアする必要があることに注意してください。

チューブ＃2＆＃3：ハイ酵素阻害薬：

3ミリリットルDS + 300μlのBSA /チタン+30μlのAPV（5mm）で提供されます。

泡を避けるために静かに混和、2つの1.5ミリリットルのアリコートに分ける。

チューブ＃4 - ＃6：低酵素阻害薬：

8ミリリットルDS +80μlのBSA /チタン+80μlのAPV（5mm）で提供されます。

泡を避けるために穏やかに混合、三2.6ミリリットルのアリコートに分ける。

場所チューブは氷上に＃6を介して第2の番号。チューブ＃1（酵素液）、室温で残す。

ソリューション、アリコート

• ソリューション（緩衝生理食塩水）シグマフォーミュラ重量500ミリリットル[濃]
• 塩化ナトリウムNaClのS - 9625 58.45 80.0グラム137mM
• 塩化カリウムKClのP - 4504 74.56 4.0グラム5.4mM
• ナトリウム二塩基性リン酸、無水Na ₂ HPO _4、S - 0876 142.0 0.24グラム0.17mM
• 一塩基性リン酸カリウム、無水KH ₂ PO _4、P - 5379 136.09 0.3グラム0.22mM

400ミリリットル超ろ過水で溶解するまですべての食材とミックスを秤量。 500 mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいな瓶とオートクレーブ内の場所。 4℃とラベル"DSソリューション"。

• ソリューションB（HEPES）シグマフォーミュラ重量250ミリリットル[濃]
• HEPESヘペスH - 3375 283.3 20.97グラム9.9mM

200mlに超ろ過された水を追加します。溶解するまで混合し、250mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいな瓶とオートクレーブ内の場所。 4℃とラベル"DS B液"。

• ワーキング溶液500ミリリットル[濃]
• 超ろ過された水400ミリリットル
• ストック溶液25ミリリットル
• ストック溶液B 14ミリリットル
• D（+） - グルコースシグマG - 8270 3.0グラム33.3mM
• スクロースシグマS - 0389 7.5グラム43.8 mMの

1N NaOHで7.4にpHを調整する。超ろ過された水で500 mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいなガラスのボトルやオートクレーブにデカント。 4℃で保存します。ラベル"解剖ソリューション"。

ポリ- D -リジンの準備：

1. 1mg/mlで無菌H ₂ Oで、ポリ- D -リジン（シグマP - 7280 PDL）の10倍のストック溶液を調製。
2. 1.0mlのアリコートを行います。このソリューションは、3ヶ月間-20℃で保存することができます。

MEDIA

1. 10mlのを追加するB - 27サプリメント（Gibco社17504〜044）500mlのNBMボトル（Neurobasalミディアム、ギブコ21103から049）へ。
2. 4で40 mlのアリコートとストアを行う℃に

APV

1. 10 mgのAPV（2 -アミノ-5 - phosphonopentanoic酸、シグマA - 5282）のバイアルに10 mlの滅菌H ₂ Oを加えてよく混ぜる。
2. -20℃で180μlのアリコートとストアを準備する

BSA / Tiの

1. 10 mlのDSで1グラムBSA（ウシアルブミン。シグマA - 7030）および1gトリプシンインヒビター（Sigma社T - 9253）を溶解する。
2. 1N NaOHで7.4にpHを調整する。
3. 0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌する。
4. -20℃で400μlのアリコートと店に分ける

L -システイン

エッペンドルフチュー​​ブに200μlのDSで0.6 mgのL -システイン（シグマC - 7755）を溶解する。

寒天（4％）

1. 100ミリリットル滅菌水でバクト寒天4gの（ディフコ0140〜01）を溶解する。培養のために必要とされるまで4℃で保管してください。
2. マイクロ波の寒天は、35mmペトリ皿を溶融し、充填する。クールダウンして重合するために座ってみましょう。

パパイン（ワーシントンLS 03126）

NUNC培養ボトルIN">非神経の文化をe_title

コー​​ティング培養ボトル（4ヌンクボトル）

1. 1X PDLを作るために10X PDLの3管のそれぞれに9 mLの滅菌水を追加。
2. 最初のボトルに30 mlの1X PDLを転送します。
3. すべての成長の表面が覆われるまで若干移動する。 1分間放置します。
4. 第二瓶に1X PDLを転送する。 1分間放置します。
5. 目と前後のボトルで繰り返します。
6. 150ミリリットル滅菌H _{2 O}で2倍、4つのボトルをすすぐ

酵素溶液（ES）を準備します。

1. 結晶が溶解するまで0.8 mgのL -システイン（シグマC7755）を0.6ミリリットルの遠心管の重量で、150ミリリットルDSと渦を追加します。
2. 15 mlコニカルチューブに5 mlのDSを転送して、L -システイン150ミリリットルを追加します。
3. パパイン50ユニットを追加。 （ワーシントンLS 03126）
4. 7ミリリットル0.1N NaOHを追加します。

PREPARE MEM（GIBCO＃11090〜081）

1. 500mlのMEMのボトルから65 mlを削除します。グルコースを準備するために10mlを保存します。
2. 5ミリリットルペン/連鎖球菌を（Gibco社＃15070から063）を追加します。
3. 10ミリリットル1Mグルコース（シグマG - 8270）（1.8グラム/ 10ミリリットルMEM）を追加します
4. 50ミリリットルのウシ胎児血清（ギブコ＃16140から071）または仔ウシ血清（オメガBC - 04）を追加します。
5. 4でよく混ぜ、分注し、店舗℃の

NEUROBASAL MEDIUM/B-27のサプリメント（NBM/B27）
NBM、500ミリリットル（ギブコ＃21103から049）、B - 27（50X）、10ミリリットル（ギブコ＃17504〜044）

1. NBMボトルとミックスにB - 27バイアルの全体の内容を追加します。
2. 4℃で分注しストア

脳組織の郭清

1. ドライ解剖前の70％EtOHからツールを解剖。
2. 3〜15ミリリットルチューブのそれぞれに10 mlのDSを転送します。
3. 仔マウス（P0 - P3）を選択すると、4本に3つの頭脳が必要になります。
4. 35ミリメートルのペトリ皿に冷たいDSを追加。
5. 子犬マウスを刎ねると頭脳をばらばらにする。
6. コー​​ルドDSを含むペトリ皿に脳を置きます。
7. ガラスピペットを通過するのに十分小さい部分、に組織を切る。

酵素解離

1. パスツールピペットでシャーレからできるだけ多くのDSを削除します。
2. 0.2μmのフィルターと5ccシリンジを介してフィルタのES。
3. 組織と皿の中でESを置きます。
4. ℃のインキュベーター（CO ₂フリー）が30分間37℃で組織をインキュベートする。

組織を洗浄

1. できるだけ少ないESとして取得することを確認しながら、最初のDSのチューブにガラスピペットで組織を転送する。
2. 1500rpmで30秒間遠心します。
3. 組織と繰り返し手順をさらに2回転送する。

粉砕

1. 50ミリリットル遠心管にMEM / FBSの38 mlを置きます
2. このペトリ皿に35mm皿と伝達組織にMEM / FBSの3 mlを追加します。
3. 優しく1000μlエッペンドルフピペットチップを介して摩砕することにより、組織を解離する。
4. MEM / FBSの38ミリリットルを含むチューブに細胞懸濁液を移し、よく混ぜる。

めっき

1. 各ボトルに細胞懸濁液とメディアの同量を得るために直立培養ボトルスタンド。
2. 各培養瓶でMEM / FBSの90 mlを置く。
3. 各瓶の細胞懸濁液10mlを追加。
4. ラベル：非神経、イニシャルと日付。 37℃および5％CO _2をインキュベートする。

摂食

1. 3日目または4日に、暖かいMEM / FBS（デカントすべてのメディアとMEM / FBSの100mlでそれを置き換える）とフィード細胞。文化は、コンフルエントになるために7〜10日かかることがあります。
2. デイ7-10 NBM/B27のメディアを変更してください。
3. 次の日、メディアを収集する。 0.22μmとフィルタ
4. 40mlのアリコートを作成し、MEM / FBSで培養を養う。
5. 2または3日間、次の、NBM/B27ためにメディアを変更する
6. 翌日、収集し、手順を繰り返します。
7. 約のためのメディアを集めておいてください。 2週間。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!