JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。

要約

萌芽期の開発中に造血幹細胞 (HSC) の起源を調査する機能は、初期胚における HSC 前駆体の希少性と長期生着能性を識別する機能の試金の不足によって制限されており個々 の推定 HSC の前駆体。ここでは、分離・単一セルのレベルで機能的に検証された HSC 前駆体の同定を可能にする方法論について述べる。まず、駆使し個別に並べ替えの各セルの正確な表現型パラメーターをカタログにインデックス並べ替え HSC の前駆物質の実験的分析のための追加のマーカーと豊かに表現型マーカーの組み合わせを使用しています。第二に、インデックスの並べ替えの各セルは非接が HSC 前駆体多能、長期生着の潜在性と機能的な HSC の成熟を支える大動脈性腺発生 (AGM) 地域から血管性ニッチ間質との共培養移植の試金。この方法論により、機能性生着に秘めたクローン hemogenic 前駆体の表現型のプロパティまたは転写プロファイル、HSC 前駆体の詳細な分析手段を提供するなど他のプロパティの相関単一セルのレベルで開発。

概要

クローン研究は、高齢化1時に HSC サブタイプと HSC の動作の変更に新しい洞察力を提供する大人の HSCs の長期生着特性における不均一性を明らかにしました。ただし、胚性造血の研究およびその前駆物質によっては、難しくされています。初期胚の中に造血前駆細胞呼ばれる非定常過程の hemogenic 内皮細胞として知られている人口から生じる内皮細胞から造血転移2として。最初の HSC では、エアコンの成人のレシピエントに移植に続く堅牢で、長期の多能生着を提供するために彼らの能力によって定義されている超低周波3 でマウスの胚の胚日 10.5 (E10.5) 後まで検出されません。.HSC (pre-HSC) hemogenic 内皮細胞から発生する前駆物質開発の間に移植の試金4,5で効率的な生着を可能にする大人の HSC のプロパティを取得する前に成熟を受ける必要があります。,6。 まれな HSC の起源、赤芽球系、造血前駆細胞の多数の研究を隠すこと、骨髄性とリンパの可能性がすでに前 HSC7,8から HSC の出現する前に検出されました。したがって、事前 HSC を区別する他の造血前駆細胞クローン細胞を分離し、HSC では、移植の試金でその生着プロパティを検出するために十分な成熟のための信号を提供するためのメソッドが必要です。

Hsc の前のヴィヴォや生体内での成熟によって前 HSC の検出を実現するアプローチの数が記載されています。前のヴィヴォメソッドは、AGM 地域、開発9で最初の HSC を検出する場所などの萌芽期ティッシュの文化に依存しています。これらのメソッドは、プロトコルは、解離を組み込む建物並べ替え、および再集計 AGM 組織の許可している傍大動脈内 E11.5 E9.5 から開発中に HSC 前駆体を含む並べ替えられた個体群の特性評価splanchnopleura (P Sp)/AGM 地域4,5,10;ただし、これらのアプローチはクローン解析に必要な単一セルのレベルで前駆物質のハイスループット解析に従順ではありません。同様に、新生マウスへの移植による生体内で成熟、微小環境は HSC の前駆体の初期の段階のサポートに適して見なされどこにも有効な卵黄嚢と AGM から並べ替えられた個体群の研究/P Sp (P Sp は AGM に前駆体領域) pre-HSC では、これらのメソッドの特性とも単一の堅牢なプラットフォームを提供するために失敗する細胞分析11,12。

Rafiiらの研究は、その Akt 活性化血管内皮細胞 (EC) 間質は大人 HSC の自己複製の in vitro13,14,15のサポートのためニッチ基板を提供することができますを示しました。我々 は最近、AGM 地域 (AGM-EC) から派生した Akt 活性化 EC は適した体外ニッチ、分離早くも大人接が hsc の開発で E9 およびそれに続くのと同様、hemogenic の前駆体の成熟化の判断生成された HSC16の自己更新します。このシステムは、単純な 2次元の共培養を採用し、それは個々 に絶縁されて hemogenic 前駆体の HSC 可能性のクローン解析の容易に適応可能であります。

我々 は最近インデックスの AGM EC 共培養と移植後の機能分析とマウス胚からの個々 の hemogenic 前駆体の並べ替えを組み合わせることによりクローン hemogenic 前駆体の HSC の可能性を試金する方法を報告しています。17をの試金します。蛍光活性化のモードなどそれぞれの個別に並べ替えられたセルの表現型パラメーター (すなわち、前方散乱 (FSC-A)、側散布 (SSC-A)、蛍光パラメーター) すべて (インデックス) を記録する (FACS) をソートするセル インデックスの並べ替えは、これらの並べ替えを次以降の機能解析機能を遡及的に関連付けることができます。FACS ソフトウェアは、各セルに配置された 96 ウェル プレートの位置/よく表現型情報の両方を記録します。この手法は以前エレガントな大人の HSC の不均一性を識別、さらの HSC では、長期的な engrafting のサブセットを豊かにし、転写と HSC の表現型のパラメーターを関連付ける表現型のパラメーターを確認する使用されて1 つのプロパティはセル レベル18,19です。ここでは、胚の開発の初期段階中にユニークな表現型のパラメーターの同定と pre HSC の系統貢献を可能にするこの方法の詳細な方法論を提供します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) フレッド ・ ハッチンソンがん研究センターのによって承認されています。

1. 共培養の AGM EC 膜の準備

  1. AGM の郭清と並べ替え、前に 24 h は、AGM EC 培地と滅菌フィルターを確認します。
  2. 96 ウェル プレートの各ウェルに水 (100 μ L/ウェル) に 0.1% ゼラチンを追加 15 分吸引ゼラチンのため室温で孵化させなさいし、井戸が乾くまで削除ふた付きティッシュ文化フードのプレートを残してください。
  3. AGM EC 化膜および 96-ウェル プレートにプレートを切り離して考えます。
    注: は、AGM EC は、AGM EC 培地で、上記16として準備を維持します。一貫性を保つのための AGM EC 細胞を十分な数は (一般に通路 1-3) を得られるとすぐに冷凍し、共培養実験のために定義された通路番号 (一般道 5-12) で使用ください。AGM EC 細胞は c57bl/6 j (CD45.2) AGM から派生されます。すべてのメディアの組成の材料表を参照してください。
    1. 75 cm2フラスコで AGM EC 文化からメディアを吸引し、5 mL の PBS を追加します。PBS を吸引し、3 mL のトリプシン溶液を追加 (材料の表を参照してください)。
    2. ほとんどの細胞は、プレートを持ち上げてまで 2 〜 4 分の 37 ° C で孵化させなさい。AGM EC 培地の 8-10 倍の単一細胞懸濁液を準備し、15 mL チューブに転送 10 mL ピペット ピペット 7 mL を追加します。
    3. 5 分間 300 x g でスピン、上澄みを除去、再 10 mL AGM EC 培地にサスペンドし、診断とセル数を見積もる。AGM EC 培地で 1 × 105セル/ml の濃度に細胞を希釈します。
  4. 糊の 96 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L AGM EC 細胞懸濁液 (1 x 10 の4セル) を追加します。37 ° C、5% CO2培養インキュベーターで一晩 AGM-EC にアタッチし、コンフルエント単層を形成できるように。
    注: は、AGM EC 細胞限られた増殖があるのでまたは最適な培養の凝集のセルに均等に配る。
  5. AGM 共培養の AGM EC 膜を準備します。
    1. 次の朝は、AGM 血清フリー メディアを準備します。
    2. 12 ウェル マルチ チャンネル ピペットを使用してには、AGM EC から AGM EC 培地を削除し、AGM 無血清メディアの任意の残留血清を含むメディアを洗浄するサイトカインなしの 200 μ L/ウェルを追加します。
    3. メディアを削除し、サイトカインと AGM 無血清メディアの 200 μ L/ウェルを追加します。取り外しと内皮層が損なわれない; メディアを追加するときにすぐに仕事例えば、削除し、再一度にメディアの 1 つの行を追加します。胚細胞は並べ替えのため準備ができているまで、37 ° C で培養のインキュベーターで 96 ウェルのプレートを配置します。

2. マウスの萌芽期ティッシュから単一細胞懸濁液の準備

  1. 時限から AGM を解剖します。
    1. 希望年齢の萌芽期ティッシュを生成するためわれわれのタイムアウトを設定します。
    2. 分析する前 HSC の段階に応じて 9.5 11.5 日のポストの coitum (dpc) で妊娠中の女性から胚を収穫します。
      注: 萌芽期ティッシュは、前述と正確に段階に基づいて体節数16と c57bl/6 j (CD45.2) マウスから収穫されます。胚の AGM 地域個体群の解析に注力、体節ステージングに基づいてその前駆体、P-Sp は、E11.5 へ E9.5 の間。
    3. 胚20から AGM を解剖します。
      注: マウス胚から AGM の解剖のための詳しいプロトコルされている20他人によって公開されました。また、卵黄嚢や pre HSC 活性を有することを意味する他の組織もこのメソッドによって解析する可能性があります。
  2. 切り裂かれた萌芽期ティッシュを切り離して考えます。
    1. 10 %10 mL の PBS を含む 15 mL の円錐管に切り裂かれたティッシュを集める政府短期証券の氷の上。重力組織を解決、PBS/FBS を吸引し、すぐに 25 分の 37 ° C の水浴中 0.25% コラゲナーゼと場所の 1 つの mL を追加します。
    2. 単一細胞懸濁液を取得する 1 mL ピペット チップで約 20-30 倍 PBS/10% FBS のピペット 1 mL を追加します。PBS/10% FBS の追加 8 mL を追加し、300 x g で 5 分間遠心分離細胞上清を破棄します。

3. 抗体がマウスの萌芽期細胞の染色

  1. 抗体の汚損のブロック バッファーを準備します。
    1. 10 %1 mL の PBS に 10 μ g/mL 抗マウス CD16/CD32 (Fc 受容体 (FcR) ブロック) と 1 μ G/ml DAPI (1 mg/mL 入荷 H2O) 追加 FBS。
    2. 3 mL の注射器を描画し、殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通過します。再中断 500 μ L ブロック (ステップ 2.2.2) からマウス解離の萌芽期ティッシュからの細胞ペレットをバッファーし、氷上で 5 分間インキュベートします。
  2. 抗体ミックス17を準備します。
    1. 10 %1 mL の PBS に 10 μ g/mL FcR ブロックを追加 FBS と各蛍光色素標識された抗 VE カドヘリン抗体の 10 μ L (CD144、材料表を参照してください)、蛍光色素標識された抗 EPCR 抗体 (CD201、材料表を参照してください)。製造元の推奨事項または滴定によるとに基づいて指示がない限り、抗体の 1: 100 最終希釈を使用します。
      注: この抗体は組み合わせて、並べ替えのためのゲートを定義するため (ステップ 4.2) 下記のとおり。共同 VE カドヘリン発現に基づく並べ替えと EPCR により HSC 前駆活動、前述の17を含む AGM 由来細胞の部分の重要な濃縮。
    2. 個々 のインデックスの並べ替えの前駆体のさらに表現型解析のための追加蛍光色素標識された抗体を追加します。
      注: これらの抗体はない使用並べ替えのためのゲートを定義するため必ずしも。このサンプル プロトコルで我々 は PE 共役アンチ CD41 抗体および pre-HSC hemogenic 内皮4 からの出現の間に進化これらの造血のマーカーの相対的な表現を分析する FITC 標識抗 CD45 抗体を含まれています。 ,5,16,17。興味の他のマーカーは、必要に応じて指定できます。アイソタイプの蛍光色素標識された抗体コントロールで染色サンプルを使用して、解析における正および負のゲートを定義します。
    3. 3 mL シリンジで抗体ミックスを描画し、殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通過します。ブロック バッファー、ミックス、および少なくとも 15-20 分間氷の上をインキュベートするピペットで細胞懸濁液 500 μ L 抗体ミックスを追加します。
  3. ステンド グラスのセルを洗浄します。
    1. 8 mL PBS/10% FBS を追加します。5 分、吸引、およびセルを再中断ペレット 1 ml PBS/10% FBS の 300 x g で細胞を遠心します。
    2. 35 μ m セル ストレーナー キャップ 5 mL チューブを介して細胞懸濁液をピペットで細胞を削除します。追加 3 ml PBS/10% FBS セル ストレーナーを洗浄します。5 分間 300 x g で細胞を遠心分離、吸引、PBS/10% FBS を 500 μ L で再停止、FACS まで氷の場所します。

4. インデックスが培養 96 ウェル AGM EC 間質とする単一 Hemogenic 前駆体のソート

  1. プレート モードの FACS マシンを準備し、製造元の指示に従って 96 ウェルのプレートへの並べ替えを揃えます。単一セル モード、インデックス並べ替え最大純度マスク設定と並べ替えの各セルのインデックス パラメーターの取得を有効にするソフトウェアのモードを選択します。
  2. 並べ替えのためのゲートを設定するサンプルを染色抗体からの細胞のサンプルを取得します。
    1. FACS マシンで染色細胞サンプルをロードし、最低流量でセルを取得します。FSC の詩 SSC A と選択をプロット (これは事前 HSC 活動が AGM17でサイズの異なるプロファイルの細胞で識別されている観測に基づく) 様々 なサイズ (図 1 b) のセルを含むゲート。FSC は FSC W 詩と SSC の詩 SSC W プロット、ダブレットを除外するゲートを選択します。FSC の詩 (DAPI の負) の生きているセルをゲートに DAPI をプロット (図 1 b)。
    2. 対 PerCP (または EPCR 染色関連の螢光色素)、PECy7 (または VE カドヘリン染色関連の螢光色素) をプロットします。ゲートの細胞 (内皮細胞と同様に造血前駆細胞と AGM から pre HSC の混合された人口を含む) を VE カドヘリン陽性であるし、(P ・ Sp/AGM17から pre HSC の潤す) 高 EPCR 式があります。これは、インデックスの並べ替え手順 4.3 (図 1 b) で単一のセルに使用される最後のゲートです。
    3. 染色に使用される追加の螢をプロットします。
      注: 分析する個体によって更なるゲートすることができますに基づいて設定セルを汚すために含まれるその他のマーカーの検出。ただし、これらのパラメーターは、遡及的に分析できるように、各並べ替えられた細胞の蛍光パラメーターの記録がインデックス並べ替えできます。したがって、追加のゲートは必要ありませんこの時点で。すべて FACS のセットアップは、単一の抗体で染色サンプルが波及を背景を汚すため考慮し、決定のアイソタイプ コントロール抗体と重複する蛍光色素の排出を考慮する補正を調整する使用してください。正/負ゲート。
  3. インデックスは、AGM セルを並べ替えます。
    1. FACs 選別機のプレート ブロック (ステップ 1.5.3) からサイトカインと AGM 血清自由な媒体の AGM EC 間質を使用した 96 ウェル プレートを配置します。サンプルをロードし、サンプルの収集を開始します。ソート/単一セルのインデックス モードを選択し、個々 の 96 ウェルに sortingsingle セルを開始します。萌芽期細胞のせん断応力を最小限に抑えるために低流量を使用します。
    2. インデックスの並べ替え時にすべてのイベントが記録されることを確認します。これは、記録されたすべてのイベントは井戸に並べ替えられますと実際番号個別に並べ替えられた 96 - 井戸、相対的な並べ替えのゲートで分析セルの合計数の列挙体を有効になります。
    3. 一度細胞が全体の 96 ウェル プレートにソートされている 37 ° C 5% CO2で設定で組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。実験ごとに必要な追加のプレートを繰り返します。
    4. 96 ウェルで個別にソート共培養細胞 (E10 10.5 胚から 6 日、7 日 E9 9.5 胚から E11 11.5 胚由来細胞の 5 日) まで 7 日間 (4.3 のステップ) から AGM EC を含みます。100 倍の倍率 (図 2 b) で倒立顕微鏡と培養期間の後さまざまなサイズおよび形態の造血コロニーを視覚化します。
      注: メディアは、培養期間中に変更する必要はありません。Hemogenic 前駆体 EC のような形態を持つ AGM EC レイヤーに統合される最初と最初の AGM EC 間質 (図 2 a) 区別することはできませんを並べ替えられます。ただしの培養、小さい、次の 24-48 h 丸め造血細胞や細胞のクラスターを検出可能性があります。共培養 (5-7 日) の終わりには、造血細胞の個々 のコロニーはクローン性造血秘めた並べ替えセルを受け取った 96 ウェルのサブセットで視覚化できます。視覚的に検査された井戸を含む 1 つ以上の異なるコロニー、このサンプルはウェルあたり並べ替え 1 つ以上のセルを受信可能性がありますサンプルを除外するダウン ストリームの解析から除外されます。

5. 次の共培養クローン性造血子孫の解析

  1. FACS 解析の各 96 ウェルからクローンを収穫します。
    1. 200 μ L ピペット チップでマルチ チャンネル ピペットを使用して内皮層から造血細胞を分離するに積極的にピペット。内皮層を分離しないようにします。FACS による造血の子孫の表現型解析のため 100 μ L (サンプルの 〜 50%) を削除します。
    2. 96 ウェル V 底プレートに移し、細胞のペレットを 2 分間 300 × g で遠心分離機します。プレートが反転しながら 1 つの急速な動きにプレートからメディアをフリックでメディアを削除 (プレートにフリック)。
    3. その後の生着の試金 (手順 6) の 37 ° C incubatorfor 使用元の 96 ウェル プレートに残り 100 μ L のセルを配置します。
  2. 造血解析に適切な抗体と細胞を孵化させなさい。
    1. 再 10 μ G/ml FcR ブロックと 1 μ G/ml DAPI を含む PBS/2% FBS の 50 μ L の 96 ウェルの V 下部の各ウェルの細胞ペレットを中断します。5 分の 4 ° C でプレートを孵化させなさい。
    2. 10 μ G/ml FcR ブロックと PE Cyanine7 共役アンチ VE カドヘリン、PerCP 標識抗-CD45、PE 共役アンチ EPCR、APC 共役アンチ-Sca1、FITC 結合抗 Gr1 を含む HSC 解析抗体ミックスを含む PBS/2% FBS の 50 μ L を追加し、アンチ-F4/80 (1: 100 最終希釈抗体各滴定によると製造元の推奨事項に基づく指示がない限り)。少なくとも 20 分の 4 ° C でプレートを孵化させなさい。
  3. 順次希釈で自由な抗体を削除し、セルを分析します。
    1. 細胞のペレットを 2 分間 300 x g で 200 μ L/ウェル PBS/2% FBS と遠心分離機を追加します。その後、フリック プレート上澄みを廃棄、各細胞ペレットに 200 μ L PBS/2% FBS を追加し、細胞のペレットを 2 分間 300 × g で遠心します。
    2. プレート上澄みを廃棄し、50 μ L/ウェル PBS/2% FBS 解析を追加するにフリックします。FACS フローサイト プレート リーダーを搭載による細胞の分析に進みます。
      注: 取得一定量 (例えば再懸濁液に使用される合計 50 μ L の 35 μ L) 細胞の造血の子孫のサブセットを列挙します。
  4. 潜在的な HSC (図 3) を含むコロニーのため画面に造血の子孫を含む各ウェルの FACS データを分析します。
    1. 骨髄系マーカー Gr1 と F480 の負 CD45 陽性人口ゲート最初。まだ低レベルの VE カドヘリンを発現する細胞をゲートはないです。造血コロニーの収穫中に中断が AGM EC 層から細胞、VE カドヘリン陽性と CD45 ネガティブです。
    2. CD45 ゲート+VE Cad-/低Gr1 EPCR と Sca1 の高レベル表現サブセットにさらに-F4/80-細胞 (図 3 a -C)。
      注: 先行研究、CD45 の細胞に欠けているコロニーで+VE Cad-/低Gr1-F4/80-Sca1こんにちはEPCRこんにちは表現型 (図 3 D) が再現性をもって検出を提供するために失敗しました放射線照射した受信者マウス17 (データは示されていない); 多能末梢血移植したがって、これらの植民地は、手順 6 でその後移植解析に含まれません必要。

6. インデックスの並べ替えが明らかにした表現型のプロパティを持つ個々 のクローンと相関の生着特性の解析

  1. 日 (可能な場合) または手順 5 で表現型解析の翌朝再各 96 ウェル含む造血植民地から 200 μ L ピペット チップを使用して積極的なピペッティングによる培養 (ステップ 5.1) から、次の残りの 100 μ L 細胞を中断しました。
  2. 準備し、コンジェニック系統 B6 の全体の骨髄から救助セルを追加します。SJL Ptprc、Pepcb/BoyJ (B6 CD45.1) 成体マウス16,17。
    1. 診断ソリューションをトルコ人の骨髄の有核細胞を数えます。5 x 10 の濃度に希釈5核細胞/mL PBS で 2% で政府短期証券。
    2. 移植解析造血の子孫を含む各ウェルに救助骨髄細胞 (5 x 10 の4) の 100 μ L を加え、ピペッティングで混ぜます。
  3. 個々 のクローンの子孫を単一照射致死受信者コンジェニック系統 B6 に移植します。SJL Ptprc、Pepcb/BoyJ (B6 CD45.1) アダルト マウス。
    1. (セシウム ソースから 1,000 cgy-ルンビアを使用して) 単一のクローンの子孫を個別に挿入するクローンの数と同じ数の B6 CD45.1 マウスは致死に照射します。
    2. 29 G 1/2 インチ針 ½ mL インスリン注射器に 200 μ L 総細胞懸濁液 (細胞クローンからだけでなく、5 × 104 B6 CD45.1 救助骨髄細胞を含む) を描画します。
    3. 致死的照射 B6 CD45.1 成人レシピエント 2 24 h 前に注入します。
    4. 各クローンの細胞と受信者生存で支援するために 5 × 104 B6 CD45.1 成人の骨髄救助セルの両方を含む尾静脈 200 μ L のボリュームを介して注入プラスチック マウス落末尾のアクセスを可能にするを使用して。
    5. 耳のタグと受信者のマウスの重さし、自分の体重/健康を定期的にチェック (例えば3-4 回/週ポスト照射/移植、または個々 の機関の標準操作手順ごと) 良い健康を確保します。
  4. 定期的に (例えば2、16、24 週間) 末梢血移植の解析を実行次の移植。
    1. レトロな軌道出血または別の倫理的承認された血させるメソッドを介して血液の 50-100 μ L を削除します。
    2. 血液を 3 mL の溶解バッファー (16.6 g NH4Cl、2 g を 2 L H2O NaHCO3と 74.4 mg EDTA) を追加し、PBS/2% FBS で 5 分間遠心分離機 300 x g で 5 分間吸引と 2 mL にペレットを再停止、室温でインキュベートします。5 分間 300 × g で遠心分離機します。
    3. 再 150 μ L PBS/2% FBS 含む 10 μ G/ml FcR ブロックと 1 μ G/ml DAPI、ペレットを中断し、ドナーの系統で、1/3 リネージュのドナーとアイソタイプ コントロールも含む 50 μ L 抗体も含む 50 μ L アイソタイプ コントロールするボリュームの 1/3 分配、ドナーと系列の両方を検出する 50 μ L 抗体を含む井戸に 3 分の 1。
      注: 能生着の検出の抗体: APCeFluor780 共役アンチ CD45.2、Pe Cyanine7 共役アンチ CD45.1、FITC 結合抗 CD3、PE 共役アンチ-F4/80、PerCP 標識抗-Gr1、APC 共役アンチ-CD19、または関連するアイソタイプ コントロール。
    4. CD45.2 (ドナー) の時間をかけて FACS によって末梢血の貢献を評価することによって長期生着のクローンを識別-由来造血細胞の骨髄 (Gr1 や F4/80 正) (CD19 陽性)、B 細胞と T 細胞 (CD3 陽性) (図 4 a -B)。
      注: CD45.2 (ドナー) によって造血の生着を分析もできます-造血の集団に貢献由来組織から骨髄、脾臓、胸腺、腹膜、またはセカンダリ骨髄細胞移植を収穫B6 CD45.1 マウス シリアル生着プロパティ17を分析します。
  5. その生着プロパティで並べ替えを行う最初の単一のセル インデックスによって決定される各クローンの表現型プロパティを関連付けます。流動解析ソフトを使用して、並べ替えパラメーター (96 ウェルが並べ替えられた相関) 各インデックス並べ替えセルをアップロードします。流プロット機能出力 (たとえば、長期、能生着) に関連する単一細胞の表現型特性を評価するために機能的なデータ マップ (図 4)。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

図 1 aは、実験的なデザインの概略を示しています。P-Sp/AGM 組織は、解剖をプールし、コラゲナーゼで解離が、一度インデックス ソートの VE カドヘリンおよび EPCR に抗体と染みが。Pre HSC は、VE カドヘリン+EPCR高(図 1 b) 細胞で濃縮されています。他の蛍光色素標識された抗体遡及的各セルのインデックス ソ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

萌芽期の開発中に HSC 創世記の研究は、まだ移植成人レシピエントにおける血液造血系長期を提供する能力の欠けている hemogenic 前駆体の潜在的な HSC を検出するための手段を必要とします。このプロトコルで提案するクローン胚 hemogenic 前駆体法血管ニッチ ECs に間質の混合培養による HSC の前駆体の成熟化をサポートするには、AGM から移植アッセイで後続の機能解析と.設立許可の並べ替え?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

フレッド ハッチンソン流れ Cytometry コア援助を FACS でアンドリュー ・ ベルガー、ステイシー堂園とブライアン螺鈿に感謝したいと思います。この作業は、付属の共同助成金 #HL099997 と NIDDK 付与 #RC2DK114777 国立機関の健康 NHLBI UO1 グラント #HL100395、によって支えられました。ブランドン Hadland をサポートするには、アレックスのレモネードは、財団スタンドとホイール基礎現代希望。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE ExpressGibco12605-028Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in waterStemCell Technologies7903Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture platesCorning3599Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottlesFisher Scientific9741202Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Bovine SerumFisher ScientificSH30088.03100 mls
Penicillin StreptomycinGibco15140-1225 mls
HeparinSigmaH314950 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM)StemCell Technologies71005 mls
Endothelial Mitogen (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%)StemCell Technologies7902Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringeBD Biosciences309657Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filterMilliporeSLGP033RSUse to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer capCorning352235Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O)Millipore268298Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block)BD Biosciences553141Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7eBioscience25-4301-81Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PEBD Biosciences558040Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PEBD Biosciences553925Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITCeBioscience11-0451-85Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCeBioscience11-4031-81Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottomCorning3894Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5eBioscience35-4031-80Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PEeBioscience12-4031-81Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APCeBioscience17-4321-81Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITCeBioscience11-4321-41Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCBD Biosciences556923Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needlesBD Biosciences309306Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCPBiolegend400629Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PEeBioscience12-4321-80Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITCBD Biosciences555274Staining
Anti-mouse CD19 APCBD Biosciences550992Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APCBD Biosciences553932Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7eBioscience25-0453-82Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA softwareBD Biosciences
BD FACSCanto II with plate readerBD Biosciences
HaemocytometerFisher ScientificS17040For counting cells
Multi-channel pipetteFisher Scientific14-559-417For dispensing cells
FACS analysis softwareFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo

参考文献

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

135 HSC pre HSC AGM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved