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要約

G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセット プラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々 なタンパク質。

要約

非正規の核酸の二次構造 G quadruplexes (G4) は、DNA 複製、転写、RNA プロセシング、テロメア伸長などの多様な細胞プロセスに関与しています。これらのプロセスの中に様々 な蛋白質はバインドし、職務の遂行に G4 構造を解決します。G4 の関数は、多くの場合その折り畳まれた構造の安定性に依存、G4 結合蛋白質が G4 の安定性を調節する方法を調査することが重要です。この作業は、リアルタイムで G4 分子に G4 結合タンパク質の制御の研究を可能にする磁気ピンセットを使用して単一の G4 分子を操作するためのメソッドを示します。一般的には、このメソッドは、タンパク質・ リガンド相互作用の様々 な DNA または RNA 二次構造に規制研究アプリケーションの広い範囲に適しています。

概要

4 本鎖 DNA や RNA の G4 の構造は、多くの重要な生物学的プロセス1に重要な役割を果たします。多くの蛋白質は、G4 のバインディングとテロメア結合タンパク (テロメラーゼ、POT1、RPA、TEBPs、TRF2) などの規制に関与している1,2, 転写因子 (ヌクレオリン化における PARP1)3、RNA プロセシング蛋白質 (hnRNP A1hnRNP A2)4ヘリカーゼ (BLM、FANCJ、RHAU、警告、Dna2、Pif1)5、DNA 複製関連蛋白質 (Rif1、REV1, PrimPolymerase)6に。蛋白質の結合を安定化したり G4 構造を不安定にします。したがって後続の生体機能を調節します。G4 の安定性は、熱溶融性 uv (紫外線) や円偏光二色性 (CD) の方法7を使用して測定しました。ただし、そのような条件は、生理学的な関連、タンパク質7のバインドの効果の研究に適用することは困難。

1 分子操作技術の急速な発展は、折りたたみとリアルタイム8ナノメートルの分解能での単一分子レベルでのタンパク質や DNA など、生体分子のアンフォールディングの研究を可能にしました。原子間力顕微鏡 (AFM)、光ピンセットや磁気ピンセットは、最も一般的に使用される単一分子操作方法です。原子間力顕微鏡、光ピンセット9と比較して、磁気ピンセットはドリフト防止法10,11を使用して、日間折り畳み展開単分子動態の安定した測定を許可します。

ここでは、結合蛋白質による G4 安定性の規制を検討する磁気ピンセットを用いた単一分子操作プラットフォームは報告された12,13です。この作品では、サンプルと流れチャネルの準備、磁気ピンセットのセットアップ力校正など、基本的な方法について説明します。コンスタント ・ フォース (力クランプ) など、さまざまな力のコントロールの下で長い時間測定を可能にする力の制御とドリフト防止プロトコルに記載されている手順 3 として、読み込み定数 (力ランプ)、速度し力ジャンプ測定。手順 4 で説明した力校正プロトコルによりの力校正 < 広い力短い綱を 1 μ m の範囲まで 100 pN は、10% 以内の相対誤差と。RNA ヘリカーゼの安定性の規則の例は、RNA G4 はこのプラットフォームの13のアプリケーションをデモンストレーションするために使用の解決に重要な役割を果たしている AU 豊富な要素 (RHAU) ヘリカーゼ (別名 DHX36、G4R1) に関連付けられています。

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プロトコル

1 です単一分子の伸張のための準備の G4 DNA

  1. 準備 5 '-チオール ラベル及び 5 '-5 を使用してラムダ ファージ DNA テンプレートの DDNA ポリメラーゼを用いた PCR によるビオチン dsDNA ハンドル '-チオールと 5 '-ビオチン。プライマー 14 ( 図 1)。両方 dsDNA のハンドルがある高い GC の内容 (> 60%) DNA を防ぐために溶融高力または overstretching DNA 中に DNA を開催移行 15
    2. 。
  2. 浄化の PCR の製品のメーカーによると BstXI の制限の酵素と商業浄化キットとダイジェストを使用して ' s プロトコル
    3. 。
  3. 縛る G4 成形 ssDNA、および製造元によると T4 DNA リガーゼを使ってフランク ssDNA と dsDNA ハンドル ' s プロトコル。メーカーによると商業精製キットを使用してゲルの抽出による結紮製品を浄化 ' s プロトコル
    4. 。

2。流路の準備

  1. Coverslip のクリーニングと表面機能化
    1. 場所下の染色 (各 jar coverslips の 7 個セット出来る瓶カバー ガラスのトップ coverslips (#1.5、20 × 20 mm) に coverslips (#1.5、22 × 32 mm)ボリュームが ~ 20 mL)。リンス、coverslips 蒸留水の瓶で 2-5 倍です
      2. 。
    2. 追加 ~ 5 ~ 40% に各 jar ファイル、および 30 分の超音波洗浄で洗剤溶液の 20 mL 用蒸留水ですすぎ > 洗剤を削除する 10 倍
      3. 。
    3. 乾燥オーブンで瓶に coverslips (~ 150 ° C;注意、ホット)、または N 2 ガス。ドライ キャビネットの乾燥トップ coverslips を格納します
      4. 。
    4. 使用プラズマ (O 2 ガス) coverslips 10 分の瓶の中をきれいにします。10 分間の 1% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) 液をメタノール 20 mL を準備 (注意 毒性・可燃性)。APTES をメタノールに溶解する化学発煙のフードを使用します
      。 注: は、APTES ソリューションを格納するときに湿気を避けるため。古い APTES しばしば coverslips の表面機能性の問題が発生します
      5. 。
    5. プラズマ洗浄後すぐに瓶に 1 %aptes 溶液のすべてを追加し、1 h. 注ぐ 1 %aptes メタノールの特定廃棄物のボトルに廃棄物のためのインキュベートします。可燃性の化学薬品の発煙のフードでメタノールに関連の手順を実行します
      6. 。
    6. メタノールと一度瓶を洗うと > 10 倍蒸留水と (~ 150 ° C のオーブンで、ドライ注意、熱い)。2 週間使用中はともかく乾燥キャビネット APTES コーティング下 coverslips を格納します
      。 注: 2.1.4 を 2.1.1 から各サブ手順の後洗浄プロセスを一時停止できる次のステップにします
      7. 。
  2. アセンブル流路
    1. 2 つの準備 " スペーサー "、すなわち、パラフィルムまたは両面テープ (〜 4 × 20 mm) 各チャネルの。長い端に沿って下部 coverslip のスペーサーの 2 つの作品を配置します。間にフローセルを形成、スペーサーのトップ coverslip の場所 (~ 10 mm × 20 mm 領域、 図 2 a B).
    2. は、パラフィルム、スペーサーとして使用する場合はヒーター (60-120 ° C; に流路を配置します。注意、ホット) 2 つ coverslips をパラフィルムで一緒に固執するトップ coverslip の両側を軽く押して中に 5-10 秒のため。結果の流路の高さがあり ~ 100 μ m、それによりチャネルのボリュームが ~ 20 μ L
      3. 。
    3. 漏れを避けるためにシリコーン接着剤でチャネルの長い端を密封します。シリコーン接着剤を使用して、エントリとソリューションの出口として機能する流路の開放端の小さなシンクのような構造を作る
      。 注: エントリと終了も可能 など、他の方法でワックスを使用して付着した小さなプラスチック製のリングで
      4. 。
    4. 4 週間乾燥キャビネットにチャンネルを保存します
      5. 。
  3. 流路の底面にテザー DNA
    1. アミノ酸コーティングのポリスチレン ビーズを希釈 (直径: 3 μ m) 蒸留水 1 X 200 X によるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファー。渦ビーズ ソリューションとチャンネルの流れ。孵化のためのチャネルでビーズ ソリューション 〜 30 分 1 × PBS バッファーの 200 μ L で洗浄することにより任意のバラバラのビーズを削除します
      2. 。
    2. 調整 (増加/減少) 50 mm × 50 mm の面積あたり 1-5 ビーズの表面密度を達成するために培養時間。3 日間参照ビーズ堆積チャンネルを格納します
      3. 。
    3. Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC) パウダー 1 × PBS ソリューション (〜 0.5 mg/mL)。渦ソリューションとチャネルに、フローします
      。 注: 使用する前に新鮮なスルホ SMCC ソリューションを準備し、SMCC の加水分解を避けるためにチャンネルにすぐにそれを追加します
      4. 。
    4. 加温 30 分のためのチャネルの SMCC ソリューション大量洗浄 SMCC ・ ソリューションを取り外します (1 mL 〜 チャンネル ボリューム X 50) 1 × PBS 溶液
      。 注: 余分な SMCC を丁寧に洗います。この手順は、上の DNA の結合のために非常に重要です
      5. 。
      1. DNA テザリング の希釈、チオール-ビオチンは DNA の結果 DNA 濃度の 1 X PBS に 〜 0.3 nM。ソリューションをミックス、SMCC 被覆したチャネルに DNA の解決の流れ、室温で 30 分間インキュベートして優しくピペット (~ 23 ° C).
    6. 1x PBS 10 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) と 0.01 %2-メルカプトエタノールを含むソリューションをブロックの 200 μ L で自由な DNA を優しく洗い流す
      7. 。
    7. のためのソリューション (10 mg/mL 0.01 %2-メルカプトエタノール BSA) ブロック内のチャネルの孵化によってチャネル表面ブロック > 2 h; これはステップ後チャネルは実験のため準備ができています。4 ° C で準備されたチャネルを保つことができる 〜 1 日
      。 注: ブロックのステップは DNA と、coverslips に磁気ビーズの非特異的結合を減らすために重要です
      8. 。

3。磁気ピンセット セットアップおよび単一の識別 dsDNA テザー

  1. 磁気ピンセット セットアップ
    1. スタート磁気ピンセット制御プログラム。ここで、磁気ピンセットは社内記述の LabVIEW プログラムによって制御されたします
      2. 。
    2. は、チャネルをマウントする前に磁石の中心を合わせます。4 X 対物レンズを使用して顕微鏡の光軸に磁石の x 軸と y 軸を調整します
      3. 。
    3. はコンピューター制御の電動マニピュレーターを使用して z 方向 ( 図 2 a) 磁石を移動し、d との距離を設定 = 0 (d: coverslip の磁石との間の距離) 磁石を付けるとき顕微鏡を観察
      4. 。
    4. プログラム (つまり、定数 d) 一定の力を含む力の制御を達成するためにマニピュレーターを磁石の動きと時間変動力 F (t) (すなわち、時間変化 d(t)).
    5. は明るい目的をビーズの後方散乱照明用光源は発光ダイオード (LED) を使用します。電荷結合素子 (CCD) カメラで 100 Hz のサンプリング レートでビーズ画像を収集

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結果

この図の拡大版を表示するのにはここ。

figure-results-80
G4 の展開図 5: ジャンプ力測定。
力中にビード高さ変化 (A) 代表的な時間トレース 1 pN と 54 pN 10 DmRHAU、なしで測定のサイクルをジャンプ nM DmRHAU が、ATP、なしと両方が 10 nM DmRHAU と 1 mM ATP、図パネルに記載されています。(B...

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ディスカッション

上記、G4 DNA の力学的安定性と G4 を使用して蛋白質の相互作用を研究するためのプラットフォームとして、単一分子磁気ピンセットが報告されます。プラットフォームを伴い、G4 DNA テザーと折り畳み展開ダイナミクス計測とナノメートル特別決議と G4 の構造安定性を見つけることの非常に効率的なプロトコルが開発されています。フォーカル プレーン ロックにより非常に安定したのドリフ?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者が原稿を校正孟パンをありがちましょう。この作品はサポートによってシンガポール省の教育学術研究基金第 3 層 (MOE2012-T3-1-001) J.Y.; にJ.Y.; ことシンガポール メカノバイオロジー研究所を通じて国立研究財団国立研究財団、その NRF Investigatorship プログラム (NRF Investigatorship 賞号の下で総理大臣のオフィス、シンガポール、J.Y.; に NRF-NRFI2016-03H. Y に中央大学 (2017KFYXJJ153) の基礎的研究基金。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA PCR primersIDTDNA preparations
DNA PCR chemicalsNEBDNA preparations
restriction enzyme BstXINEBR0113SDNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)BMH.BIOMEDIA72204flow channel preparation
Decon90Decon Laboratories Limitedflow channel preparation
APTESSigma440140-500MLflow channel preparation
Sulfo-SMCCThermoFisher Scientific22322flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidinThermoFisher Scientific11205Dflow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μmPolysciences, Inc17145-5flow channel preparation
2-MercaptoethanolSigmaM6250-250MLflow channel preparation
Olympus Microscopes IX71OlympusIX71Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721Physik InstrumenteP-721Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100XOlympusMPLAPON-Oil 100XMagnetic tweezers setup
CCD/CMOS cameraAVTPike F-032BMagnetic tweezers setup
Translation linear stagePhysik InstrumenteMoCo DCMagnetic tweezers setup
LEDThorlabsMCWHLMagnetic tweezers setup
Cubic MagnetsSupermagneteMagnetic tweezers setup
LabviewNational InstrumentsMagnetic tweezers setup
OriginPro/MatlabOriginLab/MathWorksData analysis

参考文献

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905(2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113(2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

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