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要約

ヨーロッパのウナギの成熟と精子の凍結保存のためのプロトコルは、最後の年にわたって改善されています。この資料では、成熟と保護剤の検討としてメタノールを誘発するひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) で使用可能な最適なプロトコルについて説明します。

要約

最後年の間にいくつかの研究グループは開発とヨーロッパのウナギ処理と成熟の新しいプロトコルの改善に取り組んでいます。としてまだ、ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の毎週の注射は治療の数週間中に質の高い精子の大量の生産わずか 5-6 週間後の男性の成熟に証明しています。さらに、精子凍結保存のプロトコルが異なるエクステンダーを使用して、凍結保護剤と冷却時間を解凍以前について記載されているヨーロッパのウナギ。ここで、紹介受精、凍結保存、Tanaka´s ・ エクステンダー ・ ソリューションが直接使用することができます不要な解決方法および希薄のさまざまな種類の使用法を作るします。さらに、このプロトコルにはメタノールは毒性が低いと、精子をアクティブにしません、保護剤の検討としてメタノールを使用では使いやすいのものとなります。精子は、保護剤の検討、添加後すぐに凍結保存する必要はありません、解凍されて後に長く使用できます。また、精子の運動性は新鮮な精子のそれより低いが融解後依然として高いです。この作業の目的は、ヨーロッパウナギの最高の利用可能なプロトコル処理、成熟、精子凍結保存を表示することです。

概要

過去 25 年間欧州ウナギ (アンギラ) ヨーロッパの海岸に到着の数は 90 1,2,3で着実に減少しています。汚染、感染症、乱獲や生息地の破壊を含む抜本的な低下を説明するいくつかの要因があります。これのすべてが重要な絶滅危惧種4としての性質 (IUCN) リストのための国際連合のヨーロッパのウナギを含めることにつながる、この種に大きな影響を与える。その結果、技術や飼育下で繁殖のためのプロトコルの開発が必要です。

捕われの身でヨーロッパのウナギの成熟はホルモン治療5,6,7によって達成されるが、雌雄の配偶子の生産は8を同期することは困難。ウナギ9,の形成を加速する新しいアンドロゲン インプラントの開発を示しているにもかかわらず10女性に最終的な成熟のタイミングはまだ変化して11を制御することは困難。したがって、精子12,13,14および凍結保存技術の短期的なストレージ、繁殖管理、配偶子同期不要な8を作るために必要です。

2003 15,16以来ヨーロッパうなぎ精子の凍結保存をしました。いくつかの研究では、凍結保護剤16,17,18,19,20としてジメチルスルホキシド (DMSO) やメタノールのいずれかを使用して成功したプロトコルを設計されています。両方のプロトコルが正常に使用されているが、DMSO を凍結保存後解凍精子の細胞生存率はメタノール20,21より低い。また、うなぎ精子は DMSO との接触で活性化されより退屈な精子操作19が必要です、そのためメタノールより適切な保護剤の検討欧州ウナギ精子の DMSO よりも。

ここでは、最適なハンドリングとヨーロッパのウナギのホルモン治療のプロトコルは、以下に記載します。これに加えて、この種の精子の質の評価のため、保護剤の検討とプロトコルとしてメタノールを使用して最高のヨーロッパウナギ精子凍結プロトコルは説明もします。

プロトコル

このプロトコルで記述されているヨーロッパのウナギを操作するためのすべての手順は、次の実験を制御するスペイン法令、大学パラオレイ ・ デ ・ バレンシアで動物実験倫理委員会によって承認されたと生きている動物のプロシージャ。

1. 魚の維持

  1. 研究施設にヨーロッパのウナギをもたらすと循環システムの 200 L 水槽に入れてください。定数 20 ° C の温度を維持するためにサーモスタットとクーラーを使用します。
  2. 実験中に食料もないとストレス22を避けるために暗い状態で魚を保ちます。
  3. 最初の 3 日間は、新鮮な水で魚を保ちます。水の 1/3 に変更し、37.0 ± の塩分濃度に到達するまで毎日海水を補充 0.3 g/l.

2. ホルモン治療

注: ホルモン治療毎週注射をひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の実験の全期間 (9 週間) ではあります。

  1. 食塩でホルモンを希釈して 1 IU/μ L の濃度で事前に hCG ホルモンを準備 (0.9 %nacl)。
    注: ホルモンは-18 ° C で一週間以上この濃度で希釈したを保存することができます。
  2. 魚を麻酔するには、システム水量 5 L と 40 L 柔軟なバケットを準備します。
    1. 250 mL のフラスコで 70% エタノール 100 mL にベンゾカインの 300 mg を希釈します。
    2. バケツで希釈ベンゾカインを注ぐ (最終濃度 0.36 mM) と適切にミックスします。これは、60 mg/L の最終ベンゾカイン濃度
    3. ベンゾカインと水に魚を個別に転送し、ベンゾカイン効力し、魚はきちんと麻酔まで数秒を待ちます。
      注: 魚に麻酔がかかることを確認、仰臥位の魚を配置し、それはまだその位置にとどまることをチェックします。
  3. ホルモンを管理、魚の重量を量るし、1.5 mL プラスチック チューブに魚の 1.5 IU/グラムの用量で hCG ホルモンを準備します。
    1. プラスチック製のチューブから hCG ホルモンで 1 mL 注射器を満たしなさい。
    2. 仰臥位と援助や注射器、麻酔下の魚を配置、腹腔内のエリアで慎重にホルモンを注入します。
  4. 魚を水槽に戻るし、それを完全に回復するまでを監視します。
    注: ホルモンの政権は、実験中は毎週実施しています。通常、ヨーロッパのウナギは、ホルモン治療の 6-7 週間後 spermating を開始します。

3. 精子サンプリング

  1. 最高品質のサンプルを得るためには、ホルモン投与6,23後 24 h の精子を抽出します。
  2. 手順 2.2 ベンゾカインで魚を麻酔します。
  3. 仰臥位で麻酔をかけられた魚をプレイス、蒸留水の噴出と性器をきれいし、水槽から海水が付いている接触によって性器または偶発的な精子の活性化に糞便汚染を避けるために、紙で慎重に乾燥します。
  4. 魚の両方の側面に指を置いて、慎重に押すと横方向に胸鰭から性器をうち精子を強制的にマッサージします。
    1. ないより多くの精子が生殖器の開口部から出るまでマッサージを繰り返します。
  5. 真空ポンプを使用して 15 mL プラスチック チューブに精子を収集します。
  6. 4 ° C で、採精された精子 1:10 修正 Tanaka´s エクステンダー ソリューション24 (137 mM NaCl、76.2 mM NaHCO3蒸留水) を希釈します。
    メモ: エクステンダー ・ ソリューションで精子は 4 ° C で維持する必要があります。

4. 精子品質評価

  1. 13人工海水を準備 (mm: NaCl 354.7、MgCl2 52.4、CaCl2 9.9、Na2SO4蒸留水 28.2、KCl 9.4) 2% ウシ血清アルブミン (BSA) (w:v)、8.2、1100 mOsm/kg に浸透するために pH を調整し、維持それは細菌の成長を避けるために 4 ° C で。
  2. 精子のコンピューター支援型分析 (CASA) のソフトウェアを開き、魚精子モジュールを選択します。
    1. ソフトウェアのシステム セットアップを開きますのプロパティをクリックします。そこに、毎秒 60 枚のキャプチャ オプションを設定します。負位相光学、マークラー商工会議所、10 倍の規模。
    2. 分析値の種と粒子領域より大きい 2 μ m2 20 μ m2よりも小さい魚を選択します。
    3. 速度パラメーター セル 10、45 μ m/s の間移動、45 および 100 μ m/s の間を移動するときに中に設定し、100 μ m/s よりも速く動くとき急速に設定低速に設定します。
      注: 10 μ m/秒よりも遅い速度で精子は immotile と考えられていた。
    4. 真直度 (STR) 80% としてプログレッシブの値を選択し、プロパティを保存します。
    5. フィールドのキャプチャ(カメラからのライブ画像のウィンドウが開きます) をクリックします。
      注: コンピューターによる精子分析システムは、顕微鏡、カメラ、画像解析ソフトによって形成されます。
  3. カウントのチャンバーの人工海水の 4 μ L を入れて精子ソリューション (エクステンダー ・ ソリューションで希釈した精子) の 0.5 μ L を追加します。
    1. イメージを集中させ、負のフェーズで 10 倍の倍率での顕微鏡を用いた。15 コンピューターによる精子分析ソフトウェアのビデオからのキャプチャ -をクリックして、アクティブ化後 s。
    2. 凍結保存用 70% よりも高い運動と帳票サンプルを選択すべてのサンプルを分析します。
      注: この凍結プロトコルの成功のため質の高い精子だけを選択する非常に重要です。

5. 精子凍結法

  1. 34 cm × 34 cm × 30 cm、5 cm 厚の発泡スチロールの箱で事前に液体窒素 (約 2.5 L) を準備します。
    注: は、すべての回で液体窒素の 4-5 cm の高さのレベルを保持します。
    1. あらかじめ精子を凍結するフローティング構造を構築します。ポリスチレン (20 cm × 5 cm) 2 個を使用して、2 のプラスチック チューブにそれらをバインドし、液体窒素で構造を配置します。この構造体は、表面 (図 1) に 3 cm のおおよその高さで液体窒素上にフロートする必要があります。

figure-protocol-3655
図 1.あらかじめ液体窒素で凍結用フローティング構造模式。構造は低密度 5 x 20 cm × 4 cm のスタイロ フォームの 2 つの部分で構成されています 14 cm のプラスチック製の管と接続されている cm。ストローは、液体窒素の上 3 cm のプラスチック製のチューブ上に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. 精子、エクステンダー ・ ソリューション 1 の比率でメタノールを混合して凍結保存ソリューションを準備: 8:1 1.5 mL プラスチック チューブし、軽くかき混ぜます。
  2. ピペットの助けを借りて、500 μ L ストローに凍結保存液の 480 μ l 添加し必要に応じて、粘土のモデリングの 1 つの端を閉じることによってそれらをマークします。
  3. 3 分間液体窒素の上 3 cm の高さで浮遊装置にわらを置きます。その後、液体窒素にわらを配置します。
  4. 10-15 分後、長い鉗子を使用して液体窒素貯蔵タンクにストローを転送し、すべての回で液体窒素に浸漬しておきます。ここでは、精子は無期限に保存できます。

6. 解凍方法

  1. 5.1 の手順で説明されているように液体窒素で発泡スチロールの箱を準備し、40 ° C で、水道水を 3 L ビーカーを使用して水のお風呂を準備します。
  2. 長い鉗子を使用して液体窒素貯蔵タンクから発泡スチロールの箱に冷凍精子をストローを転送します。
    1. 13 の 40 ° C で水のお風呂にそれぞれ藁を入れて s。
    2. はさみでストローのクローズド エンドを切断することによって、1.5 mL プラスチック チューブに精子を注ぐ。
  3. 4.1 の手順で説明したように、コンピューターによる精子解析システムを用いた精子の運動性を分析します。
  4. 流れの cytometer で精子の生存率を分析する精子を 100 μ l 添加してください。

7. フローサイトメトリー

  1. Propidium ヨウ化 (PI)、死んだ細胞の核を汚れ赤蛍光化合物と膜側の透過物核蛍光化合物、細胞の核をグリーンに汚れを含む蛍光キットを使用します。
    1. 100 μ M の実用的なソリューションにそれから、原液 (1 mM) 1:10 Tanaka´s 培地で希釈することによって緑の蛍光染色液を準備します。
    2. PI ソリューションを薄めないでください。原液は、2.4 mM です。
  2. 各サンプルは、新鮮なまたは解凍精子の 50 μ L を取るし、緑の蛍光染色作業液 (最終濃度 1 μ M) の 0.5 μ L を追加し、PI ソリューション (最終濃度 100 μ M) の 2 μ L。
  3. 5 分間暗い染料 (PI および緑蛍光染色) を含むサンプルをインキュベートします。
    1. Tanaka´s エクステンダー ・ ソリューションの 500 μ L のサンプルを希釈し、流れの cytometer で分析します。
  4. 流れの cytometer をオンにし、少なくとも 2 のプロットを含む新しいプロトコルを作成する: SS ログ対 FS ログ、FL1 vs FL3。
    注: 両方、緑蛍光染色と propidium ヨウ化は目に見える波長の光を励起できること。DNA にバインドされると、これらの染料の最大蛍光性の放出が 516 nm と 617 nm、それぞれ。
    1. 異なるレーザーの電圧調整: SS = 199;FS = 199;FL1 = 377;FL3 = 372
    2. 最大イベントに集録設定合意を設定 = 5000 または 15 秒 (サンプルの最終濃度は約 100 万セル/mL をする必要があります)。低フローを使用してサンプルをお読みください。
    3. 読書モードシングル チューブ固定位置モードを選択します。
    4. カルーセルの適切な数のサンプルを置く
    5. (F9 キーを押して) サンプルを読むし、さらに分析 (f7 キーを押して) excel ファイルに収集されたデータを保存します。

結果

70% 以上精子の運動と 18 ウナギから精子はこの研究に選ばれました。新鮮な精子 (表 1および図 2) からのそれらと比較して融解した後、結果はすべての品質パラメーターの減少を示した。運動の結果 (意味 ± S.E.M.、n = 18) 総運動と解凍後精子サンプルは、進歩的な運動よりも新鮮な精子で高い総運動と進歩的な運動性を示した。

ディスカッション

このプロトコルでは、ヨーロッパのウナギの成熟、処理および精子凍結保存の完全なプロセスについて説明します。ここで説明する飼育条件は早く成熟とこの種6,7,25で質の高い精子の大量生産のため最適です。この凍結プロトコルとその潜在的な解凍後受精の成功は新鮮な精子26の品質に大きく依存しま?...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

欧州連合のホライゾン 2020年研究によって資金が供給されたこの文書および革新プログラム マリアスクウォドフスカ キュリー付与契約の下で 642893 (インプレス) コスト オフィス (アクション コスト FA 1205, AQUAGAMETE)、および優れた研究センター-1476-4/2016/FEKUT。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24AQUACEN3394ESPBenzocaine
NaClAvantor 3624-19
SyringeBD Plastipak305501Syringe 1 mL
FC500Beckman CoulterFlow cytometer
Air pump 100EHEIM4011708370032Modified for suction
Eppendorf 1.5Eppendorf175508Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubesFalcon175747Plastic tubes 15 mL
Flexible bucketFiel104010140 L, Black color.
EthanolGuinama SLMg96270
Cyopreservation straws IMV Technologies14550500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability KitInvitrogenL7011Cytometer Kit
Modelling clayJOVIArt 304 different colors
Precision scale PCBKERN & Sohn GmbHPCB35002Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9%Laboratorios Ern, S.A.C.N. 999790.8Saline solution
ForcepsLevantina de Lab. SL371002530 cm metal forceps
ScissorsLevantina de Lab. SL3700014Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG)Merck SLEMEA/H/C/000320Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80iNikonMicroscope
CaCl2Panreac Quimica SAU2112211210
Na2SO4Panreac Quimica SAU3257091611
NaHCO3Panreac Quimica SAU1416381210
782M CameraProiser782MCamera for CASA
ISAS v1ProiserISAS v1CASA software
SpermTrack-10ProiserSpermTrack-10Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3LPYREX2110668Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45PYREX21801365Glass flask 250 mL
KClScharlab SLPO02000500
MethanolScharlab SLME03061000
MgCl2Scharlab SLMA00370500
BSASigma Aldrich05482Bovine serum albumina
Styrofoam box34x34x30 cm and 5cm thick

参考文献

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