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要約

転写減衰率を監視および差動腐食の遺伝子を識別する生成する増殖の静止プライマリひと真皮線維芽細胞、プロトコルについて述べる。

要約

静穏化は、細胞が細胞分裂を停止しているが、増殖する能力を保持一時的なリバーシブルの状態です。私たちを含めた複数の研究は、静穏化が遺伝子発現の広範な変化に関連付けられているを示しています。これらの変更のいくつかはレベルまたは E2F と MYC などの増殖関連転写因子の活動の変更によって発生します。Mrna が細胞増殖と静止細胞間の遺伝子発現の変化にも貢献できると私たちを示しています。このプロトコルでは人間の皮膚包皮線維芽細胞の増殖と静止の文化を確立する手順をについて説明します。我々 は、アクチノマイシン d (ActD) 増殖と静止細胞に新しい転写を阻害する手順を説明します。ActD 治療は、トラン スクリプトの崩壊から新しい転写を分離する簡単で再現性のあるアプローチを表します。ActD 治療の欠点は ActD セル実行可能性に影響を与えるので、時間経過が短い時間枠に制限しなければなりません。転写減衰率を決定するための時間をかけて議事録レベルが監視されます。この手順は、遺伝子と対静止線維芽細胞増殖の差動腐食を示すアイソ フォームの同定できます。

概要

成績証明書の定常状態レベルは、トラン スクリプトの合成と転写減衰の両方の貢献を反映しています。調整され、調整された転写減衰は生物学的プロセス1,2,3、4を制御するための重要なメカニズム。たとえば、転写減衰率は、炎症性サイトカインの腫瘍壊死因子5次の活性化イベントの時系列に貢献する示されています。

我々 は以前に増殖と大人しいの主な線維芽細胞間の移行は多くの遺伝子6のトラン スクリプト レベルの変更に関連付けられています。これらの変更のいくつかはこれらの 2 つの状態間の転写因子の活性の違いが反映されます。

トラン スクリプトの減衰率の変化は、2 つの異なる状態7,8の謄本の発現レベルの変化にも貢献できます。増殖と静穏化の間の遷移が複数のマイクロ Rna は9レベルの変化に関連付けられている私たちの以前の調査結果に基づいて、変化の差分コピー崩壊からの寄与があるかどうかを聞きました対静止線維芽細胞増殖遺伝子発現。

トラン スクリプトの安定性を監視するために、我々 は対静止細胞増殖におけるゲノムワイドな転写産物の減衰率を決定しました。ために、我々 は新しい転写の阻害剤を導入し、個々 の成績証明書は時間をかけて姿を消したレートを監視によって対静止線維芽細胞増殖の減衰率を監視します。このアプローチの利点は、単に新しいトラン スクリプトの合成を阻害することによって全体的な遺伝子の発現を監視する方法と比較して我々 こと彼らが率から個別にこれらの転写産物の減衰率を決定することができます。転写。

ActD 治療新しい転写を阻害し、転写減衰率を決定するのには、複数の先行研究で正常に適用されています。ActD は炎症性サイトカイン5治療に起因するトラン スクリプト豊富に変更で RNA の安定性の重要性を分析する使用されています。同様のアプローチは、差別化された筋肉表現型10を採用するときに、C2C12 細胞の分化と増殖に転写減衰率の違いを分析する使用されています。別の例としてグローバル mRNA 半減は、多能性で検出されているし、差別化されたマウス胚性幹細胞11。これらの例では mrna は、細胞の異なった細胞状態への遷移、トラン スクリプトの豊かさを調整するために重要であると示されています。

下記の方法を適用すると、我々 は、線維芽細胞増殖と静止状態12を比較するときに約 500 遺伝子転写減衰率の変化を発見しました。特に、細胞活動の静穏化に移行とダウンレギュ レート静止細胞では、マイクロ Rnaミール-29に、ターゲットは安定しているがわかりました。我々 はここで増殖と静止細胞に減衰率を決定するための手法について説明します。この方法は急速に腐食の遺伝子に関する情報が求められている時に同様の条件が異なる 2 つの世界的な mRNA 減衰率を比較するのに便利です。2 3 つの次元文化対次元にトラン スクリプト崩壊に関する培養条件の影響など他の質問に対処するも使えます。減衰率はマイクロ アレイや RNA シーケンスまたは、リアルタイム qPCR などの方法で決定されたゲノムまたは北にしみが付くことは遺伝子に遺伝子またはアイソ フォームによるアイソ フォームごとに減衰レートを決定する使用できます。これらの料金は、各監視対象遺伝子の半減期を計算して減衰率の 2 つの条件の異なる遺伝子を識別するために、使用できます。

プロトコル

記載されているすべての実験は、プリンストン大学、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で制度上の審査委員会によって承認されました。

1. ActD 時間コースの増殖と接触抑制線維芽細胞を準備します。

注: このプロトコルは、4 つの縦長で、経時的を使用します。3 つの独立した生物学的サンプルが収集できる timepoint あたり 1 つの実験では、異なる組織培養プレートを収集または実験は、細胞の異なった文化で複数回繰り返すことができます。我々 の経験では、1 つ 10 cm (直径) 細胞培養用ディッシュ (ワンプレート) は、分析のため十分な RNA を提供します。必要な場合は、各サンプルを各 timepoint の細胞の数を増やすため複数のティッシュの培養皿をプールできます。さらに、真に独立した生物を複製と異なる個体から分離した線維芽細胞と同じ実験を実行できます。

  1. 転写減衰解析のための細胞の増殖と静止の文化を確立します。細胞増殖の接触阻害細胞は接触阻害になるで、セルを 3 日ごと分割します。
    1. 接触抑制細胞 7 日間ごとに 2 日間媒体を変更します。2 日接触抑制線維芽細胞はコレクションの準備ができている前に増殖中の細胞を分割します。細胞培養方式の例は図 1に示します。このセクションの残りの手順を確立して、セルの分割のための詳しいプロトコルを提供します。
  2. 確立したプロトコル13によると新生児皮膚から一次皮膚繊維芽細胞を分離します。同質な人口を確保するためには、繊維芽細胞を通過。
    注: 線維芽細胞が凍結、解凍、必要な場合。
  3. 解凍または必要な場合は、線維芽細胞を replate します。37 ° C、5% CO2で組織文化のインキュベーターで生殖不能の条件の下で 10% 血清 DMEM で線維芽細胞を成長します。10 未満の通路のために栽培されている線維芽細胞を使用します。線維芽細胞がする必要があります < の細胞増殖および静止人口を分割日 80% 合流。
  4. 組織培養プレートを複数の板に分割、PBS、トリプシン、および 20 分の 37 ° C の水浴の血清中を prewarm します。
  5. 吸引か replated するセル、各組織培養プレートからメディアを削除する、ピペットを使用します。
  6. 各プレート (板 150 mm、100 mm プレート用溶液 5 mL、2 mL 6 ウェル プレートの井戸のためのソリューションの 10 mL) と 1 mL 12 ウェル プレートのよく暖かい PBS をピペットで移しなさい。
  7. 吸引または各組織培養プレートから PBS を削除するピペットで移しなさい。
  8. 優しくピペット 1 トリプシン-EDTA 各プレート (150 mm プレート 100 mm プレート、6 ウェル プレートのウェルの 2 mL、12 ウェル プレートの井戸のための 1 mL の溶液 3 mL の溶液 8 mL) x。
    注: ください 1 トリプシン-EDTA によって滅菌 10 x トリプシン-EDTA 滅菌 PBS で x。最終の 1 x ソリューションは、0.05% 0.02% とトリプシン EDTA をする必要があります。
  9. 5 分間細胞とトリプシンを孵化させなさい。
  10. プレートから細胞を取り除くためプレートを軽くたたきます。
  11. 単一細胞懸濁液に細胞を再懸濁しますをピペットで移しなさい。
  12. 10% 血清 (150 mm プレート 100 mm プレート、6 ウェル プレートのウェルの 2 mL の溶液 3 mL の溶液 8 mL を DMEM の同じボリュームを含む円錐管にトリプシン溶液のセルを転送します。、、12 の井戸のための 1 mL はウェル プレートと)。
  13. トリプシンを削除する 1,000 x gで 5 分間の 4 ° C でセルを回しなさい。
  14. 細胞濃度計算盤と培地およびカウントの適切なボリュームで細胞を再懸濁します。
  15. 増殖のための 100 ミリメートル組織培養プレートごと種子 5 x 105細胞と接触阻害細胞。
  16. このメソッドを使用して、分析 (図 1) に必要な増殖と接触抑制のサンプルを確立します。

2. ActD 時間コース

  1. ストック濃度 1 mg/mL (ActD、使用 950 μ L の滅菌 PBS と滅菌 DMSO を 50 μ l 添加のため 1 mg) の ActD 再懸濁します。
    注: ActD の冷凍ストック ソリューション必要があります安定-20 ° C で 1 ヶ月希薄溶液は破棄され、さらに使用するため保存されませんする必要があります。
  2. すべての生物の複製細胞培養プレート、ActD prewarmed 媒体の適切なボリュームに追加 480 分縦長 (図 2)、240、120 0 のために設定されました。媒体の mL あたり 15 の μ g の濃度で ActD を追加します。よく混ぜて、古い媒体を離れて吸い出しなさい、ActD 含有培地をセルに追加します。
    1. 1 mg/mL 在庫 15 μ L を追加各媒体、例えば、100 mm プレート培地 10 mL の mL の ActD 追加 150 μ L ActD。
  3. 優しく、ActD 中、ピペットを離れて吸い出しなさい、ゼロの timepoint サンプルを収集するには、セルに PBS を prewarmed しました。150 mm プレート 100 mm プレート、6 ウェル プレートのウェルの 2 mL、12 ウェル プレートの井戸のための 1 mL の溶液の 5 mL の溶液 10 mL をピペットで移しなさい。
  4. 優しく吸引または PBS をピペットで移しなさい。
    注: RNA の隔離に関連するすべての手順は、RNase フリー水、RNase フリー マイクロ遠心チューブ用、RNase フリーのピペットと実行必要があります。手袋を着用、RNA を使用するときに頻繁に変更する必要があります。
  5. 組織培養プレートに直接フェノール グアニジン イソチオ シアン酸ソリューション (4 × 105 4 x 107セルに 1 mL/10 cm 板) を追加します。
    注: フェノール グアニジン イソチオ シアン酸のソリューションは、細胞を溶解しお互いから RNA、DNA および蛋白質を分離する RNA の品質を保持する単相性ソリューションです。
    注意: フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸、腐食性です。適切な保護を使用します。
  6. 均質な混合物を作るために数回上下のピペット フェノール グアニジン イソチオ シアン酸溶液セルの混合物。
    注: 一夜の 4 ° C または-20 ° c で 1 年までは、フェノール グアニジン イソチオ シアン酸ソリューション ライセートを格納できます。
  7. 手順 2.3 2.6 で説明されているメソッドを使用して適切な時間が経過した後は、時間の各ポイントを収集します。

3. フェノール グアニジン イソチオ シアン酸溶液ライセートからの総 RNA の隔離

  1. サンプル RNA 蛋白質の複合体の完全解散できるように 5 分間室温で孵化させなさい。
    メモ: フェノール グアニジン イソチオ シアン酸解決のプロトコルの手順は特に断らない限り、室温で実行できます。
  2. 使用方法と検出することができますスパイクの制御成績をご紹介します。
既知の量と濃度で各サンプルにこれらのコントロールを導入します。
注: 外部 RNA 制御コンソーシアム (ERCC) スパイクの制御ミックス14は特に設計されてスパイクのコントロールとしての RNA シーケンスそれは北のしみまたはリアルタイムの qPCR の使用もできます。スパイクのコントロール専用マイクロ アレイ技術の利用 (材料の表を参照) があります。
  • フェノール グアニジン イソチオ シアン酸溶液をピペットで 2.0 mL 遠心チューブに転送します。フェノール グアニジン イソチオ シアン酸液各 1 mL のフェノール グアニジン イソチオ シアン酸溶液に 0.2 mL のクロロホルムを追加 (例えば、1.5 mL フェノール グアニジン イソチオ シアン酸溶液 0.3 mL のクロロホルムを加える)。
  • 15 精力的に遠心チューブを振る s 3 分間室温でクロロホルム フェノール グアニジン イソチオ シアン酸の混合物をインキュベーションしてと。
  • 4 ° C で 20 分間、12,000 × gでサンプルをスピンします。
    注: 初期のスピン後サンプル分ける必要があります 3 層の一番下、真ん中のホワイト/ピンクの中間期で赤有機層と (図 3) の上に透明な水溶液層。
  • マイクロ ピペットを使用して新しい 2.0 mL 遠心チューブに水層を転送します。
    注: この処理中に相間を邪魔にならないように気をつけてください。水性画分のいくつかを残しても大丈夫です。層も中間期を含むものとして、界面層のいくつかを含むように DNA と RNA を汚染するだろうよりも水性画分のいくつかを残すことをお勧めします。水層になります約最初のボリュームは、約 0.9 mL の半分フェノール グアニジン イソチオ シアン酸のソリューション/クロロホルム混合 1.8 mL であった場合。
  • 中間期および有機分画を破棄します。
  • 水性画分に 2-プロパノールの等量を追加し、10 回チューブを反転します。特に場合は、利回りが低いと予想されるよりも少ない 106細胞を採取したので最大 1 μ L あたり 20 μ L のサンプルでは、グリコーゲンの水溶液を 20 mg/mL を追加します。
    注: これはスピン手順に後を監視しやすい高密度、固体ペレットになります。
  • サンプル 10 分室温で孵化させなさい。
  • 4 ° C で 20 分間、12,000 × gでサンプルをスピンします。確認、このスピンの終わりに、RNA を沈殿しているチューブの下部に白いペレットを形成します。
  • ピペット、削除し、白の RNA ペレットを邪魔しないように特別な世話をして上澄みを廃棄します。
    注: 手で開催された緩やかなピペットの先端部は、余分なエタノールを削除する使用できます。RNA ペレットは妨げ、破棄されない場合、捜査官はスピンを繰り返し、上澄みを再度削除できます。これは全体の手順を繰り返す捜査官を必要とペレットを破棄することは避けてください。
  • 75% エタノールおよび 25% ヌクレアーゼ フリー水のソリューションを準備します。ペレットを洗浄するフェノール グアニジン イソチオ シアン酸液試薬 1 mL あたり 75% エタノール 1 mL を加えます。
  • 4 ° C で 10 分間、12,000 × gでサンプルをスピンします。
  • 上澄みのほとんどを除去した後まだペレットを邪魔しないように世話をしながら、可能な限りに多くのエタノールを削除するのに、ピペットを使用します。
    注: RNA の餌が少ないこのステップでコンパクトと移動する傾向があります。RNA を失うことを避けるためにこの時点でペレットを処理するときに余分な注意してください。
  • すべての余分なエタノールをペレットを室温で 2 分間サンプル 12,000 × gをスピンします。
  • ペレットを邪魔しないように世話マイクロ ピペットを使用してチューブからすべての余分なエタノールを削除します。
  • RNA ペレットの空気が 5 分間乾燥してみましょう。
  • RNA の餌にヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L を追加し、ヌクレアーゼ フリー水にペレットを再懸濁します。
  • 1 μ L のサンプルを扱う DNase (2 単位/μ L) DNA を削除し、DNase と陽イオン (材料の表を参照) を不活化します。
  • -80 ° C で 2.0 mL マイクロ遠心チューブ用の RNA サンプルを格納します。

    • 4. 豊富なトラン スクリプトの解析

    1. RNA を定量化し、分光光度計を使用して純度の RNA をチェックします。
      注: 260 で吸光度の比 280 nm nm が RNA に 2.0 約をする必要があります。
    2. 1% アガロースゲルまたは劣化の程度を可視化する等価技術を持つ RNA を分析します。
      注: 2 つをオフに 18 秒を表すバンド、28 s rRNA が明確に表示されます (図 4) をする必要があります。これらのバンドが表示されていない場合は、RNA を低下可能性があります。議論は、RNA の劣化のトラブル シューティングのヒントを提供しています。
    3. RNA の収集の因数でモニターのトラン スクリプトの豊富な比較でスパイク内部標準マイクロ アレイ15、RNA Seq16リアルタイム qPCR17、または北のしみ18。
      1. 知られている豊かなスパイクの制御と比較して各時点で各議事録の豊かさを決定します。
        注: マイクロ アレイ、値になります蛍光強度。北のしみのため x 線フィルム上のバンドを定量化することができます。リアルタイム qPCR の 2- σσCT法19の知られている基準との比較による豊富なトラン スクリプトを決定できます。RNA シーケンスの正規化された値は、FPKM またはマップされたリードの百万エクソンのプラスミドあたりの断片として算定できます。アイソ フォーム固有減衰率 DEXSeq20などのアイソ フォームに対応の方法論を使用して RNA シーケンス データを分析できます。アイソ フォーム固有の減衰率が最高の RNA シーケンスの決定します。マイクロ アレイ データで決定する場合は、データが遺伝子によ遺伝子単位ではなく、プローブ、プローブごとに分析する必要があります。アナリストは、プローブの限られた数からの情報を解釈するときに注意しなければなりません。たとえば、特定のアイソ フォームについて有益 5 以下のプローブがあります。この場合、アナリストは、これらのプローブの動作が十分に一貫したで、結果が信頼できるかどうかを判断する必要があります。
    4. 孤立した RNA17 C-myc と自信料金は正確に検出されたその転写減衰の GAPDH のようなゆっくりと減衰の遺伝子のような急速に減衰の遺伝子を分析する収集されたサンプルでリアルタイム qPCR を実行します。
      注: 詳細確認のためアイソ フォーム固有のリアルタイム qPCR プローブを開発して使用できる時間21上特定のアイソ フォームの豊富さを監視します。

    5。崩壊速度定数決定法

    1. 各 timepoint の各議事録 (遺伝子やアイソ フォーム固有) の豊富な値を対数変換します。
      注: ログ変換値に変換されます指数関数的減衰曲線線形減衰モデル22で合うことができる線。
    2. 各トラン スクリプト (遺伝子やアイソ フォーム固有) 線形減衰モデルの表現のプロフィールに合います。このようなモデルの式は、f(t) = C - r * t。この方程式のトラン スクリプトの開始量を表す定数、C は、r は、減少の率、t は時間、実験の初め以来。この方程式から r*ln(10) として減衰率を決定する (参照11参照)。
      注: maSigPro ソフトウェア パッケージは時間コース データ23重大な遺伝子発現プロファイルの違いを検出するために設計された、回帰ベースのアプローチです。サンプル コードや maSigPro の結果: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf。
    3. 対数線形減衰モデルに合わせて失敗する遺伝子を除外します。これは、分散分析の F 検定を実行できます。
      注: F 検定は F 統計量、バリエーションとして定義されているに基づくサンプル内のバリエーションで割った値のサンプルの平均値の間。リニア ステップ アップ Benjamini、ホフベルク虚偽の発見手順24を用いて多重比較の p 値を修正します。F 検定と 0.05 より大きい q 値は、対数線形減衰モデルに合わせて失敗する遺伝子のためのカットオフとして使用できます。
    4. カテゴリの細胞周期条件および時間の間に有意な相互作用期間の成績証明書を決定する分散分析の F 検定を実行 (虚偽の発見率、FDR < 0.05)。

    結果

    については 8 時間コース12以上増殖と接触抑制の主なひと繊維芽細胞の転写減衰率のマイクロ アレイ解析の結果を報告しました。トラン スクリプトの安定性増殖と接触抑制線維芽細胞を比較することに大きな変化と遺伝子の一覧は、補足表 1に提供されます。時間 0 で、ActD 治療後経時的に蛍光強度を提供しています。遺伝子は、分散分...

    ディスカッション

    静穏は、mitogen や血清の撤退、細胞接着と接触抑制の欠如を含む外部信号によって誘導されうる。接触阻止、静穏化を誘導するための複数の可能な方法の 1 つは、細胞が増殖細胞周期細胞間接触の応答を終了高度進化上保存されたプロセスです。我々 はここで静穏化を誘導する方法の一例として接触阻止に注目します。以前の研究報告していること細胞細胞の接触することができますマイク?...

    開示事項

    著者は開示する競合する興味を持ってないです。

    謝辞

    HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。卓越したグラント P50 GM071508 の国立総合医学研究所センターから拍 (探偵デビッド ボットスタイン)、PhRMA の基盤助成金 2007RSGl9572、1047879 デビッド 8 月 - 国立科学財団助成 OCI に補助金によって資金が供給されたこの作品一般的な医学 R01 GM0866465、Eli の所一般医療科学 R01 GM081686 研究所 & エディス ブロード センター再生医療の & 茎細胞の研究、アイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIHグラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC、イーライのメンバーである & エディス広い再生医療センター & 幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所とカリフォルニア大学ロサンゼルス校バイオインフォマティクス部門間プログラム。

    資料

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
    Equipment for running agarose gels
    Sterile tissue culture plates and conical tubes
    Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
    Fetal bovine serumVWR35-010-CV
    Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
    Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
    Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
    RNaseZapInvitrogenAM9780For decontaminating work surfaces from RNase
    2.0 ml eppendorf tubes
    Trypsin-EDTA  Solution 10XMillipore Sigma9002-07-07
    Sterile PBSLife Technologies14190-250
    TrizolThermo Fisher Scientific15596018
    Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mginhibits transcription
    Sterile DMSOFisher Scientific31-761-00MLsolvent for actinomycin D
    ChloroformThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc product
    IsopropanolFisher ScientificBP2618500molecular biology grade
    EthanolFisher ScientificBP28184molecular biology grade
    RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)Thermo Fisher ScientificR0551carrier for RNA precipitation
    TURBO DNA-free KitThermo Fisher ScientificAM1907removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
    AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc product
    Loading dye for RNA gelThermo Fisher ScientificR0641suitable even for denaturing electrophoresis
    Millenium RNA markersThermo Fisher ScientificAM7150RNA ladder
    One-color RNA Spike-in KitAgilent Technology5188-5282Example spike-in control for Agient microarray analysis
    Tris baseFisher ScientificBP152-1molecular biology grade, for TAE buffer
    Glacial acetic acidFisher ScientificA38-500for TAE buffer
    EDTAFisher ScientificBP120-500electrophoresis grade, for gels
    Ethidium bromideMillipore SigmaE7637for molecular biology
    External RNA Controls Consortium RNA Spike-in MixThermo Fisher Scientific4456740Spike-in control for RNA Seq
    TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)IlluminaRS-122-2101for RNA Seq
    96-well 0.3 ml PCR plateThermo Fisher ScientificAB-0600for real-time qPCR
    Microseal B adhesive sealsBio-RadMSB1001for real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free Reagent ReservoirsVWR89094-662for real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free Eight tube strips and capsThermo Fisher ScientificAM12230for real-time qPCR
    SuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010for real-time qPCR
    AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880for real-time qPCR

    参考文献

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