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要約

本稿では、マウスの骨髄から破骨細胞形成の複雑な 1 ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの役割を研究する分離と培養破骨細胞の in vitroにプロトコルについて説明します。

要約

破骨細胞が骨吸収をユニークな細胞を骨髄単球/マクロファージ系統から分化します。破骨細胞の機能不全、骨粗鬆症を含む骨代謝疾患のシリーズあります。病的骨の質量損失の防止のための医薬品のターゲットを開発するには、破骨細胞を前駆体から区別するメカニズムが理解されなければなりません。分離し、培養破骨細胞の多数の文化能力は破骨細胞分化における特定遺伝子の役割を決定するために重要です。破骨細胞の複雑な 1 (TORC1) ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの不活化する破骨細胞数が低下し、骨の量を増やすただし、基になるメカニズムのさらなる研究が必要です。本研究では RANKL ベースのプロトコルを分離し、培養マウス骨髄から破骨細胞と破骨細胞形成における mTORC1 不活性化の影響を研究する、説明します。このプロトコルは正常に 1 週間以内通常巨大な破骨細胞の多数で起因しました。ラプターの削除は、破骨細胞形成を障害者し、その mTORC1 が破骨細胞形成のためクリティカルを示す分泌の酒石酸耐性酸性ホスファターゼの活性が低下します。

概要

骨は絶えず変化する臓器で、骨芽細胞と破骨細胞は生涯で改造します。破骨細胞は、無機マトリックス吸収と骨芽細胞が合成し、新しいボーン行列1を分泌します。骨吸収と骨形成のバランスは骨の維持を含む骨の健康にとって重要な質量と刺激や損傷に応答します。このバランスを中断すると、骨粗鬆症と歯周疾患を含む、一連の骨代謝性疾患が発生します。これらの疾患では、破骨細胞性骨吸収による骨の質量損失は骨形成骨芽細胞2,3の容量を超えています。したがって、骨粗鬆症など骨格の疾患を治療する医薬品ターゲットを開発するために、世代や4破骨細胞の生物学を理解する重要です。

破骨細胞または骨の表面近くにあるユニークな巨大な多核巨細胞の細胞、単球/マクロファージ家族1に属する。イボットソン k. j.ら1, 25-ジヒドロキシ ビタミン D35を含む培地で培養破骨細胞様細胞を生成する手法について報告します。破骨細胞形成の本質的な要因としてマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体を活性化因子の同定には破骨細胞形成体外の効率が大幅に増加します。1,6,7. 世代の我々 の理解と破骨細胞の制御に培養破骨細胞の in vitroに能力は向上します。

2 つの構造的、機能的に異なる錯体、すなわち mTORC1、mTORC28,9ラパマイシン標的 (mTOR) 関数の哺乳類/機構対象。2 つの多蛋白質の複合体は異なった部品および下流の基板による互いから区別されます。mTORC1 には mTORC2 には mTOR (Rictor)9のラパマイシンを区別しないコンパニオンが含まれている mTOR (ラプター) のユニークな規制関連タンパク質が含まれています。mTORC1 は統合し、細胞の増殖、増殖と分化の調節に重要な信号を送信できます。最近、その mTORC1 破10で mTORC1 を不活化するラプターの削除によって異化骨吸収のネットワーク キー役割を果たしてデモンストレーションを行った。ただし、基になるメカニズムのさらなる研究が必要です。野生型 (WT) とラップのCtskマウスの骨髄由来マクロファージ (BMMs) から破骨細胞を生成し、破骨細胞に mTORC1 不活性化の影響を研究する本研究 RANKL ベースの osteoclastogenic メソッドを使用しました。形成します。

プロトコル

動物に関する各種手続きスタンフォード紛争処理パネル研究所動物ケア (APLAC) のによって承認されたプロトコルに従って行われ、動物愛護、上海研究所の生化学と細胞の利用委員会によって承認されました。生物学。

1. 準備

  1. 破骨細胞特定ラプター削除マウス (ラプターフロリダ州/フロリダ; を生成します。Ctsk cre、 Ctskラップ来世)ラプターフロリダ州/フロリダ州 Ctsk creマウス マウスの交配による。本研究では WT コントロールとしてラプターフロリダ州/フロリダマウスを使用します。
  2. 分離骨を保つために氷が付いている容器があります。
  3. 培養液を準備します。
    1. 1 x グルタミン、ペニシリン ・ ストレプトマイシン, 10% 牛胎児血清と最小必須培地アルファ (α-MEM) を補うことで α MEM 培地を準備します。
    2. 骨髄マクロファージ誘導培地 20 ng/mL で α MEM 培地および M CSF の 50 mL の構成を準備します。
    3. 破骨細胞誘導培地から成る M-CSF と RANKL 20 ng/ml、それぞれ α MEM 培地 50 ml を準備します。
  4. トラップに汚れる前に次のバッファーを準備します。
    1. 0.8 mL の 37% (巻/巻) ホルムアルデヒド溶液クエン酸溶液 2.5 mL、アセトンの 6.5 mL から成る修正ソリューションを準備します。
    2. トラップの染色液を準備します。
      1. 37 ° c. に脱イオン水を prewarm します。
      2. 1.5 mL マイクロ チューブに高速ガーネット GBC 基本ソリューションの 100 μ L との亜硝酸ナトリウム溶液 100 μ L を加え、混ぜる 30 s. 休暇の穏やかな逆解析による 2 分放置する混合物。
      3. 脱イオン水 37 ° C の prewarm 9 mL1.4.2.2、ナフトール AS BI リン酸液、酢酸溶液を 400 μ l 添加、酒石酸溶液 200 μ L を 100 μ l 添加のステップから高速ガーネット ジアゾ GBC 基本ソリューションの 200 μ L を追加します。
      4. 37 ° C の水浴中で混合液を染色トラップを維持します。
  5. 培養液中のトラップ活動定量化する前に次のバッファーを準備します。
    1. 酒石酸バッファー (50 mL) を準備: 0.33 M L - 酒石酸、0.33 M 酒石酸二塩基ナトリウム 48 mL の 2 mL の水分を取り除きます。4.9 に pH 値を調整します。
    2. 4-ニトロフェニル リン酸二ナトリウム (同時) バッファー (200 mL) を準備: 180 mL の脱イオン水、ZnCl2、27.2 mg MgCl241 mg グリシンの 1.502 g。3 M NaOH で 10.4 に pH 値および脱イオン水と 200 mL にボリュームを調整します。
    3. (1 つの 96 ウェル プレート) の脱燐酸化酵素の基質との同時バッファーを準備: ホスファターゼ基板のステップ 1.5.2 の同時バッファーの 175 μ L 49.37 mg。
    4. 基板バッファー (9 mL/96-ウェル プレート) を準備: 6.24 mL の脱イオン水, 酢酸溶液の 360 μ L と 2.4 mL の酒石酸バッファー。渦によって混合し、使用前に 37 ° C で予熱します。
    5. 予熱した基板 buffer(1.5.4) 基板の混合物と 10 の渦の 9 ml に, 耐バッファーとホスファターゼ substrate(1.5.3) の 90 μ L を追加 s。

2. 郭清 (日-1)

  1. CO2 3 1 ヶ月齢の雌の WT とラップCtskマウスを別々 に安楽死させます。訓練された人員によって適切な装置を持つ CO2吸入を実行します。
  2. 75% エタノール (巻/巻) 細菌汚染を防止し、仰臥位で郭清ボードの上に 5 分間の 100 mL のビーカーに 6 匹のマウスを浸します。脛骨の遠位部に縦切開をするそして眼科用ハサミで後肢に沿って皮膚を解剖します。
  3. 股関節の関節の靭帯をハサミで切って、トランクから後肢を脱臼します。
  4. 膝関節の関節の靭帯を切り、慎重に脛骨と大腿骨、膝関節から関連付けを解除します。ハサミで軟部組織を慎重に取り外します。
  5. 氷の上 α MEM の 2 mL の 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 つ 1 つのマウスの遺伝子型のすべてのボーンを配置します。
    注意: セル実行可能性を維持するために、骨は 1 時間未満をこれらの条件で保管すべき。

3. 分離 (日-1)

  1. Α MEM 培地 (3 mL) で 75% エタノール (3 mL) 6 ウェル プレートのウェル 1 個と他の 5 の井戸を埋めます。
  2. 1 つの遺伝子型のすべてのボーンを入れて 5 回 10 α MEM 培地で 15 s と洗って骨のエタノール洗浄 s たびに。
  3. シザーと骨を断つ、50 mL の遠心管に α MEM 培地でのうち、骨の空洞とフラッシュの骨髄に 0.45 mm 注射針を挿入します。
  4. 骨のもう一方の端から同じメソッドを使用して骨の空洞をフラッシュします。骨が薄いまで骨空洞を徹底的に洗うが、少なくとも 2 回繰り返します。
  5. 遠心分離機の骨髄細胞ペレット 800 x g で 5 分吸引清 4 ° C を取得します。
  6. 遠心分離機管と骨髄を再懸濁します優しくピペットに赤血球細胞の換散バッファーの 3 mL を加えます。赤い血液細胞を溶解する 8 分間氷の上遠心管を保ちます。
  7. セル換散を停止する遠心管に α MEM 媒体の 6 mL を追加します。500 x g と 10 分のための 4 ° C で遠心し、上清を吸引します。
  8. Α MEM 培地 3 mL に再懸濁します、6 ウェル プレート (ウェルあたり一般に 1 つのマウス) にセルを配置します。
  9. 37 ° c 5% CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。

4. めっき (0 日)

  1. 未接続のセルに次の朝を収集するために 15 mL 遠心チューブに上清を転送します。
  2. 800 x g と 5 分の 4 ° C で遠心し、上清を吸引します。
  3. Α MEM 培地 4 mL に再懸濁します。
  4. 携帯ソリューションの 20 μ L を取るし、トリパン ブルーの 20 μ L で混ぜます。カウントの商工会議所に混合物の 10 μ L を追加し、ソリューションの mL あたりのセル数を取得します。
  5. Α MEM 培地 500,000 セル/mL のセル解を得るための適切な量を追加します。
  6. それぞれ 500 μ L と骨髄マクロファージ誘導培地の 50 μ L を 24 ウェル プレート、96 ウェル プレートの各ウェルに追加します。
  7. それぞれ 500 μ L とセル溶液 50 μ L を 24 ウェル プレート、96 ウェル プレートの各ウェルに追加します。
  8. 3 日間、37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。

5. 分化 (日 3-7)

  1. めっき後, 3 日 96 ウェル プレートの各ウェルから 50 μ L の培地を収集-20 ° C の凍結し、残留の培地を吸引します。
  2. それぞれ 1 mL と 100 μ L 破骨細胞誘導培地を 24 ウェル プレート、96 ウェル プレートの各ウェルに追加します。
  3. 37 ° C で 2 日間インキュベートします。
  4. 各ウェルから媒体の 50 μ L を収集し、残留の培地を吸引します。
  5. 各ウェルに破骨細胞誘導培地を追加します。
  6. 37 ° C で 1 日間インキュベートします。
    注: この時点で大きい、多核巨細胞の破骨細胞は倒立顕微鏡 (図 2 a) の下で見てはなりません。
  7. 破骨細胞は見ていない場合、は、破骨細胞誘導培地を変更し、破骨細胞が見られるまで毎日観察。
  8. 破骨細胞が形成された後、96 ウェル プレートの各ウェルから媒体の 50 μ L を収集します。

6. 酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) 染色

注: 成熟破骨細胞は体外培養 (ステップ 4) の 6-7 日後にあります。

  1. 培地を吸引し、1x PBS で 3 回を優しく洗ってください。
  2. 30 の修正プログラム ソリューションの 100 μ L の 96 ウェル プレートの各ウェルに、細胞を修正室温で s。
  3. 固定後、修正プログラム ソリューションを吸引、prewarmed 37 ° c. に脱イオン水で 3 回を優しく洗浄脱イオン水を吸い出しなさい。
  4. トラップ汚れ 96 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L を追加し、37 ° C で 30 分と光からの盾のインキュベーターでプレートを配置します。
  5. 汚損の後トラップ汚れを吸引、脱イオン水で 3 回を優しく洗います。
  6. イメージは、40 倍の倍率で倒立顕微鏡を用いた破骨細胞。

7. トラップ活動定量化培地の

  1. ステップ 5.1、5.4 5.8; から 96 ウェル プレートの各ウェルから 30 μ L の培養上清を収集します。陰性対照として非培養破骨細胞誘導培地の 30 μ L を使用します。新しい 96 ウェル プレートにサンプルを配置します。
  2. 96 ウェル プレートの各ウェルに基板 mixture(1.5.5) の 90 μ L を追加します。
  3. 1 h と光からの盾の 37 ° C でインキュベーターでプレートを配置します。
  4. 96 ウェル プレートの各ウェルに 3 メートル naoh 水溶液 50 μ L の追加によって反作用を停止します。
  5. 測定波長 405 theabsorbance nm。

8. 西部にしみが付くこと

注: 6-7 日間 24 ウェル プレートで体外培養後成熟破骨細胞が表示されます。

  1. 培地を吸引します。
  2. 予冷 1 x PBS 3 回で優しく洗ってください。
  3. PBS を吸い出しなさい。
  4. SDS 換散バッファー含むプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 の 100 μ L を追加します。
  5. 10 分 105 ° C で熱を可溶化物、12,000 × g と 4 ° C で 10 分間遠心するタンパク質を含む培養上清を収集します。
  6. 10 %sds ページ11で蛋白質の 30 μ g を含む溶解液を分離し、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転送。
  7. 30 分間 5% 乳脂肪の膜をブロックします。
  8. 反猛禽、アンチ P S6、アンチ S6、抗 β-アクチン一晩 4 ° C で 5% 乳脂肪で縮尺希釈で膜を孵化させなさい。
  9. 室温でトリス緩衝生理食塩水トゥイーン 20 (TBST) で 10 分間、膜を洗浄します。
  10. 8.9 の手順を 2 回繰り返します。
  11. 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の膜を孵化させなさい-標識抗マウスやウサギの IgG 抗体 1:5,000 室温で 1 時間 5% 無脂肪牛乳で希釈。
  12. 室温で 10 分間 TBST で 3 回膜を洗います。
  13. 化学ルミネセンスの検出の膜に西洋化学発光 HRP 基板を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。余分な基板のドレインし、x 線フィルムにしみを公開します。

結果

現在のプロトコルを使用して、巨大な破骨細胞の数が多いは、6; の日に見られました。巨大な破骨細胞を見ていない場合破骨細胞分化の 1 つのより多くの日があります (図 1) を必要とします。成功した破骨細胞形成は、TRAP 染色 (図 2 a) によって確認されました。破骨細胞以上 3 核の巨大ワイン赤/紫細胞はあった。WT BMMs (

ディスカッション

Osteoclastogenic アッセイは、分離と培養破骨細胞の in vitro12,13最も広く使われている方法です。いくつかの RANKL による破骨細胞誘導説明13,14,15をされているが、本研究は、いくつかの変更は、以前の方法に基づくプロトコルを説明します。

以前の研究で?...

開示事項

すべての著者は、利害の対立があるないこと状態します。

謝辞

著者は、ご提供する試薬およびマウスの博士 Minghan トンと加藤をありがとうございます。私たちは有益な議論のゾウの研究室のメンバーに感謝します。この作品は一部の助成金によって支えられた 973 プログラム中国の省の科学と技術 (ほとんど) [2014CB964704、2015CB964503] からの第 9 人民病院、上海 Jiao はさみ大学医学部の臨床研究プログラム。細胞生物学および生物化学の中核施設、上海生物化学および細胞生物学、中国科学アカデミー研究所分子細胞科学の卓越性のための CAS センターの中核施設の助けをありがとう。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Raptorfl/fl miceThe Jackson Laboratory013188
Ctsk-cre micea gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEMCorning10-022-CVR
GlutamineGibico25030081
Penicillin streptomycinGibico15140122
Fetal calf serumBioInd04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF proteinR&DQ3U4F9
Recombinant mouse RANKL proteinR&DQ3TWY5
RBC lysis bufferBeyotimeC3702
Trypan blueSigma-Aldrich302643
AcetoneShanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solutionSigma-Aldrich915
Formaldehyde solutionShanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) KitSigma-Aldrich387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solutionSigma-Aldrich3872
Sodium Nitrite SolutionSigma-Aldrich914
Naphthol AS-BI Phosphate SolutionSigma-Aldrich3871
Acetate solutionSigma-Aldrich3863
Tartrate solutionSigma-Aldrich3873
Dulbecco's phosphate-buffered salineCorning21-031-CVR
L-tartaric acidSigma-Aldrich251380
Sodium tartrate dibasic dehydrateSigma-Aldrichs4797
GlycineShanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOHShanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrateSigma-AldrichP4744
anti-RaptorCell Signaling Technology2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)Cell Signaling Technology2317
anti-ribosomal protein S6Cell Signaling Technology2211
anti-β-actinSanta Cruz Biotechnologysc-130300
37% formaldehydeXilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membraneBio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)Millipore00000367MSDS
IX71Olympus
EnvisionPerkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

参考文献

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