点滅表面増強ラマン散乱の観測と解析

Yasutaka Kitahama

doi:10.3791/56729

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この記事について

要約
要約
概要
プロトコル
結果
ディスカッション
開示事項
謝辞
資料
参考文献
転載および許可

要約

このプロトコルを記述する点滅表面増強ラマン分析発電法を用いた銀表面の単一分子のランダム・ウォークによる散乱します。

要約

銀 nanoaggregate 接合部での単一分子から点滅表面増強ラマン散乱 (SERS) が観察されます。SERS 活性を準備する方法のプロトコルを表示するここでは、銀の nanoaggregate、顕微鏡画像の特定の点滅しているスポットのビデオを記録し、点滅の統計情報を分析します。この分析では、べき乗則はその期間を基準にして明るいイベントの確率分布を再現します。暗いイベントの確率分布は、指数関数との力法律によって取り付けられています。べき乗則のパラメーターは、明るいと暗い状態での分子の挙動を表します。ランダムウォークモデルおよび銀表面全体に分子の速度を見積もることができます。それは平均、自己相関関数、および超解像 SERS のイメージングを使用する場合でもを見積もるは困難です。将来は、点滅の起源は、単独でこの分析法による確認ができないため電力法解析スペクトルイメージングを組み合わせる必要があります。

概要

表面増強ラマン散乱 (SERS) は、機密性の高い貴金属表面ラマン分光です。金属表面上の単一分子の情報を調べることができますラマンスペクトル、分子内の機能グループの振動モードを鋭いピークの位置に基づく分子の構造に関する詳細情報を提供しますのでSERS¹^,²^,³を使用しています。分子レベルで吸着と銀 nanoaggregate から点滅信号が観察される¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶、およびスペクトル変動¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^、 ⁹^,¹⁰^、¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴。点滅は、ナノサイズの銀 nanoaggregate ジャンクションで強化された電磁 (EM) フィールドがランダムに出入りする単一分子誘起することができます。したがって、点滅と、表面増強ラマン散乱強度および bi 検体²^,³^,¹⁷のポアソン分布を用いた手法と比較して、単一分子検出のための簡単な証拠と見なされます。ただし、Ag 表面上の分子の挙動に依存が強く、点滅と変動のスペクトルの詳細なメカニズムはまだ論争を呼びます。

従来、SERS の点滅が分析されて拡散係数と、強化された EM フィールド¹²^,¹³^,^{14 出入りする分子の濃度を計算することができます自己相関関数を使用して}.さらに、全磁力の不安定性を表す、正規化された標準偏差のスコアは、信号¹⁵時間プロファイルから派生しています。ただし、これらの分析方法は、いくつかの分子の挙動に基づく可能性があります。対照的に、SERS の点滅の超解像イメージング、強化された電磁界での単一分子の挙動は、識別された¹⁶をすることができます。ただし、これらのテクニックは、強化された EM 分野のみでこのようなパラメーターを取得できます。平均⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,^{8 よりもむしろ力法律として (例えば、SERS の点滅) の広い範囲での単一分子のランダムな動作を表現できます。} ^,⁹^,¹⁰^,¹¹, 半導体単一量子ドット (QD)¹⁸^,¹⁹から点滅蛍光に似ています。電力法分析⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, 分子の挙動を使用して(強化された電磁界) で明るい状態と暗い状態¹⁰; の両方に推定することができます。つまり、全体の銀表面上の分子の挙動を推定できます。

この技は、銀コロイドハイパーラマンが使用される⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹。これらハイパーラマンは、ある特定の波長で興奮しているとき強く強化された電磁界に影響を与える各種の局在表面プラズモン共鳴 (LSPR) バンドを示します。したがって、SERS 活性銀ナノ粒子コロイド懸濁液といくつかのデータに存在するがすぐに得られます。単純なナノ構造、ある特定のサイズ、形状、および手配の場合点滅 SERS の LSPR の依存性は、他の依存の⁷; を隠すことができます。すなわち、LSPR に良し悪しのナノ構造を使用する場合、パラメーターは定数になります、他の依存したがって隠されています。銀コロイドハイパーラマン⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,から点滅 SERS の様々な依存症を発見するパワー法解析が使用されています⁹^,¹⁰^,¹¹。

プロトコル

1. サンプル準備

銀コロイドのナノ粒子の作製²⁰
1. 銀コロイドのナノ粒子を作製するには、0.030 g 硝酸銀と 0.030 g 200 mL 丸底フラスコに水 150 mL にクエン酸ナトリウム二水和物を溶かします。
2. (ジムロート) 還流凝縮器とフラスコを組み合わせます。
3. 磁気スターラー、攪拌棒でフラスコ内でソリューションをかき混ぜます。60 分 150 ° C で油浴中でフラスコの攪拌溶液を熱し。
  注: ソリューションは、黄色、乳白色、グレーになります。
4. 室内の温度の懸濁液を冷却し、冷蔵庫にアルミ箔で覆われたフラスコの懸濁液を維持します。
  注: プロトコルをこの時点で一時停止できます。コロイド状ナノ粒子を使用して、1 ヶ月以内、冷蔵庫で保存した後。
マルチカラーのサンプルの調製点滅発光¹¹
1. 顕微鏡のスライドを準備ができて、石鹸でガラス板を手で洗って水ですすいでください。
2. ガラス板に 0.1% ポリ L リジン水溶液を追加し、送風機とソリューションを削除します。
3. ガラス板に銀コロイド懸濁液を追加および送風機を懸濁液を削除します。
4. 液体ブロッカーペンでガラス板のドロップ領域を囲みます。
5. ガラス板に蒸留水をドロップし、顕微鏡スライドを作成し、水が蒸発するを防ぐ別のガラス板でそれをカバーします。
単調な色点滅 SERS のサンプルの調製⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰
1. 顕微鏡のスライドを準備ができて、石鹸でガラス板を手で洗って水ですすいでください。
2. 銀コロイド懸濁液の thiacyanine または thiacarbocyanine の色素を混ぜて (25 または 4 μ M、それぞれ)、塩化ナトリウム (10 mM) の水溶液 2 の容積比で: 1:1。
3. ガラスプレート上にサンプルサスペンションをドロップし、送風機とサスペンションを削除します。
4. 液体ブロッカーペンでガラス板のドロップ領域を囲みます。
5. 銀ナノ粒子を固定化するガラス板に塩化ナトリウム (1 M) の水溶液をドロップし、顕微鏡スライドプレートを作成し、ソリューションを蒸発から防ぐために、別のガラス板でそれをカバーします。

2. 点滅銀ナノ粒子の観察

サンプルの照明
1. 倒立顕微鏡のステージ上の 1.2 または 1.3 プロトコルを使用したサンプルのガラスプレートを配置します。
2. 様々な色の斑点 (青、緑、黄、および赤) 対物レンズ (60 X) を使用してガラス板上に暗視野コンデンサーとフォーカスを白色光を使用してサンプルのガラスプレートを照らします。
3. ダイオード励起固体 (DPSS) 連続波 (cw) レーザー干渉フィルターを通してから試料表面に対して 30 ° の角度で配信、弱毒ビームを用いたサンプルガラス板を照らします。
4. 周辺の同じ色に単調な色の斑点として銀ハイパーラマンを観察するレーザ光を照射して、レーザー照射面積をビューの中央に移動、z 方向の段階を調整することによってガラスプレート上のスポットに焦点を当てます。
点滅の観察
1. ロングパス・フィルターを対物レンズの後に挿入し、試料表面に対して 30 ° の角度で干渉フィルターを通して配信 DPSS cw レーザー光を用いたサンプルガラス板を照らします。
2. 図 1に示すように、点滅してスポットを見つける (また見なさい図 S1補足資料で) x 方向と y 方向でステージを移動することによって。
3. 20 分間の 61-120 ms の時間分解能を持っている冷却デジタル電荷結合素子 (CCD) カメラに結合、倒立顕微鏡で点滅している地点のビデオを記録します。

3 点滅表面増強ラマン散乱の解析

時間プロフィールビデオからの導出
1. CCD カメラを制御するソフトウェア、ビデオのファイルを開きます。
2. 点滅スポット、暗い領域を選択すると、別にビデオイメージのスポットとの領域をカバーする領域をドラッグします。
3. 点滅スポットやビデオの暗い部分から信号強度の時間分布を導出するには、分析、時系列解析を選択し、時系列解析] ウィンドウで[計算] をクリックします。
4. テキストファイルとしてデータを保存します。
時間プロファイルの解析
1. 時間プロファイルのベースラインは、暗い領域および/または図 2 aと2 bに示すように、多項式関数でフィッティングから時間プロファイルを引いて平らにします。
2. 図 2と2 Dに示すように約 2000 点、私_基本基準強度の標準偏差は、σ, から成る平均基準強度を評価します。
3. 私_基本+ 3 σ、しきい値よりも大きい強度を使用してイベントを暗いから明るいイベントを区別し、各イベントの存続期間を記録します。図 3、たとえば、3.5476 を 0 からイベント記録暗いイベントとして s (持続時間t = 3.5476 s)、4.0981 に 3.5476 からイベントを記録および明るいイベントとして s (持続時間t = 0.5505 s)。表 1に示すように、手順を繰り返します。
4. 表 2の最初と 2 番目の行で表さ各期間の明るい部分と暗いイベントの数をカウントします。
5. 期間tよりも短い間隔でイベントを除いて、各期間のイベントの数を合計します。各期間のイベントの数をたとえば、合計表 2の 2 番目と 3 番目の行に示された、( tのイベントを除いて 0.0612 = s) 41 + 18 + 9 +...;その結果tの総和に等しい = 0.1223 s、すなわち103。
6. 各期間合計で割ります、正規化します。表 2に示された、たとえば、分割期間tの合計 = 0.0612 期間 0.0612 s で s。結果は 3,351.5791 です。次に、表 2の 4 行目の結果の合計で結果を分割します。確率分布は、0.64494 に派生します。
7. 明るいイベントP、_上(t) 対数-対数グラフで自分の時間tに対して確率分布をプロットし、ログ₁₀P_の(t)_{10 のログ}()、電源法指数 α_に特定のスポットで点滅を推測します。P_の(t) が取り付けられている場合、近似直線は、図 4Aの点線で示すように、 P_の(t) の小さな値でプロットから逸脱。
8. 暗いイベントP_オフ(t) 対数-対数グラフではtの期間に対する確率分布をプロットし、ログ₁₀(ログ₁₀P_から(t) に合わせてください電源法指数 α の_オフと、切り捨て時間τ同じ点滅からスポットを推測します。P_オフ(t) が取り付けられている場合、 P_オフ(t) の小さな値でプロットから逸脱する近似曲線。
9. ビデオで他の点滅しているスポットを 3.2.1 に 3.2.8 を繰り返します。

結果

プロトコル 1.2 により作製したポリ L リジンと銀のハイパーラマンからは、 1 図¹¹に示すように SERS と表面増強蛍光から色とりどりの点滅しているスポットを観察します。対照的に、表面増強ラマン散乱から単調な色の点滅の斑点は、プロトコル 1.3⁷^,⁸^,⁹^,

ディスカッション

銀 nanoaggregate ジャンクションからセールが出力されます。したがって、我々はコロイド状ナノ粒子、クエン酸アニオンで覆われているよりもむしろハイパーラマンを準備する必要。銀の集計は、ポリ-L-リジン、NH₃⁺し、サールの起源の付加によって作成されるエフェクトを塩漬けから形成されているまたは塩化ナトリウム、補足資料の図 S2のようにから Na⁺

開示事項

著者は、何を開示します。

謝辞

著者は、この作品の実りある議論するため尾崎幸洋教授 (関西学院大学)、伊藤哲夫博士 (国立科学研究所の高度な産業と技術) をありがちましょう。この作業は、教育省、文化、スポーツ、科学および技術 (第 16 K 05671) から科研費 (費補助金科学研究 C) によって支えられました。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nitrate, 99.8%	Wako	194-00832
Trisodium citrate dihydrate, 99. %	Wako	191-01785
Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1%	Sigma-Aldrich	P8920
3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine	Hayashibara Biochemical Laboratories	NK-2703	a kind of thiacyanine dyes
3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt	Hayashibara Biochemical Laboratories	SMP-9	a kind of thiacarobocyanine dyes
Sodium chloride, 99.5%	Wako	191-01665
Dimroth condenser	Iwaki	61-9722-22	perchased from AS ONE
Magnetic stirrer	Corning	DC-420D
Oil bath	Advantech	OS-220
Glass plate	Matsunami	S-1112	Microscope slide
Blower	Hozan	Z-288	Air duster
Liquid blocker pen	Daido Sangyo		LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Objective lens	Olympus	LCPlanFl 60×	NA 0.7
Dark field condenser	Olympus	U-DCD	NA 0.8–0.92
Cooled digital CCD camera	Hamamatsu	ORCA-AG	controlled by software Aqua Cosmos
Software for the cooled digital CCD camera	Hamamatsu	AquaCosmos	used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video
Color CCD camera	ELMO	TNC-C920	not used for analysis
DPSS laser	RGB laser system	NovaPro532-75	λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)
Interference filter	Semrock	LL01-532-12.5
Long pass filter	Semrock	BLP01-532R-25
Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events	home-maid		programmed by C++
Software for the fitting by a power law	LightStone	Origin6.1

参考文献

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