サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

要約

簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。

要約

サルモネラは、人間の胃腸炎を引き起こす通性細胞内細菌です。粘膜、S.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によって、低下するためファゴゾームと呼ばれる小胞に含まれています。Sの分離ネズミチフス菌-含むファゴゾームは、広く研究に使用されているどのようにs.感染症は、細菌の劣化を防ぐためファゴソーム成熟のプロセスを変更します。細菌を含む分離従来、ファゴゾーム ショ糖勾配遠心法によって実行されました。ただし、このプロセスは時間がかかり、専用の装置とある程度の器用さが必要です。Sの分離の簡単かつ迅速な方法は、ここで説明しました。ネズミチフス菌-ビオチン-ストレプトアビジン共役磁気ビーズの細菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。分離ファゴゾーム アッセイ、脂質、代謝、タンパク質解析などの広い範囲のための利用可能の選択の任意のバッファーで本法で得られたファゴゾームを中断できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌の特定、効率的、迅速なファゴゾームを含む最低限の機器を必要とする、古典的なショ糖勾配超遠心分離法よりも汎用性が。

概要

マクロファージ循環専門の貪食細胞検出、巻き込む、および任意の異物侵入の細菌など微生物細胞のアポトーシスに至る末梢の組織内に存在の低下しています。一般微生物 (病原体関連分子パターンまたは PAMPs として知られている) の表面に存在する病原体特定マーカーの表面受容体を介した認識時にマクロファージを開始の細胞膜における複雑な再編囲むと病原体¹を phagocytize の順。

包まれて病原体、ファゴソームと呼ばれる細胞内小胞のマクロファージによって含まれています。エンドソーム、リソソームなど他の小胞の分裂と融合の一連、病原体を含むファゴソームは組の phagosomal コンテンツの除去に必要な蛋白質を取得します。したがって、ファゴソームの酵素の組成は、ファゴソーム成熟²として知られているこのプロセスの過程で非常に可変です。

直後に貪食、エンドソーム³融解によるファゴソーム膜を組み込む複雑な空胞 ATPase (V-atpase) ポリコームタンパク。この複合体は、ファゴソーム⁴ルーメンに細胞質からポンプのプロトンに ATP を利用しています。ファゴソームの酸性化は、⁵その他の小胞の融....

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プロトコル

病原性 s. の使用を含むすべての手順ネズミチフス菌 は、BSL 2 またはより高い生物学的セキュリティ レベルの施設で実施する必要があります。文化と S のコーティングネズミチフス菌として骨髄由来マクロファージ (BMDMs) の感染は、汚染を防ぐための層流フードの下で行う必要があります。S の分離ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む任意 BSL 2 実験室ベンチで実行できます

。

骨髄のマクロファージへの分化のマウスからの抽出され動物の福祉制度のガイドラインに沿って行われ、自然、ノルトライン = ヴェストファーレン州の機関によって承認されました。環境および消費者保護 [Landesamt für Natur、環ならびにノードラインヴェストファーレン州 Verbraucherschutz (LANUV);ファイル: 84 02.05.40.14.082、84 02.04.2015.A443] とケルン大学

。

1 養殖 s

1. Inoculate s.。ネズミチフス菌(SL1344 株) 細菌のループを使ってブレインハートインフュー ジョン (BHI) 5 mL に単一の細菌のコロニーから
。
2. 揺れで一晩 37 ° c の定温器の細菌懸濁液をイ....

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結果

細菌を含む分離このプロトコルによってファゴゾーム細菌の最初のステップとしてビオチン化が必要です。我々 したがって、 s.の有効性を評価ビオチン標識に感染した BMDMs の共焦点顕微鏡解析によるネズミチフス菌ビオチン化 mCherry-S。ネズミチフス菌Cy5 ストレプトアビジンが付いた。簡単に、BMDMs は、mCherry-Sとこのプロトコルで説.......

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ディスカッション

新しいSの分離法ネズミチフス菌-ここで説明はファゴゾームを含むビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ細菌をコーティングします。細胞膜の穏やかな中断の後、磁気ラックを使用して細菌を含むファゴゾームできます簡単に抽出しました。示す細菌の炎症を誘発する病原体の能力を維持宿主細胞の貪食のプロパティは変更されません。このメソッドによって得られる?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Link NHS Biotin	Thermo Fisher Scientific	20217
FluidMag Streptavidin	Chemicell	4205
PIPES	Carl Roth	9156.2
MgCl2	Carl Roth	A537.4
EGTA	Carl Roth	3054.3
Sucrose	Carl Roth	4621.1
Mannitol	Carl Roth	4175.1
DTT	Sigma	43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail	Thermo Fisher Scientific	1861280
Cytochalasin B	Sigma	C6762
DYNAL or DynaMag Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2501
Bacterial loop (10µl)	Sarstedt	86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344	Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI	Biochrom	FG1415
PBS	Biochrom	L1825
Cy5-streptavidin	Invitrogen	SA1011
anti-beta-actin antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778
anti-mCherry antibody	Thermo Fisher Scientific	PA5-34974
anti-Rab5 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-46692
anti-Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-20943
anti-cathepsin D antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-6486
anti-Tomm20 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-17764
anti-calnexin antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-46669
anti-GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-20357