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要約

本研究は、カンジダ glabrataで抗真菌薬耐性遺伝子で突然変異の分析の全ゲノム配列を実装します。カプソファンギン、アゾールと 5-フルシトシン、耐性菌のC. glabrataは、方法論を説明するために配列されました。菌株の感受性プロファイルは、遺伝子に特定の変異パターンの有無と相関。

要約

カンジダ glabrata も急速に薬剤耐性、特にアゾールやカプソファンギンにつながる変異を取得できます。抵抗は体外臨床的障害にしばしば関連付けることが検出されると、遺伝の突然変異の同定が不可欠です。C. glabrata抗真菌薬抵抗性のゲノム広い分析の全ゲノム配列 (WGS) を使用しての可能性を検討しました。目的はめざしイネーブラーをされ、実装 WG の障壁とその効果を測定します。このペーパーは、重要品質管理チェックポイントと抗真菌薬に対する感受性の低下と関連する遺伝マーカーを検討する WG 方法論の重要なコンポーネントを説明します。また、データ分析の正確性とテストの時間の周りのターンを見積もっています。

12 臨床表現型の感受性とC. glabrata ATCC 株の 1 つは、抗真菌薬感受性試験により決定されました。これらの含まれている 3 つは、薬剤の最小発育阻止濃度の上昇を開発する 3 つの患者からのペアを分離します。2 つのペアで 2 番目はカプソファンギンに各開発ペア抵抗の分離します。3 番目のペアの 2 番目の分離 5 フルシトシンへの抵抗を開発しました。残りは菌株の感受性およびアゾール耐性で構成。5 フルシトシン、アゾール系 echinocandin 抵抗性遺伝子の一塩基多型 (SNPs) は、次世代シーケンシングによる WG による耐性菌で確認されました。   FKS1、 FKS2 CgPDR1、CgCDR1 、 FCY2などの遺伝子を同定した抗真菌薬抵抗性の非同義の SNPs。全体的にみて、約 75-fold の読み取りの深さカバレッジを参照ゲノムにマップされるC. glabrata分離株の WGS 読み取りの 98% の平均。納期も費用もサンガーに匹敵するシーケンス。

結論としては、 C. glabrataの WGS は複数 PCR/DNA シーケンシング反応を必要とせずに別の抗真菌薬クラスに耐性に関与する臨床的に重大な遺伝子変異を明らかに可能だった。これは薬剤耐性授与置換の同時検出法の臨床検査室で WGS 能力を確立に向けた前向きな一歩を表します。

概要

カンジダ glabrataは、抵抗、アゾールおよびもっと最近、カプソファンギン1,2,3種としての重要性をますます発生病原体です。異なり、二倍体のc. アルビカンス、 C. glabrataの半数体のゲノム変異を取得し、多剤耐性をより簡単に開発することができます。両方の薬剤クラスでも共同の抵抗は、4を報告しました。したがって、抗真菌薬感受性の初期評価とC. glabrataの薬剤耐性の検出は抗菌薬耐性1のドライバーを制限する抗真菌薬の管理のコンテキストのように正しい、ターゲットを絞った治療も重要,5,6。 耐性菌の抵抗性バイオ マーカーにリンクされている確証的突然変異の存在がまた処方を改善するための意思決定を迅速に検出する効率的なワークフローと臨床転帰を確立します。

抗真菌薬感受性は通常薬物のない成長と比較して微生物の成長に大幅な削減結果最低薬物濃度として定義されている最小発育阻止濃度 (MIC) を測定することによって評価されます。コントロール。臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) 欧州委員会抗菌薬の感受性テスト (EUCAST) に感受性のマイクの決定を行うために試験方法を標準化してより正確で一貫性のある7、 8。ただし、抗真菌のマイクのユーティリティはカプソファンギン、特に限られている特に厚生比較に関して、様々 な方法論と条件が使用される9。また echinocandin 治療、WT を区別することができないに応答にマイクの不確かな相関関係がある (または影響を受けやすい) FKS 変異 (echinocandin 耐性菌)10,11をかくまっているそれらから分離されました。験の単一遺伝子 Pcr とサンガーの可用性も薬剤耐性マーカーのシーケンスを設定して、結果の実現は頻繁により遅れている複数抵抗マーカー5,12の同時検出の欠如。したがって、全ゲノム シーケンスに基づく解析により、ゲノム内の異なる場所での耐性付与突然変異の同時検出は、現在の方法より重要な利点を提供しています。

全ゲノム シーケンス (WGS) は、流行中の病気の感染だけでなく、ゲノム全体のリスク評価と薬剤耐性細菌やウイルスの13のテストのアプローチを追跡する正常に実装されています。核酸塩基配列決定技術の最近の進歩した全ゲノム配列 (WGS) 病原体の臨床的に実用的な時間の周りのターンで技術的、経済的に可能。DNA の配列では、病原体の同定および微生物学研究所14,,1516で採用の他の方法上の重要な利点を提供しています。まず、高スループット、スピードと品質で普遍的なソリューションを提供します。シーケンスは、微生物のいずれかに適用することができ、ローカルまたは地域研究所で規模の経済を可能します。第二に、国家および国際レベルで比較に従う '将来' 形式のデータが生成されます。最後に、医学の WGS の潜在的な有用性は、追加の臨床的および疫学的メタデータ17 を含む同等のデータ基地にリンクすることができます参照ゲノムを含むパブリック データ基盤の急速な成長によって補強されています、18。

最近の調査はCandida sppの臨床分離株の薬剤耐性マーカーの同定の WGS の有用性を示した。10,19,20します。 これは主に高スループット ベンチトップ シーケンサー、確立されたバイオインフォマティクス パイプラインおよび21,22のシーケンス処理のコストが低下の可用性。真菌 WGS のシーケンスは WGS が 1 回の実行で複数ゲノムのシーケンスをことができますサンガー優位。さらに、カンジダゲノムの WGS は特定の薬剤標的変異解析、遺伝的進化と臨床的に関連するシーケンス タイプ20,22,23の出現を追跡できます。最も重要なことは、本質的な耐性菌の場合は WGS は治療選択22,24前に耐性付与突然変異の早期発見に役立ちます。

ここでは、抗真菌剤の異なるクラスに薬剤耐性に関連する変異の WGS が有効なスクリーニングの可能性を調べた。エンドユーザーと診断真菌学研究室展望から WGS の実装のための方法論を提案します。我々 は、この分析の 3 つの分離を体外でカプソファンギンと 5 フルシトシンへの抵抗は次の抗真菌治療時間をかけて開発 3 つの独立した臨床例から培養のペアに含まれて。

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プロトコル

この研究のために必要な倫理的な承認がありませんでした。

1. サブカルチャーと菌カンジダ glabrataに備えて

  1. また少なくとも 1 つC. glabrataアメリカン タイプ文化コレクション (ATCC) 知られている感受性パターンを含める必要があります勉強するC.glabrata菌株のパネルを選択します。
  2. 単一コロニーを触れることにより、特定のサブカルチャー滅菌使い捨てプラスチック ループを用いるとサブローのデキスト ロース寒天培地 (SDA) にストリー キング プレート8。
  3. 順調な成長で分離の純粋培養の 35 ° C で 24-48 h の SDA プレートを孵化させなさい。

2. 抗真菌薬感受性の決定

  1. たて継C. glabrataから約 1 mm 径の 4-5 コロニーをピックアップする滅菌使い捨てプラスチック ループを SDA プレートの分離に使用します。滅菌蒸留水 3 mL に再懸濁します。均一な懸濁液を取得する穏やかなピペッティングでよく混ぜます。
  2. 5 x 10 の6セル/ml の濃度計8を使用して 1 × 106に相当する 0.5 マクファーランドに細胞の密度を調整します。
  3. 感受性は、商業の試金を使用してテストを実行 (テーブルの材料および試薬を参照) すべてC. glabrataの製造元の指示に従ってを分離します。CLSI ガイドラインに従って抗真菌薬の結果としてマイクに基づく分離株の感受性を解釈し、レポート (表 1)8を準備します。

3. シークエンシングのためゲノム DNA の抽出

  1. 1.5 mL チューブに 50 ミリメートルの EDTA の 300 μ L で新たに育てられた SDA プレートからコロニーの loopful を再懸濁します。
  2. ザイモリエイス (10 mg/mL) の 40 μ L に懸濁液と優しくピペット 5 回追加懸濁液が均一になるまで。
  3. 細胞壁を消化する 1-2 h を 37 ° C でサンプルをインキュベートします。5 分間室温で冷却します。
  4. 2 分 14,000 × gの懸濁液を遠心し、上清を慎重に取り外します。
  5. DNA 抽出キット ガイドライン (材料の表を参照)、次の genomic DNA を抽出します。
  6. 10 mm Tris バッファー (pH 7.5 8.5) は、キットで提供される溶出バッファーの代わりに 50 μ L の DNA の餌を抽出再懸濁します。
  7. 260/280 nm25の光学濃度 (外径) の測定による DNA の純度を確認してください。

4. ゲノム DNA の定量化

  1. 蛍光アッセイの製造元のガイドラインに基づくアッセイ キットで提供されるトリス EDTA (TE) バッファー × 1 を準備 (材料の表を参照してください)。
  2. テ アッセイバッファー (希釈率 1:50 100 μ L の最終巻) 使い捨て 96 well プレート x 1 の 98 μ L に 2 μ L を追加することによって DNA のサンプルを希釈します。この希釈手順は、いずれかのマルチ チャンネル ピペットを使用して手動で実行すること、リキッドハンド リング ワークステーション。
  3. ラムダ DNA を希釈して標準の範囲を準備 (100 μ g/mL) 蛍光アッセイ キット (表 2) で提供される、サンプルと一緒に測定が含まれます。
  4. 100 μ L に蛍光染料を 100 μ l 添加希釈 DNA サンプルと反応のための基準を追加します。光から保護、室温で 5 分間インキュベートします。
  5. 製造元のガイドラインに基づいてすべてのサンプルの蛍光を測定します。
  6. 蛍光の測定値を使用して標準の曲線をプロットし、DNA サンプルの元の濃度を計算します。
  7. 0.2 ng/μ L の DNA 濃度を調整する追加する DNA と 10 mM Tris バッファー (pH 8) のボリュームを決定します。
  8. 自動液体処理ワークステーションを用いた DNA 希釈を実行します。この手順は、手動ピペッティングによっても実現できます。

5. DNA ライブラリの準備

注: ライブラリの準備とシーケンスを製造元のプロトコルおよび会社 (図 1A) から提供されたガイドラインに従って行った (材料の表を参照してください)。

  1. Tagmentation および PCR 増幅
    1. 新しい 96 ウェル ハードシェル薄い壁板にラベルを付けます。
    2. 0.2 ng/μ L、5 μ L の DNA の定量化された入力を追加 (1 合計 ng) プレートの各サンプルに。
    3. Tagmentation バッファーの 10 μ L を追加して軽く混ぜてピペット増幅の 5 μ L 各も含む dna バッファーします。プレートをシール接着プレート シールを。
    4. サーマルサイクラーにプレートを置き、次の PCR プログラムを実行: 55 ° C、10 ° C で 5 分押しサンプルでは、10 ° C に達すると、中和するためにすぐに進みます。
    5. 増幅反応を中和するためにプレートに中和バッファーの 5 μ L を追加し、ミックスを優しくピペットします。プレート シールし、5 分間室温でインキュベートします。
    6. 15 μ L のサンプルを PCR マスター ミックスをインデックスに追加します。
    7. インデックス テンプレート (表 3) に基づいたインデックスのユニークな組み合わせを取得する各サンプルように 96 ウェル プレート形式のセットアップのインデックス プライマー チューブ使用のボックスを使用します。
    8. 表 3 のテンプレートで提供順序を使用してインデックス プレート ラック (図 1B) にインデックス プライマー管を配置し、テンプレートのインデックスの位置を記録します。
    9. 順序でインデックス管インデックス プレート ラックに追加された PCR マスター ミックスと tagmentation プレートを配置します。
    10. 垂直配置でインデックスのプライマー 1 管およびインデックス プライマー 2 管を入れてインデックス ラックの水平方向の配置。マルチ チャンネル ピペットを使用して、慎重に各サンプルにインデックスのプライマーの 5 μ L を追加します。
    11. インデックス管の古いインデックス間の交差汚染を避けるために新しいキャップを取り付けます。
    12. 96 ウェル クリア プレート シーラーを使用してプレートをシールし、2 番目の PCR を次のように実行: 95 ° C、30 s、12 サイクル 95 ° C の 10 s、55 ° C、30 s、72 ° C、30 s と 5 分の 72 ° C。
  2. PCR の一掃
    1. ディープウェル プレート tagmentation プレートから PCR 後処理用 PCR の製品を転送 (材料の表を参照してください)。
    2. 渦商業磁気ビーズ ソリューション (材料の表を参照してください) 製造元の指示に基づいて、ビーズの 30 μ L をディープ ウェル プレートで各 PCR の製品に追加します。
    3. 2 分間 1800 rpm でマイクロ プレート シェーカーでプレートを振るし、5 分間振盪せず室温で孵化させなさい。
    4. 上清がクリアまで 2 分、マグネット スタンドにプレートを配置します。
    5. マグネット スタンドにまだプレートと慎重に上清を破棄します。
    6. また、マグネット スタンドにプレートと作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加します。
    7. 30 のマグネット スタンドに板を孵化させなさい s と慎重に削除し、ビーズを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
    8. あれば 15 分削除余分なエタノールの風乾にビーズができ洗浄ステップを繰り返します。
    9. マグネット スタンドからプレートを外し、ビーズに再懸濁バッファーの 52.5 μ L を追加します。
    10. 2 分間 1800 rpm でマイクロ プレート シェーカーでプレートを振るし、振ることがなく 2 分間室温でインキュベートします。
    11. マグネット スタンドにプレートを置き、上澄みをクリアするを許可します。
    12. マルチ チャンネル ピペットを使用して、上澄みの 50 μ L の新しいハードシェル プレートに慎重にクリーンアップ プレートから転送します。
  3. ライブラリの正規化
    1. 製造元のガイドライン (表の材料を参照) によるとライブラリ正規化試薬を解凍します。
    2. クリーンアップ プレートから上澄みの 20 μ L を新しいディープ ウェル プレートに転送します。
    3. 磁気ビーズ懸濁液の 45 μ L を追加し、プレート板シーラーでシールします。
    4. プレートは、1800 rpm で 30 分間のマイクロ プレート シェーカーで横に振る。このインキュベーション時間は非常に重要です、超えることができません。
    5. 2 分、マグネット スタンドにプレートを置き、上澄みが (図 1B) をクリアすることを確認します。
    6. 取り外してマグネット スタンドにまだプレートと適切な有害廃棄物コンテナーの上澄みを廃棄します。
    7. マグネット スタンドからプレートを削除し、45 μ L 洗浄バッファーでビーズを洗浄します。
    8. 洗浄バッファーでプレートは、1800 rpm で 5 分間のマイクロ プレート シェーカーで横に振る。
    9. それが明確になるとき、2 分及び破棄上澄みのマグネット スタンドにプレートを配置します。
    10. マグネット スタンドからプレートを削除し、洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。
    11. マグネット スタンドからプレートを削除し、0.1 N NaOH の 30 μ L を追加します。
    12. 1800 rpm で 5 分間のマイクロ プレート シェーカーで 0.1 N NaOH で板を振るし、2 分または液体がクリアされるまで、マグネット スタンドにプレートを配置します。
    13. 新しい 96 ウェル ハードシェル薄肉最終的な正規化されたライブラリ プレートの各ウェルに 30 μ L の溶出バッファーを追加します。
    14. 最終巻 60 μ L をする最終的な正規化されたライブラリ プレートに正規化プレートから上澄みの 30 μ L を転送します。ライブラリは、シーケンスする準備が整いました。
  4. QPCR による DNA ライブラリ濃度の定量
    1. マスター ミックス、プライマーおよび製造元のガイドライン (表の材料を参照) によると qPCR キットで提供される標準を解凍します。
    2. PCR 試薬マスター ミックスと製造元の指示に従って qPCR キットに付属のプライマーを組み合わせて、因数は-20 ° C で保存することができます。
    3. DNA ライブラリの濃度を決定するには、ホームキット希釈 (158 μ L Tris バッファーに 1: 100 から 2 μ L) 続く 1: 100 希釈 (1.5 μ L DNA ライブラリ 148.5 μ L トリスバッファーする) を実行することによって 10 mM Tris バッファー (pH 8) を用いた DNA ライブラリの 1/8000 希釈を行います。
    4. 少なくとも 1 分の 700 rpm で希釈プレートを振るし、1 分 14000 × gで遠心分離します。
    5. 希釈した DNA ライブラリまたは DNA 規格の 4 μ L とマスター ミックスの 16 μ L を混合することによって最終的な PCR の反作用の 20 μ L を準備します。
    6. 以下の製造元の設定たちで PCR を実行: 95 ° C、5 分、95 の 35 サイクル 45 s、および最終の 65 ° C ~ 95 ° C、融解曲線分析の 30 s と 60 ° C の ° C。
    7. QPCR たちから DNA のサンプル ライブラリと標準の Ct 値を取得します。
    8. 基準 (図 2) の Ct 値から標準曲線を生成します。平均から 3 サイクル ± して上限と下限の QC の範囲を定義します。たとえば、平均 Ct 値が 13 サイクルの場合、QC 範囲は 16 と 10 のサイクルの間です。
    9. 標準曲線と Ct 値から個々 および平均ライブラリ濃度 (ALC) を決定します。
    10. 合計プールされたライブラリ (PAL) 使用される量 1.4-13:08 間ターゲット ライブラリ濃度であることを考慮した最終的なシーケンスに対して下記の計算に基づいて決定します。
      注:QPCR から得られるライブラリ濃度の平均 = ALC;プールされたライブラリ (PAL) の合計 = ALC/2;PAL (DAL) を変性 PAL = * 0.666
      バッファーと混合される DAL の量、に応じてフロー ・ セルに追加するライブラリの濃度であります。たとえば、バッファーの 835 μ L にライブラリの 65 μ L を追加する場合、この希釈 (Dil 1) 195 からが追加されます 1300 μ L の総ボリューム: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = 最終濃度 (1.4-13:08 の間する必要があります)

6. ライブラリのプールとベンチトップ シーケンサーの開始シーケンス

  1. 製造元のガイドラインによると試薬カートリッジを解凍します。4 ° C のストレージからそのパッケージから新しいフローセルを取り出して室温少なくともシーケンスの前に 30 分をもたらします。バッファー カートリッジと使用する前に prechill 配列バッファーを取る (材料の表を参照してください)。
  2. コントロール ライブラリをライブラリの 5 μ L を混合することによって準備 (1 nM) と 0.2 N NaOH の 5 μ L。渦を簡単に単一繊維にコントロール ライブラリを変性する室温で 5 分間インキュベートし、。
  3. 200 ミリメートル トリス-HCl、pH 7 と渦の 5 μ L を追加します。235 μ L prechilled 配列バッファーを加え、軽く混ぜます。総量が 20 でコントロール ライブラリの最終濃度で 250 μ L 分。
  4. 単一の低バインド 1.5 mL チューブに最終的な正規化されたライブラリ プレートからシーケンスする各サンプルのライブラリの 5 μ L を転送することによってプール DNA ライブラリ。
  5. プールされたライブラリの 30 μ L と管内別低バインド ライブラリを変性する 0.2 N NaOH の 30 μ L を追加します。
  6. 渦低バインド チューブし、単一繊維にライブラリを変性する室温で 5 分間インキュベートします。
  7. 200 mM トリス-HCl、反応を中和するために変性のライブラリとチューブに pH 7 の 30 μ L を追加します。
  8. 中和変性ライブラリ懸濁液の 65 μ L と中古冷蔵配列バッファーとよく混ぜて渦の 835 μ L を追加します。
  9. 最終低バインド チューブで次は組み合わせる: 中和変性ライブラリ、コントロール ライブラリと配列バッファーの 1103.70 μ L の 1.30 μ L から 195 μ L。ミックスが適切。
  10. 試薬カートリッジを所定の場所に最後のライブラリ ミックス (1300 μ L) をロードします。
  11. セットアップ シーケンスをシーケンサーでプロジェクトとサンプルの詳細を入力して、実行指定ウェブサイト ガイドラインに従います。
  12. 開始シーケンスはガイドラインに従います。フロー ・ セル、ライブラリと試薬カートリッジとベンチトップ シーケンサーでバッファーのカートリッジをロードします。
  13. すべての試薬キットと、シーケンスで使用されているカートリッジのロット番号を記録します。

7. データのシーケンスの web サイトからダウンロードします。

  1. ウェブサイト上で提供の製造元の指示に従って FASTQ ファイルをダウンロードします。
  2. 良い品質チェックを実行率 Q30 は ≥ 75%、クラスター密度は 170 280 K/mm2の間 200 210 K/mm2 (表 4) に最適。

8. シーケンス データ解析

  1. データ分析ソフトウェアを統合したパッケージにシーケンスされたサンプルの FASTQ ファイルをインポート (材料の表を参照してください)。
  2. すなわちトリミング リストから機能を追加するソフトウェアのシーケンス ワークフローを作成、参照 ([参照ゲノム) へのマッピング、ローカル再編およびバリアント解析 (図 3A) 設定を使用して表 5 に記載。
  3. 1 つのサンプルまたはサンプル FASTQ ファイルのバッチを選択してワークフローを実行し、指定のサンプル フォルダーに出力ファイルを保存します。
  4. (図 3B) のゲノム シーケンスのカバレッジの深さ、マップされた領域と構造変形の一覧レポートを生成します。
  5. 構造変形のリストを使用すると、抵抗性と病原性を付与する遺伝子の非同義一塩基多型 (SNPs) を検索します。
  6. レポートを準備するには、SNP の場所、遺伝子、および抵抗性または感受性の菌株 (表 6) の数を一覧表示します。

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結果

13 C. glabrata C. glabrata 90030 と 12 ATCC 由来 (CMRL12 に CMRL1 を隔離集団) 臨床真菌参照実験室を含む、ウエストミード病院、シドニーを調べた (表 1)。これらは分離株 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 と CMRL-5/CMRL-6 間に疫学的リンクのない抗真菌治療前後の 3 つのペアが含まれている24 (表 1)。

9 抗真菌剤すな?...

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ディスカッション

本研究には、可能性、おおよそタイムライン、 C. glabrataの薬剤耐性の WGS 誘導検出精度が決定されます。ライブラリの準備とシーケンスのターンアラウンド ・ タイム (TAT) は 4 日、ワンツー日数分析結果報告だったこれは少なくとも同じような量 TAT 培養皿サンガーから感受性試金のための比較サンプル数の大幅増加によるシーケンスします。約 30-90 C. glabrataゲノム シーケンス ?...

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開示事項

著者があるない競合する金銭的な利益とない利益相反を開示します。

謝辞

この作品は、感染症・微生物学・公衆衛生学の中心によって支えられました。著者は、この研究のため他の資金を受信していません。著者は、専門家のアドバイスと支援全ゲノム シーケンス実験 Drs アリシア アーノット、ネイサン バッハマンと Ranjeeta メノンをありがとうございます。

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資料

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