有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

要約

肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。

要約

本論文では、肝細胞における環境有機塩素農薬(OSP)による代謝障害の原因をより深く理解するための、肝ミトコンドリア機能の検出に関する詳細な方法を紹介する。ヘプG2細胞は、一般集団における内部曝露の等価用量で24時間のβ−ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。肝細胞における超構造を透過電子顕微鏡(TEM)で調べ、ミトコンドリアの損傷を示した。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。ミトコンドリア緑色蛍光プローブで染色後のミトコンドリア蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した。ルシフェリン-ルシメラーゼ反応を用い、ATPレベルを決定した。MMPを、カチオン色素JC-1によって検出し、フローサイトメトリー下で分析した。OCRは細胞外フラックス分析装置で測定した。要約すると、これらのプロトコルは、ミトコンドリアの損傷を調査するために肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するのに使用された。

概要

健康に対する有機塩素農薬(OMP)の影響、例えば生殖障害、免疫毒性、代謝変化は^{、以前に検討}された^{1、2、3。2,3}細胞代謝を検出し、ミトコンドリア機能障害を発見する方法は、科学者がミトコンドリア機能の役割を理解することを可能にしました (すなわち.、 ミトコンドリア STAT3レベル、 乳酸、 ピルビン酸、 乳酸とピルビン酸比、 コエンザイム Q10、 ミトコンドリア陽子漏れ、生体精エネルギー、生物発生、および動力学) 老化、肥満、糖尿病、心血管機能、癌、および安全毒性^4,,55,6,,7.本論文では、オプスによるミトコンドリア機能障害の評価方法について述べている。

HepG2細胞をヒトの内部暴露に相当する用量で24時間の代表的なOCPであるβ-ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。まず、TEMを適用して、核、ミトコンドリア、小胞体⁸などの肝細胞の超構造を観察した。通常の顕微鏡と比較して、TEMは、細胞および細胞成分(細胞株または組織)の2Dおよび3D超構造、形態、化学組成、ならびに現代の科学技術において極めて重要な役割を果たす天然または人工材料の機能を探求することを可能にする。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。水戸トラッカーグリーンは、生細胞ミトコンドリア特異的蛍光染色に使用できるミトコンドリア緑色蛍光プローブです。肝細胞におけるミトコンドリアを、ミトトラッカーグリーン溶液とミトコンドリア蛍光強度で染色し、数とパターンを共焦点顕微鏡⁹で観察した。ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、生細胞を染色するために使用することができる。ローダミン123またはJC-1と比較して、ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、ミトコンドリア染色のミトコンドリア膜電位に依存しない。ATPレベルはルシファーゼ-ルシフェリンキットによって決定され、タンパク質濃度によって正規化された。ATPアッセイキットは、一般的な溶液、細胞または組織のATPレベルを検出するために使用することができます。このキットは、エネルギーを提供するためにATPが必要な場合、蛍光を生成するために蛍光を生成するために蛍光を触媒ホタルルシファーゼをベースにしています。ホタルルシメラーゼとフルオレセインが過剰である場合、ある濃度範囲では、蛍光の発生はATPの濃度に比例する。さらに、このキットはATPの化学発光を最大限に活用するために特別に設計されていた。ATPは、最も重要なエネルギー分子として、細胞の様々な生理学的または病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ATPレベルの変化は、細胞機能、特にミトコンドリアエネルギー産生の欠陥を反映することができる。通常、アポトーシス下で、 壊死またはいくつかの毒性状態で, 細胞の ATP レベルは ^10.JC-1のMMPアッセイキットは、細胞、組織、精製されたMMPを迅速かつ敏感に検出するための蛍光プローブとしてJC-1を使用するキットです。アポトーシスの早期発見に使用できます。カチオン色素JC-1は、緑と赤色の蛍光比の変化によって示されるフローサイトメトリー下で分析することができるMMPを検出するために使用される蛍光プローブです。MMPが高いとき、JC-1はミトコンドリアのマトリックスに凝集してポリマー(J-凝集体)を形成し、赤色蛍光を生じる。MMPが低いと、JC-1は蓄積できず、緑色蛍光¹¹を生成する単量体を形成する。したがって、赤と緑の蛍光の比率は、MMPのレベルを反映することができます。細胞のOCRは、正常な細胞機能¹²の重要な指標である。ミトコンドリア機能を研究するためのパラメータとみなされます。細胞糸球菌ストレステストキットは、ミトコンドリア機能の主要パラメータを分析するための安定した方法を提供します。このキットは、細胞ミトコンドリアストレステストを行うための標準的な方法と同様に、品質管理と予測試薬を提供します。これは、すべての細胞タイプを検出するために使用することができます, プライマリ細胞を含みます, 細胞株, 浮遊細胞, また、小島, 線虫, 酵母と単離ミトコンドリア.

OCR測定は、細胞の生理的状態または変化に関する貴重な洞察を提供することができる。これは、呼吸ベースライン、陽子漏れ、最大呼吸、ATPターンオーバーおよび予備容量を検出するために細胞外フラックス分析装置で決定された。簡単に言えば、OCRのベースライン測定の後、OCRはオリゴマイシン(ATPカプラ)、FCCP(ミトコンドリア酸化リン酸化アンカプラー)および抗マイシンA/ロテノーネ(酸素消費の阻害剤)に順次添加した後に検出された。

インビトロでの肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するためのより具体的なプロトコルの開発を促進するために、ここでは、ミトコンドリアの損傷関連有害な結果を研究する際に、TEM、共焦点顕微鏡、ルミノメーター、フローサイトメトリーおよび細胞外フラックス分析による実験を提示する。

プロトコル

すべての実験と実験プロトコルは、関連するガイドラインと規制に従って行われ、南京医科大学の地元の倫理委員会によって承認されました。

1. TEMによるミトコンドリア超構造

1. HepG2細胞の収集
   1. 100 mm の皿の種 HepG2 細胞。37°C、5%CO2で₂保管。
   2. 1.5 mLEPチューブに0.25%EDTAを有する消化細胞。
   3. 室温(RT)で3分間1000 x g で遠心分離機。上清を捨てます。
   4. 4-6 x 10⁵ HepG2細胞を収集します。
2. ピペットを用いて5%グルタルアルデヒド(溶媒:二重蒸留水)を1 mL加え、4°Cで2時間インキュベートします。
3. リン酸緩衝液の4 mL(Na2₂HPO4、KH2_2PO4、NaClおよびKCl、pH 7.4を含む)の4つの変化に加えて洗浄し、それぞれ15分。₄ピペットでリン酸バッファーを吸い出します。
4. 200 μmの1%オスミウム(溶媒:二重蒸留水)を加え、4°Cで2時間黒色サンプルにインキュベートします。
   注意: オスミウムは非常に有毒で揮発性の物質です。それは慎重に薬物キャビネットで操作する必要があります。
5. リン酸緩衝液1 mLの2つの変更、それぞれ5分で加えて洗浄します。リン酸緩衝液を吸い出す。
6. 2%ウラニル酢酸溶液中の染色(溶媒:二重蒸留水および酢酸)を1.5mLEPチューブで2時間用。
7. 脱水して50%アセトン、70%アセトン、90%アセトン(溶媒:二重蒸留水)を通して、2つの絶対アセトンの変化、それぞれ15分を経て沈下する。
8. 2滴でアセトン(100%)/埋め込み剤(1:1)でRTで1.5時間浸透。Epon812埋め込み剤は、レシピは次のとおりです: A: Epon812, 62 mLとDDSA, 100 mL;B:Epon812、100 mLおよびMNA 89 mL。A:B=2:8(v:v、冬)、A:B=1:9(夏期はv:v)。埋め込み金型に埋め込む(チェックグリッド付きのソフトプラスチックプレート)。
9. 37°Cで12時間、45°Cで12時間、60°Cで48時間培養します。
10. ウルトラ薄切片マシンとTEM(2μmおよび500 nm)で、超薄型セクション(最大面積は0.5mm×0.3mmを超えることはできません)を準備し、観察します。

2. ミトコンドリア蛍光強度検出

1. シード 2x 10⁴ 6 ウェルプレートの HepG2 細胞。24時間にβ-HCHを加えます。
2. 無水DMSOを加えるため、1 mMミトコンドリア緑色蛍光プローブの最終濃度を作り出します。
3. 6ウェルプレートのウェルごとに1 mLミトコンドリア緑色蛍光プローブ溶液(最終濃度:200nM)を加え、37°Cで45分間インキュベートします。
4. ミトコンドリアグリーン蛍光プローブ溶液を取り出し、イメージング前に37°Cで作りたての細胞培養培地(DMEM)を添加します。
5. ミトコンドリアグリーン蛍光を蛍光顕微鏡(10x)で観察します。検出時の最大励起波長は490nm、最大発光波長は516nmです。

3. 細胞の ATP レベルのアッセイ

1. 6ウェルプレートにHepG2細胞をシードします。24時間にβ-HCHを加えます。
2. ルシファーゼ-ルシフェリンATPアッセイキットから6ウェルプレートの各ウェルに200 μLのライシスバッファーを追加します。4°Cで5分間12,000 x g で遠心分離機、新しいチューブにピペットで上清を収集します。
3. ATP検出試薬を1:5の比で、ATP検出バッファーとして希釈します。
4. 標準曲線決定を準備する:ATP標準溶液の0.5 mMを10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μMにATP溶解バッファーで希釈します。
5. RTで5分間の96ウェルプレートに100μLのATP検出バッファを追加し、セルの上澄み液を100μL加え、ルミノメーター(化学発光検出器)で検出します。標準曲線を使用して ATP 濃度(nmol/L)を計算します。
6. BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度をマルチモードリーダーで検出します。
   1. 標準曲線決定の準備:タンパク質標準溶液の5 mg/mLを0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mLに二重蒸留水で希釈します。
   2. 96ウェルプレートにセルの上清1μLを加え、19μLの二重蒸留水を加えます。
   3. 各ウェルに対して200 μLのBCA検出ソリューションを追加します。37°Cで30分間インキュベートします。562 nm のマルチモード リーダーで OD (光密度) 値を検出します。標準曲線を使用してタンパク質濃度(mg/mL)を計算します。
7. mgタンパク質濃度あたりのATP含有量を補正します(単位:ATP濃度/タンパク質濃度、nmol/mg)。

4. JC-1によるミトコンドリア膜電位(MMP)評価

1. 6ウェルプレートに播種HepG2細胞を収集します。1.5 mL EPチューブに0.25%EDTAを有する消化細胞、1000 x g で3分間遠心分離し、上清を捨てて細胞を収集する。
2. 蒸留水を8mLに50μL(200X)に加え、混合します。JC-1検出液として2mLの染色性染色バッファーを追加します。
3. 細胞培養培地の0.5mLとJC-1検出溶液の0.5 mLを37°Cで20分間混合して細胞をインキュベートする。
4. 遠心分離機 600 x g で 3 分 4 °C. 上清を捨てます。
5. JC-1(1X)染色バッファーの1mLの2変化でリンス、遠心分離機は600xgで3分間g4°Cで3分間。 そして上清を捨てる。
6. JC-1(1X)染色バッファーの0.5 mLで細胞を懸濁し、フローサイトメトリーを介して分析し、緑色および赤色の蛍光を検出する。JC-1ポリマーが検出されたら、励起光を490nmに、発光光を530nmに設定します。JC-1ポリマーが検出されたら、励起光を525nmに、発光光を590nmに設定します。

5. 酸素消費率(OCR)測定

1. ヘプG2細胞を細胞培養マイクロプレートに96ウェルの濃度で、4500個の細胞/100μLの密度で播種します。24時間後に各ウェルで覆われた細胞を確認してください。
2. 前の文献¹³に従って、調製された試薬の適切な容積を適切な注入ポートに加える。ポートA:25 μL 1 μMのオリゴマイシン(ATPカプラ)ポートB:25 μL 0.75 μM FCCP(電子スロットル制御、ETCアクセラレータ)ポートC:μM抗ミシンA/ロテノーネ(ミトコンドリア阻害剤Aおよびミトコンドリア阻害剤B)の25 μL 0.5。
3. 使用できる状態になるまで_、CO2 のない37°Cインキュベーターにカートリッジを保管してください。
4. 各ウェルから実行媒体を取り除き、新しいDMEMに追加することで、セルプレートの中程度の変更を行います。各ウェルの最終ボリュームは180 μLです。
5. 細胞プレートを、アッセイ前に1時間_CO2 を使用しない37°Cインキュベーターに保管してください。
6. ソフトウェアによって自動的にOCRを記録します。
   1. OCRソフトウェアを開きます。
   2. [アプリ] ドロップダウン メニューで [セル ミトストレス テスト キット] を選択します。
   3. [アプリの開始] ボタンをクリックします。
   4. [ストレス テストの実行] ボタンをクリックします。セルストレス テストのセットアップ画面が表示されます。
   5. 次の手順を実行します。
      1. [セルシード番号] ボックスにウェル当たりのシードセル数を入力します。
      2. [平均基底 OCR] ボックスに平均 OCR を入力します。
      3. 各試薬の最終作業濃度を入力し、試薬を注入します。
         注: 細胞のシード濃度を最適化する際に最適化アッセイを実行する前に、セルの平均基底OCR値を検出しておく必要があります。
      4. [次へ] ボタンをクリックします。グループ情報画面が表示されます。
      5. 色を選択し、名前を与え、適切な井戸をクリックして、未割り当ての井戸にグループを割り当てます。
         注: 異なるグループは、細胞水戸ストレステストを実行する前に、異なる治療として定義されています。マイクロプレートのすべてのウェルは、ストレステストが実行されたときに同じ試薬注射を受けます。
      6. [次へ] ボタンをクリックします。[ストレス テストインジェクション レイアウト] 画面が表示されます。
      7. [開始] をクリックします。ストレス テストがアナライザーで実行されるようになりました。実行が終わったら、ソフトウェアのポイントに従って、カートリッジとセルプレートを取り外して廃棄します。

結果

β-HCHに曝露したHepG2細胞のミトコンドリアクリステは著しく損傷を受けた。散在したミトコンドリアは、比較的異常なミトコンドリア建築で、著しく膨張し、不規則な形状、およびミトコンドリア尾根が消失した軽度であった(図1)。

ミトコンドリアを表す平均ミトコンドリアグリーン蛍光強度は、β-...

ディスカッション

検出プロトコルの成功に不可欠なのは、表現型からメカニズムまで研究をカバーしてきた様々な実験方法の使用である。本研究では、ヘプG2細胞をペニシリンおよびストレプトマイシンおよび10%胎児ウシ血清でDMEMで培養した。細胞が合流率40~50%に達すると、β-HCH(0,10,100 ng/mL)を加え、24時間インキュベートした。代表のPPSによる肝細胞の超構造変化を示すTEMをまず用いたβ-HCHは、ミトコンドリ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.