マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

要約

ここでは、蛍光体の左胸腔内配信共役コレラ毒素サブユニット β 後マウスにおける横隔膜の運動ニューロンを識別するためのプロトコルについて述べる.胸腔内を注入する 2 つの手法を比較: 横隔膜胸壁アプローチ対。

要約

横隔膜の運動ニューロンは、頚椎の運動ニューロンが C3 から C6 レベルほとんどの哺乳類の種への発信です。軸索投射は、呼吸の横隔膜を刺激する横隔神経に収束します。脊髄スライスでは、形態学的または生化学的基準に他の運動ニューロンから横隔膜の運動ニューロンを識別できません。マウス、コレラ毒素サブユニット β (CTB)、fluorophore に活用されるの次の左胸腔内注入で横隔膜の運動ニューロン細胞体を可視化するための手順の説明を提供します。この蛍光の神経解剖学的トレーサーは、横隔膜神経筋接合部に巻き込まれる、横隔神経軸索に沿って逆行性にされ、横隔膜の細胞体に到達する能力を持っています。胸腔テレ配信の 2 つの方法論的アプローチの比較: 経皮的注射と横隔膜。両方のアプローチは成功している、CTB ラベル横隔膜運動ニューロンの数がほぼ同じ結果します。結論としては、これらの技術は、可視化やダイヤフラム隔回路に焦点を当てたものなど様々 な実験的研究で横隔膜の運動ニューロンを定量化に適用できます。

概要

研究の目的は、横隔膜運動ニューロン (PhMN) マウスの脊髄のセクションを識別するために信頼性の高い方法を提示することです。胸腔内に蛍光の神経解剖学的トレーサーの注入は、横隔膜に横隔神経筋の予測をアクセスし、横隔細胞体のラベルに横隔神経軸索に沿って逆行性輸送を使用する配信方法として選ばれました。左胸腔内配信の 2 つのテクニックを説明: 経胸壁と横隔膜。

横隔膜の運動ニューロンは、脊髄の中継細胞の軸索が最終的に横隔膜を支配する横隔神経へ収束です。これらは、下位運動ニューロン延髄呼吸センターから吸気ドライブを受け取ると横隔膜神経-筋接合部 (NMJ) を中継します。PhMN は、半ば頸部の背骨に沿って実行している、各 hemicord の 1 つのモーター列に構成されています。人間を含む哺乳類の種のほとんどは、横隔膜運動列レベル C3 から C6^1,2,3に します。私たちと他の人は、PhMN がラットおよびマウス脊髄^4,5,6,7、8に C3 ~ C5 レベルで集中してを確認しています。横隔細胞の地形の分布はランダム。横隔膜胸骨部を支配する運動ニューロンは、下腿の一部を支配する運動ニューロンがより尾側 (C5)⁹に対し横隔モーター プール (C3) の頭蓋の部分でより密分散されます。さらに、PhMN は脊髄前角の灰白質にいろいろクラスター化します。C3 レベルで横隔細胞のクラスターが横方向に, うそをつくし、腹の方向にシフトして、最も尾側レベル^10、11ventromedially があります。

吸気時に重要な役割を与え、健康的な脊髄の PhMN を正確に識別するが、また変性疾患や脊髄の外傷などの病理学の条件の中に、彼らの運命に従う最も重要であるのです。以来、PhMN は他の頚椎の運動ニューロンから形態学的違いは、PhMN の同定は、神経解剖学的トレーサー レベル主に人工呼吸器センター⁸、またはダイヤフラム NMJ⁷またはのいずれかのターゲットを絞った配信横隔神経の⁴。トレーサーは、神経線維によってとられ、頸椎、横隔細胞体まで運ば直接的または間接的な検出システムを使用して視覚化することができますここ。逆行性または前向性トレーサー抱合体の広い範囲で市販されています。注目すべき、各トレーサーは無しで、恵まれているトランス シナプス トレースの低または高能力。

現在の研究では、我々 修飾と Alexa Fluor 555 (CTB fluorophore として今後呼ばれる) コレラ毒素 (CTB) の β サブユニットとして選んだ蛍光ラベル冷凍脊髄のセクションで PhMN の直接視覚化を許可します。CTB は、実験データは、シナプス通過¹²を表示する傾向があるが通常シナプスのトレーサーとして記述されます。CTB で神経終末の細胞膜ガングリオシド GM1 をバインドする機能があります。CTB がクラスリン依存または独立したメカニズムとトランスゴルジ ネットワークを介してトラフィックを介して逆行性ファッション^13,14の小胞体に内部的なもの。インターナライゼーションと逆行輸送アクチン細胞骨格^15,16だけでなく微小管ネットワーク¹⁷依存するようです。

CTB fluorophore は CTB のダイヤフラム PhMN 回路をラベリング逆行性神経解剖学的トレーサーとしての有用性を示すためには、intrapleurally を配信されました。CTB は、2 つの手法が投与された: 最初の 1 つに開腹し, と複数の横隔膜の注入; が含まれています。2 番目の 1 つ、低侵襲を使用独自の経胸壁射出。4 日後、蛍光標識した PhMNs は健康とする傷つけられた (C4) 動物からの両方から頚髄損傷の定量化されました。

プロトコル

実験的プロトコル実験動物 (2010/63/EU、86/609/EEC および 87-848/EEC) の欧州社会理事会指令に準拠して実施され、動物倫理委員会のナミュール大学 (倫理プロジェクト n ° 17-284 によって承認されました。).図 1は、2 つのそれぞれのアプローチを示しています: 横隔膜や経皮的注射。男性の c57bl/6 j マウスを使用 (n = 18) における 4 ヶ月 3 から歳。

1. CTB 溶液の調製

1. 横隔膜注射: のため
   1. 0.2% (w/v) 濃度を滅菌水で CTB 電源を溶解します。
   2. 各マウス添付の 33 g 針 (鈍いまたは短いベベル) 滅菌 10 μ L 変らずに CTB 溶液 (0.2 %w/v) 7.5 μ L をロードします。
2. : 経皮的注射用
   1. 0.1% (w/v) 濃度を滅菌水で CTB 電源を溶解します。
   2. それぞれのマウス用ベベル 27 g 針付き CTB 溶液 (0.1 %w/v) 500 μ l インスリン注射の 20 μ L をロードします。
      蒸留水や滅菌水を使用する注: を確認し、正しく CTB 粉を溶解します。ソリューションは、4 ° C で 1 ヶ月保つことができる (凍結しないでください)。数日後、沈殿物を形作るかもしれない。部屋の温度にソリューションを持参し、使用前にピペットでよく混ぜ。

2. 左胸腔内注射する前の準備

1. オートクレーブまたはガラスビーズ滅菌器を使用して、手術前に手術器具を滅菌します。手術を行うこと、手術器具を処分するクリーン ベンチ コートを準備します。
   注: 外科プロシージャの間に使用される物質は、無菌でなければなりません。消毒剤 (クロルヘキシジン) で拭く必要がある必要があります、変らずのように滅菌できない器具シングル-使用のみ。外科医は、手術の開始前に消毒剤 (クロルヘキシジン ・ スクラブ) で彼女の手を洗う必要があります。外科医は、クリーン ガウン、マスク、滅菌手袋を着用ください。
2. 動物の重量を量るし、麻酔の適切な投与量の管理: 麻酔薬カクテルの腹腔内注射 (例えばケタミン 100 mg/kg とキシラジン 5 mg/kg)。
3. つま先をピンチやマウスはきちんと麻酔どう眼瞼反射の消失を確認します。角膜を保護するために獣医軟膏を塗る。
4. (横隔膜のプロシージャ) の腹側の皮膚や右サイド胸部皮膚 (胸壁手順) の電動バリカンを使用して慎重にひげをそる。十分な広い手術フィールドに入る髪を防ぐためにひげをそる。
5. 剃毛エリアに 10% ヨウ素溶液の塗布により無菌状態を確保します。外周方向へサイトの中心からスクラブに注意しながらヨードと手術部位をスクラブします。
6. 動物の体の温度を維持するために、手術中恒温パッドを使用します。

3. 胸腔注射横隔膜アプローチを使用して

1. 加熱パッドで仰臥位で麻酔下のマウスを置きます。動物の首の下の圧延のガーゼのパッドを配置します。アダルト マウス、厚さ 0.5 インチの巻きガーゼのパッドを使用します。この場合の動きを避けるために手術ボード パッドをテープします。
2. 正中線に沿って腹側の皮膚を切開メス刃を使用して: 臍領域に横方向に皮膚をピンと張ったようにもう一方の手で肌を伸ばしながら、剣状突起から切開を行います。基になる臓器を損傷を避けるためブレードにあまりプレッシャーは適用されません。
3. 腹部の筋肉の切開の周りから肌をデタッチ慎重に小さなはさみを使用して。筋肉や、手術の終わりに離れて皮膚をステッチでこの手順が役立ちます。
4. 小さいはさみを使って手術を行います。臍のレベルでボタンホール切開を行い、腹腔内を開きます。白い線に沿って腹部の筋肉を切開 (「リネア アルバ」)、剣状突起まで。
5. 横隔膜の腹部の表面を視覚化するために商業的または自家製のリトラクターを使用して腹部の筋肉を撤回します。
   注: これらのリトラクターは、midi サイズ ペーパー クリップ L フック¹⁹に形から作成できます。
6. 開腹とベンチ コートにリトラクターをテープの両方の側面を伸ばします。ビューのフィールドの照明を最適化すると、横隔膜の腹部の表面は周縁部のこれ以上ないです。この目的のための最も強力な照明装置が方向付けできる光線の LED ランプです。
7. 柔らかいピンセットを使用すると、1 つの手で、xyphoid の付録を持ち上げて、側葉の肝臓 (図 2 a) をプルダウンします。胆嚢またはダイヤフラム (図 2 b) を損なうことがなく、靱帯をカット小さなはさみを使用すると、他の一方で、慎重に。
8. 柔らかいピンセットを使用すると、1 つの手で、xyphoid の付録を持ち上げます。一方でハミルトン シリンジを把握します。内側や下腿の地域 (図 3 a、図 3Bの挿入)、胸骨をそれぞれカバーする右片側横隔膜の注入の 3 つのサイトをターゲットします。
9. ダイヤフラム厚は約 0.37 mm マウス⁷で、呼吸時に肺損傷を防ぐためにダイヤフラム シートを超えて針より 1 または 2 mm を挿入します。各サイト (図 4 b) で右の横隔膜を CTB 溶液 (0.2 %w/v) の 2.5 μ L を提供します。横隔膜の安定化が必要ではありません。
10. PhMN プールの二国間分類、髓注入 (図 1 a) の 3 つの同サイトでは、この手順を繰り返します。
11. 開腹サイトを閉じる、吸収性と腹筋 4-0 縫合糸を縫合します。使用中断ステッチ間隔によって 3 mm. の定番肌は傷 9.0 mm クリップで閉じている.ステープルを引っ張ってから動物を防ぐためにステープルを締めます。スペース約 5 mm 間隔のステープルします。障害の治癒につながるよう、傷クリップを過剰締めください。
12. きれいなマイクロシリンジの目詰まりを防ぐために蒸留水。ゆっくりを描画し、追放する 2-3 回。注射器に空気を描画しません。

4. 左胸腔内注入胸壁アプローチを使用して

注: このメソッドはラット⁴で説明されている手順からインスピレーションを得たが、マウスに合わせられました。

1. 麻酔下マウス左側臥位置、加熱パッド (図 4 a) の上に置きます。
2. 手動触診 (図 4 b)、肘地域の下 6 番目と 7 番目の肋骨を識別します。
3. アシスタントは、右手前- と -後肢 (図 5 a) を拡張しながら、注射器の頭側方向と接線方向 [第 6 または第 7 肋骨、3 mm ダウン (図 1 bと図 5 b) ベベルの皮膚から深いを挿入します。
4. 肋骨を持ち上げて、胸腔内 (図 5、図 1 bのくぼみ) にも配置されていることを確認してそっと針を昇格させます。
5. 胸壁に 2 本の指のわずかな圧力を適用することによって、胸の動きを呼吸を安定させます。
6. もう一方の手で注射器を押した CTB 溶液 (0.1 %w/v) 単一の注入の 20 μ L を提供します。

5. 手術後のケア

1. 手順の後すぐに右側臥位の回復のための恒温パッドの上でマウスを置きます。これにより、トレーサーが胸腔内の右側の上に広げ、動物の呼吸を監視するため。
2. 皮下 1 mL 滅菌生理食塩 i. p. を管理します。脱水や物憂げな動物が表示されている場合は、フォロー アップの注射を提供します。
3. ブプレノルフィン、0.1 mg/kg を皮下管理任意の潜在的な痛みを最小限に抑えるため最初 2 日後手術中に 1 日 2 回。
   注: 多くの機関は、ここで描かれている開腹術などの侵襲的処置のためのマルチ モーダル鎮痛を推薦します。これは、非ステロイド性抗炎症 (NSAID) 薬や切開部位に局所麻酔薬の使用を含めることができます。これらの薬は、通常ねじまきの痛みを最小限に抑えるための最初の切開前に配信されます。
4. 毎日安楽死まで動物を監視します。

結果

男性の c57bl/6 j マウス (n = 18)、3 から 4 ヶ月に高齢者が研究に含まれていた。実験の日 0、8 マウスは公開プロトコル^7,18によると一方的な C4 挫傷、右サイドを受けた。偽の手順としては、10 匹のマウスは、挫傷なし C4 の上に椎弓切除術を施行した.3 日目でマウスは上記で説明した 2 つの異なる手順によると CTB fluorophore の左?...

ディスカッション

記載プロトコルは、成体マウスの任意のひずみまたはダイヤフラム PhMN 回路の整合性を評価する必要がある任意の実験パラダイムを適用できます。例えば、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄損傷 (cSCI) は、横隔神経軸索と後続の呼吸の妥協の前向性変性 PhMN 損失に関連付けられている条件です。ALS または cSCI の動物モデルは人間の病気にみられる病理組織学的および機能の呼吸欠損を模倣しま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm