血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

要約

我々 は異所萌出へ自己免疫性脳炎が疑われる患者の血中 NMDA 受容体に対する自己抗体を検出する抗原としてヒト胚性細胞 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質が付いた NMDA 受容体の NR1 サブユニットを表明しました。この単純な方法はスクリーニング目的のため臨床現場で適切な可能性があります。

要約

抗 NMDA 受容体抗体の存在は、影響を受ける患者は、抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎と呼ばれるさまざまな神経精神症状を引き起こします。血液や脳脊髄液 (CSF) の NMDA 受容体に対する特定の自己抗体の検出は、この条件の正確な診断のために不可欠です。NMDA 受容体は、イオン チャネル蛋白質複合体 2 つ必須 NMDA 受容体サブユニット 1 (NR1) と 1 つまたは 2 つの NMDA 受容体を含む 4 つのサブユニットを含むサブユニット 2 a (NR2A) NMDA 受容体サブユニット 2B NR2B、NMDA 受容体サブユニット 2 C (NR2C) または NMDA 受容体サブユニット 2 D (NR2D)。抗 NMDA 受容体抗体のエピトープは、NMDA 受容体の NR1 サブユニットの細胞外 N 末端ドメインに存在すると報じられました。本研究の目的は臨床および基礎研究を容易にするために血液の NMDA 受容体の NR1 サブユニットに対する抗体の存在を検出するスクリーニング検査として使用できる単純な細胞を用いた蛍光抗体法を開発、します。抗 NMDA 受容体の自己免疫性脳炎。

概要

抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎は、すべての年齢の患者に発生することができます、主に女性患者^1,2に影響を与える新たに認められた疾患エンティティです。脳炎³の初期原因不明患者の間で最も頻繁に診断された脳炎の一つです。通常抗 NMDA 受容体脳炎で被害を受けた患者は、頭痛や発熱、意識レベルの変化、様々 な撹拌、過敏症など急性の神経精神症状の迅速な開発が続くの前駆症状を持っています。、不安、不眠、幻覚、妄想、侵略、奇妙な行動、運動異常、自律神経の調節不全や発作の攻撃^4,5。この条件とタイミング療法と免疫療法を早期より良い結果と影響を受ける患者⁶も完全復旧のため重要です。したがって、抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎は急性または新規発症の精神機能^7、8を呈する患者の鑑別診断として考慮されるべきことをお勧めします。

臨床的特徴のほかに血液や脳脊髄液の NMDA 受容体に対する自己抗体の検出は抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎⁹の正確な診断に不可欠です。ほとんどの抗 NMDA 受容体抗体を検出する免疫学的テストがいくつか研究所^10,11, で利用可能なスクリーニングのための 1 つだけの市販細胞を用いた蛍光抗体法、抗 NMDA 受容体抗体¹²。本研究の目的は抗 NMDA 受容体の臨床研究を促進する抗 NMDA 受容体抗体の存在感を画面に実験室で便利に使用できる単純な社内細胞を用いた蛍光抗体を開発するには自己免疫性脳炎。NMDA 受容体は heterotetramer イオン チャネル蛋白質の複合体、脳で特異的に発現します。それはの 2 つの強制 NR1 サブユニットと NR2A、NR2B、NR2C、NR2D の¹³の 1 つまたは 2 つのサブユニットの組み合わせでください。以前の研究は、その抗体の対象となる主なエピトープは NR1 サブユニット⁵の細胞外 N 末端ドメインを報告しました。したがって、このプロトコルでは我々 は人間の萌芽期の腎臓上皮細胞株 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いた NMDA 受容体の人間の組換えの NR1 サブユニット蛋白質を表現し、検出する細胞を用いた蛍光抗体法を開発血液中の抗 NMDA 受容体抗体の IgG クラス。

プロトコル

研究は、制度のレビュー委員会の長庚記念病院 Linkuo、桃園、台湾 (102-2577A3) で承認されました。

1. NR1 GFP 発現プラスミドの作製

1. 遠心分離機管、ピペットで移しなさい混合物の優しくまで上下のエシェリヒア属大腸菌の有能なセルひずみ DH5α 滅菌 1.5 mL の 100 μ L の NR1 GFP プラスミドのミックス 10 ng 4-6 回、20 分間氷の上管を孵化させなさいと。
2. 水のお風呂で 1 分の 42 ° C でチューブをインキュベート水浴からチューブを削除、管に 1 mL ホストゲノム スープ (LB) 媒体を追加し、37 ° c 1 時間振とうしながらインキュベーターでチューブを孵化させなさい。
3. アンピシリン (0.1 Mg/ml) を含む LB 寒天培地プレート上に混合物の 50 μ L を広がり、インキュベーターの 37 ° C で LB 寒天培地プレートを一晩インキュベートします。
4. 一晩 LB 寒天培地滅菌チップを使用して単一コロニーを拾うし、渦の先端を 5 mL の LB 培地とアンピシリン (0.1 mg/mL) の管内細菌培養の。一晩中揺れでインキュベーターで 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
5. 250 mL 滅菌 LB 培地とアンピシリン (0.1 mg/mL) が含まれています 500 mL フラスコに一晩培養分注 3 mL。揺れで 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。600 の波長で細菌培養の光学濃度 (OD) を定期的にチェック、OD600 0.6 1.0 に達するまでに分光器を用いた nm。
   注: は、グリセロール ストックを準備し、グリセロール ストック将来使用するため-80 ° C 以下での保存を 200 μ l 添加グリセリンと一晩培養も 800 μ L を混ぜます。
6. 250 mL の細菌文化から NR1 GFP 発現プラスミドを準備します。
   1. 4 ° C で 15 分間 6,000 × g で遠心分離によって細胞を収集します。
   2. RNase A を含む 10 mL 再懸濁バッファーで細菌のペレットを再懸濁します渦塊は見られないまでに徹底的に。
   3. 細菌懸濁液を 10 mL の溶解バッファーを追加、穏やかに 4-6 回、混合物を反転し、室温 (RT) 5 分でライセートを孵化させなさい。
   4. やさしく転倒させる混合物 4-6 回、ライセートを 10 mL 中古冷蔵沈殿バッファーを追加します。
   5. キャップとフィルター カートリッジの樽の中に溶解液を注ぐ室温 10 分待つ
   6. カートリッジ出口ノズルのキャップを外し、ピストンをカートリッジに挿入し、ピストンを軽く押します。フィルタ リングされた収集 50 mL のチューブに溶解。
   7. 2.5 mL 独自バッファーの製造元からフィルタ リングされたライセートを加えてチューブ約 10 倍の反転によって混合物を混ぜる混合物 30 分間氷の上を孵化させなさい。
   8. 適用 10 mL 平衡バッファーで平衡は事前フィルター列をフィルター選択されたライセート混合物。重力によって排出する列を許可します。
   9. 30 mL 洗浄バッファーの列を 2 回洗浄し、15 mL の溶出バッファーを使用して、列から DNA を溶出します。
   10. 10.5 mL (0.7 ボリューム) イソプロパノールを加える溶離された DNA バッファー、よく混ぜ、4 ° C で 30 分間 20,000 × g で混合物を遠心分離機
   11. 慎重に上清をデカントし、一度、5 mL エンドトキシン フリー 70% エタノールによる DNA ペレットを洗浄し、10 分 20,000 × g で遠心。
   12. 上清をデカント、化学フードで 5-10 分のペレットを乾燥、エンドトキシン フリー バッファーの 300-500 μ L のペレットを溶解します。
   13. 紫外線 260/280 nm の吸光度で溶液の吸収を測定することによってプラスミド濃度を決定します。
       注: は、同じプロトコルを使用して GFP 発現プラスミドを準備します。

2. NR1 GFP 発現プラスミドを HEK293 細胞のトランスフェクション

1. それぞれに 2% のゼラチン溶液 200 μ L 分注 48 ウェル培養プレートのと少なくとも 30 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
2. 10% 牛胎児血清 (FBS) 各井戸を含む細胞培養液 200 μ L でよくとシード 5 × 10⁴ HEK293 細胞からゼラチン溶液を吸引します。一晩 5% CO₂付属の加湿インキュベーターで 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
   注: 診断、セルがカウントされます。
3. 10% を含む新鮮な培養液 200 μ L で過ごした培を交換して次の日にもあたり FBS。
4. 各シングルの 100 を混合することによって、溶液を準備 20 μ L の培養液と 20 μ L の培養液中で 0.8 μ L のトランスフェクション試薬を混合することによってソリューション B NR1 tGFP プラスミドの ng。各実験のための総容積の準備に必要な井戸の数を乗算します。
5. ソリューション A と B のソリューションを混合することによって C のソリューションを準備し、RT で 20-30 分のための混合物を孵化させなさい。
6. C の解決策も HEK293 細胞を含むそれぞれの 40 μ L 分注プレートを軽く、旋回し、一晩 5% CO₂付属の加湿インキュベーターで 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
7. 40 X-200 X 倍率と蛍光顕微鏡下で宿主細胞の NR1 GFP 遺伝子組換えタンパク質の発現を確認 (励起/蛍光: 482/502 nm)、細胞を用いた蛍光抗体法に進みます。
   注: を使って同じプロトコルを使用して HEK293 細胞に発現プラスミド GFP。

3. 細胞を用いた蛍光抗体法

1. 井戸から使用済の培地を吸引、その後洗ってリン酸を 200 μ l 添加の各ウェル バッファー生理食塩水 (PBS) 3 回。
2. 4% パラホルムアルデヒド溶液 200 μ L を加えるごとによく15 分間常温プレートを孵化させなさい。
3. 、井戸からパラホルムアルデヒド ソリューションを吸引させ、各 200 μ L の PBS を 3 回も。
4. 10% スキムミルク 200 μ L を加えて PBST (0.1 %pbs でトゥイーン 20) それぞれがよく、穏やかな揺れで 1 h の RT でプレートをインキュベートするソリューション。
5. PBST ソリューションだけでなくからの 10% のスキムミルクを吸引して 200 μ L PBST で井戸を一度洗ってください。
6. 1 h の RT で穏やかな揺れで一次抗体として希薄プラズマ (pbst; で 1: 100) と井戸を孵化させなさい。
   注: プラズマが自己免疫性脳炎が疑われる患者の血液から得られます。
7. 、井戸から希薄プラズマを吸引し、それぞれを洗ってよく PBST の 200 μ L で 3 回。
8. ヤギ抗ひと IgG が Alexa Fluor 594 (1:1, 000 PBST 希釈) を各ウェルに共役の 200 μ L を追加し、1 h の穏やかな揺れで常温培養プレートを孵化させなさい。
9. ヤギ抗ひと IgG 共役 Alexa Fluor 594 ソリューションを吸引し、それぞれを洗ってよく PBST の 200 μ L で 3 回。
10. 各ウェルに 100 μ L のグリセロールの解決 (PBS と 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) の 1: 100,000 の 50% のグリセロール) を追加します。
11. 観察し、接眼レンズと 4 X、10 X、20 X 目標 X 10 を使用して蛍光顕微鏡下で細胞をイメージします。
    注: 正しいフィルターを使用して、各染料のため: NR1 GFP の (励起/蛍光 = 482/502 nm)、Alexa Fluor 594 の (励起/蛍光 = 561/594 nm)、DAPI のため (励起/蛍光 = 358/461 nm)。同じ方法で GFP を発現する HEK 細胞を使用して負の制御を行います。

結果

平均では、プロトコルのセクション 1 で説明されている手順に従って 250 mL の細菌文化から 200 〜 300 μ エンドトキシン発現プラスミド NR1 GFP の GFP を取得私たちでした。100 ng/よく発現プラスミドの量は、プロトコルのセクション 2 の説明に従って 48 ウェル プレートで培養した HEK293 細胞のトランスフェクションに使用されました。トランスフェクション後 24-30 時間?...

ディスカッション

生きている細胞を用いた蛍光アッセイ¹¹、固定細胞を用いた蛍光抗体法^{9 を含む文献で報告された NMDA 受容体に対する自己抗体の存在を画面にいくつか細胞を用いた免疫学的アッセイには}、流れの cytometry ベース測定¹⁴。生きている細胞を用いた蛍光抗体法は、流れの cytometry ベース試金は、訓練された人員および特別な装置を必要とする間...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit