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要約

本稿では、高スループット 16S rRNA 増幅シーケンスの詳細な標準化されたプロトコルについて説明します。プロトコルには、データ分析を通じて糞便サンプル コレクションから統合、制服を着た、実現可能な安価なプロトコルが導入されています。このプロトコルには、厳格な基準とサンプルの多数の分析といくつかのコントロールができます。

要約

人間の腸内マイクロバイ損傷から細胞を保護する上で、エネルギーと栄養分の処理に、免疫を促進する上で中心的な役割を果たしています。健全な細菌叢の組成 (dysbiosis) と考えられるものからの逸脱は、病的な状態につながる重要な機能を損なう可能性があります。最近、継続的な研究努力は微生物組成と人間の健康と病気の間の関連付けのキャラクタリゼーション向かっていた。

高スループット シーケンス技術の進歩は、腸内細菌の組成の特性を有効にします。16S rRNA 増幅配列には散弾銃の配列が含まれます。16S rRNA 増幅シーケンスを使用して、ショットガン ・ シークエンシング法遺伝子の予言と機能アノテーションに関する追加情報を提供しますが、分類学的組成をプロファイルします。16S rRNA 遺伝子の可変領域のターゲット シーケンスのメソッドを使用しての利点は、ショットガン ・ シークエンシング法と比較して大幅に低コストです。16S rRNA 遺伝子配列の差異は、異なる分類群の個々 のサンプル内の定量化微生物指紋として使用されます。

主要な国際的な取り組みは 16S rRNA 増幅配列のための標準を入隊しています。ただし、いくつかの研究は、バッチの効果によって引き起こされる変化の一般的な原因を報告します。サンプル コレクションの制服を着たプロトコルは、この効果を最小限に抑えるため、処理、およびシーケンスを実装する必要があります。このプロトコルは、糞便のサンプル コレクションからデータ解析に広く使用されているプロトコルの統合を提案します。このプロトコルには、同時処理および V4 領域の PCR の拡大と共に、糞便の多数の DNA 抽出できるよう、柱のないダイレクト PCR アプローチが含まれています。さらに、プロトコル解析パイプラインをについて説明し、QIIME (QIIME 2 バージョン 2017.7.0 と DADA2) の最新バージョンを使用してスクリプトを提供します。このステップバイ ステップのプロトコルは、堅牢な生殖、使いやすい、詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味のある方をガイドする対象です。

概要

力を注いではマイクロバイ多様性と違いと健康および病理学的条件における個体間の類似点をキャプチャの別の側面としての豊かさを理解するためになされました。年齢2,3、地理学4、ライフ スタイル5,6、および病気5腸内細菌の叢の組成に関連付けられていることが示されたが、多くの条件や人口がまだ完全特徴とします。最近、治療への応用7,8,9マイクロバイを変更できることが報告されています。したがって、いろいろな生理的条件と微生物の組成の関係に追加の洞察力は、潜在的な将来の変更の最適化への第一歩です。

伝統的な微生物培養法低利回り10,11, に制限は、細菌がいずれかのバイナリの状態として概念化、腸内に存在しない、または。ハイスループット DNA ベースのシーケンスは、微生物生態学、微生物のコミュニティのすべてのメンバーのキャプチャを有効にするをもたらしました。ただし、シーケンスは、長さと質に残る正確な分類割り当て12への重要な障壁を読み取る。さらに、高スループットに基づいて実験の測定は非生物学的または非科学的な変数13によって影響を受ける、バッチの効果に苦しむことがあります。近年、アメリカの腸プロジェクト、アメリカ合衆国 (米国) 人間マイクロバイ プロジェクト、およびイギリス (英国) の MetaHIT プロジェクトを含む人間のマイクロバイを勉強するいくつかのプログラムを設けています。これらの取り組みは、彼らのアプローチに一貫性の欠如のため容易に対等ではないデータの膨大な量を生成しています。さまざまな国際人間マイクロバイ コンソーシアム、国際人間マイクロバイ基準プロジェクトと米国商務省標準技術局 (NIST) などの国際プロジェクト14 これらの問題の一部に対処しようとしています。、信頼性の高い生殖の結果の達成を可能にする必要がありますマイクロバイ測定のための基準を開発しました。ここで説明は 16S rRNA 高スループット シーケンス (seq 16S) 開始データ分析を通じて糞便サンプルのコレクションからのいくつかの広く使用されている方法15,16の統合されたプロトコルです。プロトコル記述列無料 PCR アプローチ、植物 DNA16の直接抽出用に設計された、高品質で比較的短時間でサンプル増幅 DNA 糞便の多数の同時処理を有効にする対象のシーケンスの共通プラットホームを微生物可変 V4 領域のシーケンス。このプロトコルは、堅牢な生殖、使いやすい、詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味がある重要なコントロールを使用して科学者のガイドを目指しています。ガイドと詳細なステップバイ ステップ プロトコルを持つバッチ効果を最小限に抑えることができるし、ラボ間比較可能なシーケンス結果がこのようになります。

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プロトコル

シバ ローカル研究倫理委員会の研究のための倫理的な承認が付与され、関連するガイドラインと規制に従ってすべての方法を行った。プロトコルは、患者の同意の例外を受け取ったローカル倫理審査委員会から使用された糞便材料から、すでに提出された微生物学コア以外の年齢、個人の患者情報なし臨床精密検査の一部として性別、および微生物の結果。書かれた、健常者からインフォームド コンセントを得たし、治験審査委員会承認研究。これらのサンプルのいくつかは、以前の分析1で既に含まれています。

1. 検体の取扱い

  1. 収集、約 5 mm2スミア (大体鉛筆の消しゴムのサイズ) テストで滅菌綿棒で新鮮な糞便サンプルから管 (材料の表を参照してください)。-80 ° C 24 h 内で糞便を含むすべての綿棒を格納します。糞便の綿棒は、さらなる処理までそこに残ることができます。

2. DNA の抽出

  1. 室温で抽出し、希釈のソリューションを解凍 (材料の表を参照してください)。
  2. 転送空 2 mL コレクションに糞便の綿棒チューブ (材料の表を参照してください)。最小交差汚染と管閉鎖を有効にするきれいなはさみを使用して切断することによって綿棒スティック サイズを調整します。糞便の綿棒とミックスする渦を含む各コレクション チューブに抽出液の 250 μ L を追加します。
  3. 沸騰水浴中で 10 分間のサンプルを加熱 (95-100° C)。各サンプルと混合する渦に 250 μ L の希釈液を追加します。
  4. DNA を抽出し、4 ° C で綿棒を含む 2 mL チューブに格納します。

3. PCR およびライブラリの準備

3.1 と 3.2 の手順、テンプレートと私アンプリコン無料環境クリーンで PCR のワークステーションで作業します。

  1. プライマー (表 1) によると、バーコードのラベルを付けます。50 μ M 濃度、-20 ° C でストアに二重蒸留水 (DDW) で各プライマーを希釈します。
  2. PCR の反作用の 96 ウェル プレートを使用します。各プレートは、別のインデックスのプライマーでタグ付けされて 32 の異なるサンプルを含めることができます。前方のプライマーおよび室温 32 逆プライマーを解凍し、5 μ M に希釈します。
  3. (各ウェルの最終的なボリュームは 20 μ l になります) 100 の反応の 5 μ M 前方プライマー、1 mL 2 X PCR マスター ミックス、および 400 μ L DDW の 100 μ L を混合することによって PCR 反応混合物を準備します。この PCR ミックスの 15 μ L を各ウェル (96 ウェルの合計) に入れてください。3 さまざまな坑井 (トリプリケートで 32 の異なるプライマーは、96 ウェルの合計を与える) に各 5 μ M の逆インデックス付きプライマーの 1 μ L を追加します。
  4. 前 PCR 専用ゾーンのテンプレート、無料、フリー、私アンプリコン、クリーン ベンチを意味反応混合物に各抽出した DNA サンプルの 4 μ L を追加 (各抽出された DNA サンプルを 3 通で増幅-96 ウェル プレートあたり 32 サンプル)。
  5. 次の設定で PCR を実行: 初期変性 94 ° C、3 分。変性 94 ° C で 1 分、55 ° C 1 分と 1 分の 72 ° C で拡張子で焼鈍 35 サイクルが続く10 分のための 72 ° C で最終的な拡張子。
  6. ポスト PCR 専用ゾーンとして定義されます、別のベンチの単一の容積の管 (サンプルあたり 60 μ L) に各帳票の PCR の反作用を組み合わせます。
  7. PCR 産物の品質を評価、エチジウム ブロマイド染色 1% の agarose のゲルの各組み合わせ PCR 反応の 4 μ L を実行します。260 の UV 波長 [nm、正 amplicons 375-425 bp の期待されるバンド サイズで表示されます。以降の手順でこれらの産物のみが表示されます。
    注: 各サンプル帳票、意味 3 別の PCR の反作用で各サンプルを増幅することで増幅されています。スケール アップしません。

4. ライブラリの定量化とクリーニング

  1. すべての PCR のサンプルのモル濃度プールを得るために二本鎖 DNA によってそれぞれの増幅を定量化 (dsDNA 定量化試薬) 蛍光核酸染色 (材料の表を参照)、大規模な同時定量に適してサンプルの量。
    注: 私アンプリコンのサイズの範囲は曖昧なため、ナノグラムの実際の量はモル濃度を読み込む使用します。
  2. 単一生殖不能の管に各サンプルの組み合わせ 500 ng。ミックスする渦。
  3. エチジウム ブロマイド染色 1% アガロースゲルでプールされたライブラリの 200 μ L を実行します。製造元の指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルから 375-425 bp バンドを抽出 (材料表参照) 80 μ L DDW でプールされたライブラリを溶出し、。
    注: プールされたライブラリは、宿主の DNA から非特異的増幅製品を減らすために選択したサイズをする必要があります。
  4. 製造元の指示に従ってキットの検出感度が高い dsDNA を使用して最終的なライブラリ濃度の測定 (材料の表を参照してください)。製造元の指示に従って DNA ライブラリの高感度分離分析キットを使用してライブラリの正確なサイズを測定 (材料の表を参照してください)。

5. シーケンス

  1. 20% コントロール ライブラリの追加 19 にプールされたライブラリを希釈 (材料の表を参照)、シーケンス コンピューター プロトコルに従って。
  2. シーケンス、使用カスタム デザイン無料 (表 1参照) V4 増幅プライマーでプライマーを参照してください。
  3. 追加のバーコードを読み取り使用 3 カスタム設計されたシーケンス プライマー (表 1参照) や、メーカーの仕様によると、各方向の長さで基地の 175 のペアエンド リードを生成します。
  4. シークエンシング マシンを実行し、製造元のプロトコルに従って FASTQ ファイルを取得します。

6 データ処理

  1. 一緒にステッチし、QIIME 2 2017.7.0 バージョン17で実装されたデータのキュレーション パイプラインで重複するペアエンド FASTQ ファイルを処理します。サンプルの特定のバーコードによると読み取りをデマルチプレックスします。
  2. 品質管理とシーケンスのバリアント (SVs) 検出するため DADA218を使用します。2 以上の予想されるエラーと破棄を読み取り最後 5' から 3' 末端から 13 基地と 15 で読み取りが切り捨てられます。識別し、コンセンサスを用いたキメラを削除-キメラが個別にサンプルで検出され、シーケンス サンプルの十分な割合でキメラが見つかりましたが削除されます。
  3. 合うナイーブベイズ識別器を用いた SVs 分類学的分類を実行し、2013 年 8 月に訓練 99% のアイデンティティ Greengenes データベース6175 の長い読み取りと設定フォワード/リバースのプライマー。
  4. 2,146 の系列の深さにすべてのサンプルを希薄にします。
  5. サンプル サイズの影響を避けるために、希薄サンプル (サンプル多様性19,20) の間 β 多様性測定のため加重 UniFrac を使用します。
  6. 主座標分析 (PCoA) を実行するのに結果の距離行列を使用します。
    注: データ処理のスクリプトおよびマッピング ファイル (補足資料 1と2) の補足資料として提供されます。

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結果

プロトコルの模式図を図 1に示します。

前向きが疑われる伝染性下痢症入院患者から便のサンプルを収集しました。これらのサンプルは、された前述12 月と 2015 年 5 月間のシェバ医療センターで臨床微生物学研究室に送信されました。便のサンプルを受けた臨床微生物学研究室で実...

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ディスカッション

16S rRNA 増幅とメタゲノム ショットガン ・ シークエンシング法は、臨床微生物学アプリケーション21,-2223で人気を得ています。これらのテクニック、人為的・非人為的分類群、病原性菌の能力をより正確にモデルの感染を識別するために相対的な豊かさについてのデータを提供することをキャプチャする能力を向上に有利であります。指紋の

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、(許可番号 41/11) - コア ・ プログラム、大腸炎の組織 (ECCO) とイスラエル科学財団 (グラント第 908/15) ヨーロッパのクローンの部分で支えられました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

参考文献

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
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  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
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  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617(2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226(2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

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