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要約

本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

要約

細胞遊走は、創傷治癒に必須の側面です。人工を作成する傷を研究の動物モデルにコストがかかり、複雑な実験手順の結果にしばしば潜在的精度に欠けている間。上皮細胞の体外培養は、創傷治癒と細胞の治療法の影響で細胞の回遊行動の研究のため適切なプラットフォームを提供します。上皮細胞の生理学は非合流条件でよく勉強しました。ただし、このアプローチは、自然治癒で条件に類似しないかもしれない。機械的手段によって上皮の整合性を中断することは現実的なモデルを生成しますが、分子技術のアプリケーションを妨げることがあります。したがって、顕微鏡技術は上皮細胞の遊走を勉強に最適体外。ここで我々 は, 上皮細胞の渡り鳥の性能に関する量的・質的データを入手できる人工移行フロント アッセイ、人工傷スクラッチ試験 2 つの特定の方法を詳しく説明します。

概要

上皮のギャップの最終的な閉鎖と混乱の表面1の修復を担当しており、細胞遊走は創傷治癒に必要です。動物モデルにおける人工傷を実行できるように生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスを複製するため。しかし、このアプローチは多くの場合コストがかかり、複雑な実験の手順、可能性のある創傷治癒過程の複雑な性質のための明確なプロセスの研究の精度を欠いている結果します。

上皮細胞の体外培養は、創傷治癒や処理セルの回遊行動に及ぼす影響のこれらの細胞が果たす役割を研究するため動物モデルの有用な代替を提供します。上皮細胞の生理学は非合流文化3,4,5,6; を使用して分子技術によってよく勉強しました。ただし、上皮整合性の破壊は結構機械的切開により通常。細胞培養、細胞のほとんどの数は、傷のギャップにさらされるかもしれないし、彼らは分子生物学の技術のための余りに小さいサンプルを表すこれを意味します。ただし、これらの病変は、ミンク肺上皮細胞 (Mv1Lu) または自然不死化ひと表皮細胞 (HaCaT) セルなど、いくつかの上皮細胞ラインの生得的な渡り鳥の特性を利用して、顕微鏡のスケールで学ぶことができます。ライン。

ここでは創傷治癒の3,4,7,8のコンテキストにおける上皮細胞の移行に関する定量的データを取得する適切な顕微鏡法について述べる。また、移行上皮膜で発生した質的分子および形態学的変化を研究に役立つその他の方法を提案する.全体的にみて、これらのメソッドは、創傷治癒過程におけるダイナミクスと上皮細胞の挙動と治療への応答に関与の形態的変化を研究するためのフレームワークを提供します。

プロトコル

1. 人工傷スクラッチ アッセイ定量的研究

  1. セル膜の準備
    1. 無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization9を使用してセルをデタッチします。
      注: Mv1Lu と実装された EMEM と DEMEM の培養液を使用して上皮細胞株を培養している HaCaT それぞれ 2 mM L-グルタミンを添加したし、5% CO2の制御された雰囲気と 37 ° C で培養しました。すべての細胞株は細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する徹底的に試金する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の x 10 の4または 104細胞/ウェル、x 4-6 2 4 それぞれがシード 175 cm2培養用フラスコのと最大 35 x 106 Mv1Lu または 1 × 107 HaCaT 細胞 80% で合流点が得られます。
    2. どちらかの 12、または 24 ウェル培養プレートの各ウェルの細胞の 2 mL の種子します。すべて 24-48 h. 確認セル番号が 2 または 3 日後 100% の合流点に到達するために十分に高い媒体を更新します。
    3. 細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除き、新鮮な無血清培地で 2 回洗います。スクラッチ前に 24 h の無血清培地で細胞を保ちます。
      注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、セルライン無血清条件下で自発的にデタッチに影響を受けやすいためポリ L リジン溶液を用いた培養プレート面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。
  2. 単分子膜傷
    1. しっかりと 20 μ L またはスクラッチの幅に応じて、200 μ L 滅菌ピペット先端の狭い端をドラッグして文化単層をスクラッチ無菌環境で作業します。先端のギャップの均質性を最大化する文化面に垂直を維持します。
      1. 明らかに単層細胞を監視する暗い表面上培養皿に置きます。必要な場合は、各ウェル 4 移行の領域まで勉強するの (十字型) 2 つの垂直の傷を実行します。
    2. 軽く培と優しく追加新鮮な無血清培地を削除して剥離細胞を洗ってください。2 回繰り返す最も接続されていないセルを削除するまで、または。
  3. 実験の手順とデータ収集
    1. まあ CCD カメラを組み込んだ倒立位相差顕微鏡を使用して各からスクラッチのギャップを中心とした最大 4 前処理参照画像を取る。傷の隣接する交差点に顕微鏡フィールドの端を合わせて、関心領域を選択します。
      注: 通常、画像を用いている 10 倍の倍率、1,280 x 1,024 ピクセルのイメージ サイズ。前述のローカライズを容易およびウェルあたり最大 4 測定法の検証のために役立ちますようの関心領域を選択します。
    2. 一度すべての画像を取得、指定治療井戸;選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。
      注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。
    3. 観測範囲 90% スクラッチ ギャップ閉鎖条件まで傷プレート (5% CO2を含む制御された雰囲気の 37 ° C) を孵化させなさい。完全な閉鎖を避けるため。
      注: 合計ギャップ閉鎖の後処理の画像コレクションを無効リファレンス領域が検出されないし、ギャップの閉鎖のために参照を確立できません。Mv1Lu または HaCaT 細胞の場合 16-19 h は 90% の合流点に到達する必要があります。
    4. したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。
    5. 過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。
      注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。
    6. 傷後キャプチャ元の参照領域から各ウェルの治療後の参照画像を取る。同じ機器 (倒立光学位相差顕微鏡 CCD カメラを組み込んだ) と一致する画像の設定 (倍率とデジタル解像度/密度) を使用します。
      注: 個々 のセル移行速度の計算ができる可能性があります時間コース画像を個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める細胞としていること。
  4. 移行の画像解析と定量
    1. 画像処理ソフトウェア (例えばImageJ) を使用すると、スクラッチ ギャップ制限を定義し、治療前の写真で 4 つまでの測定のための gap 表面を決定します。「表面前処理ギャップ」としてデータを記録 (PREGAP)。治療後の写真は、同じ手順を繰り返します。「治療後ギャップの表面」としてデータを記録 (POSTGAP).
      1. ImageJ を使用して記録された画像を開きます。「画像」メニューで画像の種類を 8 ビットに設定します。「プロセス」メニューで「フィルター」サブメニューに移動し、、"変動"のフィルターを適用。
      2. 「画像」メニューで"調整"サブメニュー黒と白に設定されたしきい値を入力してください (B & W)、「暗い背景」が選択されていないことを確認します。「プロセス」メニューの"バイナリ"サブメニューに移動し、「穴を埋める」を選択します。
      3. 「分析」メニュー「測定を設定」を選択、「エリア」アクティブに。測定領域次のギャップを区切る移行のエッジの輪郭を描画します。
      4. 「分析」メニューの「粒子の分析」を選択し、描画エリア表面の「合計領域」の値を記録します。
    2. ギャップ表面測定の差として個々 のサンプルのセットごとに絶対移行を定量化するスプレッドシートの PREGAP、POSTGAP の総面積値を紹介: プリギャップ − POSTGAP [任意単位]。さらに、各コントロールのサンプル条件の絶対移行データを正規化: (サンプル ・制御) * 100 [%]。
      注: セルを個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める、絶対移行により計算できる中央に侵入セルをカウントのいずれかのストリップコントロールまたは扱われたサンプル。
    3. (図 1参照) 数量出力をプロットします。必要であれば、統計分析を実行します。
2 つの条件または条件の大きい数のための分散分析のテストを比較するときは、スチューデントの t 検定を検討してください。

2. 人工移行フロント アッセイ地形の研究

  1. セル膜の準備
    1. 無菌状態での作業は、プレートの表面が完全に覆われるまで空培養皿に滅菌ラウンド coverslips の 1 つのレイヤーを配置します。
      注: 12 と 33 coverslips までに収まる 5 cm と 10 cm 径プレート、それぞれ。
    2. 培養プレートに 2 〜 3 日後 100% 合流ができる濃度で細胞の十分な量を優しくシードします。Coverslips が滅菌ピペット先端で穏やかな圧力を適用することによって浮遊するを防ぐし、coverslip が隣接 coverslips 重なっていないかどうかを確認します。媒体ごとの 24-48 時間を更新します。
      注: すべてのセルの行を徹底的にで検定して細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の 2-3 x 10 の6または 10 の6セル/10 cm 径プレート x 2.5-4、それぞれシードされます。小さめの皿で細胞数をスケール ダウンする必要があります。
    3. 細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除きし、新鮮な無血清培地に置き換えます。人工傷を実行する前に、24 h の無血清培地で細胞を維持します。
      注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、細胞無血清条件下で自発的にデタッチの影響を受けやすいのポリ L リジン溶液を用いた培養面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。
  2. 単分子膜を傷つける
    1. 滅菌ピンセットを使用して、優しく新鮮な無血清培地を含むクリーン 10 cm プレートに観察を移動します。ピンセットで周囲に、coverslip を保持することによって、単分子膜の損傷を防ぐ。Coverslip 破損の恐れのある過度の圧力を避けます。
    2. 人工傷を作成するには、coverslips の中央に横ラインの殺菌かみそりの刃をドラッグします。中央の単分子膜のストリップを完全に削除するために戻って来たり、3-4 mm をドラッグします。細胞の残骸残って負傷のエッジに接続されていないことを確認します。
      注: 12 mm 径の coverslip、ラウンド、切開で、半ば、カバーガラスの。以下の手順でカバーガラスの傾斜を避けるために (少なくとも 2 mm 幅) 十分に大きい主な正面の反対側セルの連勝を残してください。
    3. きれいな 6 ウェル プレート含む少なくとも 2 mL 新鮮な無血清培地に、上向きのセルと負傷者 coverslips を転送します。最大 4 負傷 coverslips/よくに合います。
    4. 水洗いして 2 回使用新鮮な無血清培地戸建のセルを削除します。
  3. 実験方法及びサンプリング
    1. 優しく選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。
      注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。任意の潜在的な細胞の剥離を避けるために慎重に進みます。
    2. 目的の実験的タイミング (37 ° C、5% CO2) セル インキュベーター内のプレートを保ちます。
    3. したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。
      注: コース実験の時間のため培養プレートからサンプルを削除、その他、継続的な実験条件に影響を及ぼすホルマリン煙を避けるために別皿でそれらを修正します。
    4. 過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。
      注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。
  4. 蛍光抗体法 (IF) とトポロジー解析
    1. IF の染色を行いとして個々 coverslips にイメージングは別記3,4,11。
      1. Coverslips PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液を浸すことによって 10 分間 permeabilize します。
      2. 次のブロックのソリューションを使用して 30 分間ブロック: 0.3% ウシ血清アルブミン。10% 牛胎児血清;5% のスキムミルク。PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液。
        注: ミルクなし解決を妨げること事前に準備ができ-20 ° C で保存
      3. 牛乳無料ブロッキング液で希釈した一次抗体と湿ったチャンバ内の室温で 1 時間インキュベートします。Coverslips に逆さまの状態で適切な配分を確保するため 15 μ L 抗体溶液を配置します。
        注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ウサギ抗 c 6 抗体は 1/100 希釈を必要とします。
      4. PBS での 0.1% トリトン X-100 溶液で coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。
      5. 30 分間無料のミルク ブロック バッファーで希釈した二次抗体に coverslips を孵化させなさい。
        注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ヤギ抗うさぎ (488) は、最適な解像度の 1/400 希釈を必要とします。ヘキスト 33258 ファロイジンなど他の標識化合物は、この段階でインキュベーション バッファーに追加できます。
      6. PBS で 0.1% トリトン X-100 溶液 coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。
      7. Coverslips 逆さまの状態で 10 μ L マウント メディア ドロップ (例えばVectashield) 顕微鏡スライド上に配置をマウントします。取付中硬化一晩室温で暗闇の中でスライドを残します。その後、無期限に暗闇の中で 4 ° C で保存します。
    2. 落射蛍光または移行の前面の端で発生した構造変化の共焦点顕微鏡画像のいずれかを取得します。
      注: トポロジー研究は、内側の膜に移行する前から写真を並べて実行できます。半定量的な研究がローカル蛍光強度に基づくソフトウェア分析によって可能です。

結果

定量的研究のため人工傷スクラッチ試金: 移行上皮成長因子 (EGF) 推進を評価します。

EGF は、上皮細胞の増殖と移行、およびこうして移行推進を定量化するための肯定的な制御のよく知られている誘導です。Mv1Lu と HaCaT 細胞膜が傷傷試金で使用された、治療前の写真が得られました。10 ng/ml の EGF, 接種後のセルは固定と治療...

ディスカッション

皮膚または粘膜の破壊、線維芽細胞、上皮や免疫細胞など、様々 な細胞タイプの行動によってバリア機能が復元されます。相まって、これらの細胞を受ける複雑なアポトーシス、増殖、分化、重要なは、線維芽細胞を含むプロセスと上皮細胞の移行、混乱の組織の修復のための責任の究極のメカニズムであると表在性上皮ギャップ1,12細胞遊走を勉...

開示事項

著者は、利害の対立がないことを宣言します。

謝辞

改善し、実際の状態にこれらのテクニックを絞り込むに役立つ演習の古いメンバーに感謝したい: 博士シーリア ・ マルティネス-モーラ;博士アンナ Mrowiec、博士カタリナ ルイス自慢、博士アントニア ・ アルカラス ガルシア。これらの技術の開発を強く支援病院臨床ウニベルシタリオ ビルゲン デ ラ Arrixaca にお世話になっております。セルバンテス ・ デ ・またサラッド カルロス 3 世、フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias。Estatal を計画私 + D + 私とセルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III Subdirección 一般 06 y 開発デ ラ危惧 (許可番号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos ・ フェダー「Una manera デ hacer エウロパ」。我々 も行政も支援をグァテマラ ・ デ ・ ムルシア、IMIB Arrixaca、外国金融機関に感謝します。最後に、我々 は博士イサベル ・ マルチネス-Argudo と Facultad デ芸術報 Ambientales y Bioquímica、キャンパス ′ デ ラ Fábrica デ アルマス、グァテマラ カスティーリャ ・ ラ ・ マンチャ州、トレド喜んで譲ることで彼らの親切なサポートのおかげでスペシャルを与えたい、バイオ医薬品と本稿の撮影の一部を実現するためのバイオ テクノロジー研究室。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FranceL0102-500Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOptional 10 % FBS supplement
L-GlutamineLonzaBE17-605EUse at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Dilute as appropriate
Poly-L-LysineSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-067Dilute to 1x
24-well culture platesBD FALCON//SARSTED734-0020
6-well culture platesSARSTEDT83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Used 10 ng/mL
Round cover glassMENZEL-GLÄSERMENZCB00120RA020SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743Martor (through VWR)MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscopeMotic SpainMoticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscopeZEISS Microimaging, GermanyLSM 510 META
10 cm Culture dishBD FALCON353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibodySanta Cruz Biotechnologysc-1694Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488InvitrogenA11008Used 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)InvitrogenA12381Used 1:100
Bovine Serum AlbuminSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Skim milkBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USARelease 1.50i
Zen LSM 510 image processing softwareZEISS Microimaging, GermanyRelease 5.0 SP 1.1

参考文献

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