機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

要約

このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)_{180 199}ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN の発生病理の程度を正確に評価することができる洗練されたパラダイムを提案します。

要約

実験的自己免疫性視神経炎 (EAN) は自己免疫性末梢脱髄性疾患の実験モデルの当然です。EAN 病による神経因性ペプチドを持つマウスを免疫末梢神経系 (PNS) のコンポーネントに向かって炎症性攻撃を指示します。最近の進歩は、ミエリン蛋白ゼロ (P0)_{106 125}や P0_{180 199}ペプチド百日咳毒素の注入と組み合わせる補助で配信を使用して比較的耐性の C57BL/6 マウス ラインで EAN の誘導を可能にしました。C57BL/6 株に EAN を誘導する能力により、このマウスの背景に存在する多数の遺伝的ツールの使用とように洗練された病因学とで治療のメカニズムのアクションの尋問形質との組み合わせ。本研究では、c57bl/6 マウスで P0_{180 199}ペプチドを用いた EAN を正常に誘導する単純なアプローチを示しています。我々 はまた、このモデルでは、神経病理学的機能の配列を伴って発生する機能的障害の評価のためのプロトコルを概説します。したがって、このモデルは強力な実験的モデル人間の末梢脱髄性ニューロパチーの病態を研究し、目的を髄修復を促進し、自己免疫の神経損傷に対する保護潜在的な療法の有効性を判断炎。

概要

末梢神経障害は起源で遺伝的または後天的のいずれかをすることができます取得したニューロパシー、どちらの代謝、虚血、炎症、または有毒な沈殿を持ちます。これらの疾患も便利、軸索または起源の demyelinative のいずれかに分類されます。最も一般的な脱髄性末梢神経障害、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (AIDP、ギランバレー症候群、ギランバレー症候群とも呼ばれます) を取得し、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (CIDP)^1,2,3,4;両方は pathogenetically、末梢神経の脱髄を引き起こす、髄鞘に対する自己免疫反応によって特徴付けられます。これらの疾患における活性化 T 細胞は血液神経関門を通過し、PNS 内免疫反応を生成します。神経内マクロファージの活性化、貪食攻撃を介して直接、または麻痺など感覚機能障害⁵臨床的障害の結果分泌の炎症性メディエーターを介して間接的に脱髄を引き起こします。脱髄軸索は、remyelinated 次の脱髄をする能力を保持しながら検査がよく遅れているまたは恒久的な臨床の主な原因である不完全な不可逆的な損傷は、裸の軸索の感受性の結果障害者。現在、最も効果的な治療法は、免疫調節、しかし多くの場合その有効性にもかかわらず、回復はしばしば遅いと 〜 25% の患者は彼らの生活の質の^{6を大幅に削減残留の機能的障害を経験 7}。

EAN は、貴重な洞察を病態と新規治療薬⁴を評価する手段を提供している末梢神経障害を脱髄の広く使用されている動物モデルです。このモデルは、種、ウサギなどに誘起することラット、マウス、モルモット、および神経因性抗原接種によって誘導されます。しかし、最終的に成功の EAN 誘導が発生する病気のための適切な免疫反応に依存します。免疫機能で種・種間・ひずみの変化を考えると、抗原とアジュバントの複数の組み合わせは、EAN を正常に誘導するために開発されています。マウスの遺伝学的ツールに関して C57BL/6 は最も広く使用されています。しかし、伝統的な P2 タンパク質ペプチド 57-81 (P2_{57 81}) SJL マウスひずみ⁸の影響を受けやすい病気の結果は、C57BL/6 株の機能障害につながる違法な病因にはできません。幸いにも、感作性パラダイム P0_{106 125}または P0_{180 199}ペプチドを使用して配信補助療法併用百日咳の注入と毒素に活用される高度な遺伝的ツールを有効にするこの障壁を克服することができます、EAN マウスモデル。

ここでは、簡便な c57bl/6 マウスに EAN の誘導が表示されます。さらに、病気に関連付けられている機能と神経病理学的赤字を評価する包括的な詳細なアプローチを提供しています。P0_180-199ペプチド⁹は、P0_{57 81}代替¹⁰優先して選ばれました。P0_180-199モデル P0_{57 81}代替¹⁰と比較して少ない重度の臨床症状を生成する記載されている、したがって潜在的の導入に耐えられる可能性は劇物の遺伝的摂動 (浸透圧ポンプ注入) などの手術から回復、トレッドミル歩行機能⁴のテストを受けやすいです。ただし、トレッドミル歩行機能検査と組織のプロトコルがここで説明した簡単に適用でした P0_{57 81}誘起変形の疾患を勉強しています。

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プロトコル

ここで説明したすべての手順 Florey 研究所神経科学と精神的健康 (メルボルン脳中心部) 動物倫理委員会で承認されて、科学的研究の動物の使用のためオーストラリアのコード練習に従う目的.

1。 EAN 誘導

注: EAN は 6-8 週間の間高齢者男性の c57bl/6 マウスで正常に誘起すること。誘導のプロトコルは、合計 9 日間です。0 日は、最初の予防接種の日を指します。このプロトコルのため麻酔注射を行った (1.1.2 以下の手順を参照してください).

1. 日-1:
   1. 百日咳毒素を準備 1.6 μ g/mL 滅菌 0.1 M マウス等張性リン酸を使用して (材料の表 を参照) 溶液緩衝生理食塩水 (MT PBS).
   2. とイソフルレン anesthetization:
      1. anesthetization 室でマウス (C57BL/6、男性、6-8 週間) を置き 1 L/分に酸素の流れを調整
      2. イソフルラン気化器をオン、anesthetization、および呼吸モニターの 2.5% にそれを調整し、待機、2 分間またはプライマリ反射 (角膜と後肢骨格筋) までは、もはや応答
   3. Anesthetization 室からマウスを削除し、250 μ L の 30 ^1/2 G 針で 0.5 mL シリンジを使用して腹腔注射を介して上記の百日咳毒素ソリューションを管理します
   。
   4. 予防接種の注射接種の準備:
      1. 準備 ソリューション A P0 _{180 199} ペプチドの 2 mg/mL の溶液を使用する (と > 98% の高純度、シーケンス S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 生理食塩水中で
      。
      2. 準備 ソリューション B 結核 菌 20 mg/mL の溶液を使用して (材料の表 を参照してください) フロイントの ' s 完全アジュバント (FCA で構成される: 15% mannide monoolate + パラフィン オイルと 0.5 mg/mL の 85%乾燥殺され、乾燥した 酪酸菌結核菌 M) の
      。
      3. 、注入するため最終接種するビード ・ ビーターでソリューション A と B の等しいボリューム部分を組み合わせるし、室温で 1 分最大速度でそれらをミックスします
         。 注: A と B のソリューションことがあります在庫として保管 1 ヶ月の最大のための 4 ° C で保存、マウス注入の日に結合された最終的な接種をたて準備しなければなりません
      。
2. 0 の日に管理 50 μ L 接種 (準備手順 1.1.4 に示した) の皮下注射器 23 G 針を使用して経由でマウスにします
   。 注: 注射に使用される肩甲骨の間または後肢と尾の間尾背
。
3. 日 1 には (MT-PBS) 内 1.2 μ g/mL の百日咳毒素ソリューションを行い 30 ^1/2 G 針で 0.5 mL シリンジを使用して i. p. 注入を介してマウスに 250 μ L を管理します
。
4. の日 3、繰り返しステップ上記 1.3.
   注: 在庫ソリューション A と B が成って、1 ヶ月の最大のための 4 ° C で保存します。ただし、在庫ソリューション A と B を組み合わせることによって生成された最終の注射接種は注射の日に行う必要があります
。
5. 8 日管理 50 μ L 接種 (準備手順 1.1.4 に示した) の皮下注射を介してマウスに (上記 1.2 のステップを参照)、ステップ 1.2 (動物) と同様に同じ注射部位の

2 臨床得点

1. 毎日開始 0 日目にうちの臨床スコアを実行します。
。
2. は、各マウスに 0、1、2、3、または ⁴ 基準によると 4 のスコアを与えます。EAN 臨床スコアの 表 1 を参照してください
   。 注: 一貫性を保つのための努力すべきである同時にマウスをスコアに毎日同じ研究者によってします
。

3。関数評価をモーター

注: 動物の同じコホート臨床スコアと並行して運動のパフォーマンスを評価します。運動機能評価装置は、歩行機能のイメージング システム (材料の表 を参照してください) がインストールいることコンピューターに接続する必要があります。評価されるすべてのマウスに EAN 誘導する前に実行中のタスクに慣れる必要があることをお勧めします。これを行うには、練習走行 (マウスあたり 2 テスト実行) 疾患誘導 (日-3) の前に 3 日間実行します

。

1. 運動機能評価装置と光ボタンのスイッチをオンにします
。
2. 首筋マウスしっかりとしっぽを押しながら赤インクを入れた容器にそれを下げることによってその足をインクと
   。 注: この手順は C57BL/6 株、白衣の色を持つマウス株が使用されている場合はスキップできます
。
3. ウォーキングのコンパートメントにマウスを置きますと 15 cm でトレッドミルの速度を設定/秒
4. トレッドミルとクリックをオン、" 記録 " イメージング システム歩行機能を使用してマウスの実行中の動きをキャプチャするボタン (材料の表 を参照してください).
5. タイマーを使用し、36 の各実行を測定 s。36 s があり、録音を停止、停止、トレッドミル後
   。 注: この 36 秒間隔の実行中のタスクを正常に完了できないマウス失敗したと見なされます
。
6. 指定したフォルダーにビデオ ファイルを保存します
。
7. は、評価される各マウスの上記手順を繰り返します。ごとに 3 日間同じの実行中のタスクにマウスをテストします
。
8. 歩行関数パラメーター (材料の表 を参照) のソフトウェアを使用して編集されたビデオ ファイルを分析します
   。 メモ: 異なる運動パラメーターを分析する方法の詳細について異なるソフトウェア間でだから、製造元を参照してください ' 解析の前に s 命令。軸索の組織学的証拠を得るために、免疫組織化学または電子顕微鏡、動物、任意段階ポスト運動機能評価における特定の目的に応じて研究組織を取ることができるのいずれかを介して髄損傷
。

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結果

P0_{180 199}ペプチド誘導 EAN C57BL/6 マウスつながる相性疾患臨床スコア 25 dpi から最初の予防接種 (dpi)、および最大スコアの重大度を観察 6 日後から発症後いくつかの臨床スコア 40 dpi から改善期間 (図 1)^4,9。歩行機能面でマウスは 6 dpi として早めに単純な実行中のタスクに失敗して 35 dpi のマウス?...

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ディスカッション

このレポートでは、誘発 EAN c57bl/6 マウスで P0_{180 199}ペプチドを用いた、EAN がマウスのキー神経病理学的および機能欠損の定量化を可能にする簡単な方法について説明します。ここで記述されている EAN 誘導プロトコルは予防接種の注射を実行しながら麻酔の使用異なるです。イソフルラン麻酔の使用は、接種量が最小限のエラーと、動物へのストレスを目的の場所に皮下に注射される...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc