フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

要約

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC 人口を定量化する方法を示します。対応する患者-派生-異種移植片におけるこれらの個体群の存在を確認しました。

要約

急性骨髄性白血病 (AML) は異質と致命的な病気を治療されていない場合。成人の白血病による死亡の最も一般的な原因です。当初、急性骨髄性白血病は造血幹細胞 (HSC) の病気差別化、爆発性白血病細胞のそれに続く蓄積の逮捕によって特徴付けられる、造血の機能要素の生産量が減少します。不均一性白血病幹細胞 (LSC) の存在まで、この動的セル白血病の進行と治療中に課せコンパートメントは様々 な選択圧力を克服するために進化しています。LSC 人口をさらに定義するには、CD90 と CD45RA は cd 34 + CD38-細胞コンパートメント内正常造血多能性前駆細胞の差別をことができます。ここでは、多重フローサイトメトリーを用いたヒト急性骨髄性白血病の一次爆発細胞にいくつかの推定 LSC マーカー (CD34、CD38、CD45RA、CD90) の同時発現を検出するためのプロトコルをまとめました。さらに、3 つの前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC 人口を定量化する方法を示します。対応する患者-派生-異種移植片におけるこれらの個体群の存在を確認しました。検出のこのメソッドおよび推定 LSC の定量化が化学療法応答の臨床フォロー アップに使用する (すなわち。、微少残存病変)、残留 LSC は急性骨髄性白血病再発を引き起こす可能性があります。

概要

急性骨髄性白血病 (AML) は、白血病による死亡の最も一般的な原因です。当初、急性骨髄性白血病は造血幹細胞 (HSC) のクローン病分化、ブラスト細胞のそれに続く蓄積の逮捕によって特徴付けられる、造血機能の要素の生産量が減少します。最近では、ブラスト セル人口のクローンの不均一性の設置する本質的にシーケンス (NGS) の次世代戦略を使用して、腫瘍細胞¹のクローン内の進化の存在を示します。

白血病幹細胞 (LSC) の存在する不均一性を拡張します。それは、この動的なセル区画は、白血病の進行と治療中に課せられた様々 な選択圧力を克服するために進化する仮定されます。したがって LSC は現在の化学療法レジメンに耐性があるし、深い臨床的意義²病気の再発を仲介になっています。様々 なマーカーは、ティム 3⁶CD97⁵や CLL 1⁴CD123³LSC の特徴に記載されています。ブラスト細胞の cd 34 + CD38-コンパートメント LSC⁷豊かに言えますが、また通常 HSC が含まれています。Cd 34 + CD38 に適用される CD90 と CD45RA 式-(P6) コンパートメント (図 1) 正常および悪性造血前駆細胞⁸のいくつかの段階を分離することができます。具体的には、通常 cd 34 + CD38 CD90 + CD45RA HSCs、多能性前駆細胞 (MPP) cd 34 + CD38-CD90dimCD45RA-細胞など cd 34 + CD38-CD90-CD45RA + リンパ プライミング多能性前駆細胞 (LMPP) 細胞を急性骨髄性白血病の大半として定めることができる場合^{8 ,9}。CD38 の平均蛍光強度 (MFI) は、CD34 陽性細胞コンパートメントの内で考慮することが大切です。CD38 強度その 3 つの新しい細胞のコンパートメントを定義するため: CD38 負 (P6)、CD38 dim (P7) と CD38 明るい (P8) (図 1)。CD38 の MFI は、これらの細胞は強く CD38 を特急として内部の肯定的な制御として hematogones およびプラズマ細胞のいずれかを使用して決定されるかもしれない。

免疫不全の合図/SCID/IL2Rγc^null (NSG) マウス モデルは通常の生着のため広く使用され悪性ひと造血細胞^10,11。シリアル異種アッセイは、LSC または HSC 関数の実験的検証に使用されます。これらの研究は、大規模なシーケンスのアプローチによって広範囲に分析されています。それにもかかわらず、以下はその主な急性骨髄性白血病 (図 2) と比較して NSG マウスにしみ込んで AML ブラスト人口の LSC と HSC イムノフェノ タイプについて知られています。

LSC の番号を本質的に低、LSC の同定及び定量化が困難なここで説明する方法は、(残留 LSC として化学療法応答を評価するフローサイトメトリーアッセイ診断、臨床フォローとして使用する場合があります。急性骨髄性白血病再発を引き起こす)。LSC の存在は肯定的な微小残存病変 (MRD) 可能性があります。までに、MRD 分子法 (すなわちRT-PCR、NGS) に依存して急性骨髄性白血病で大抵監視^10,12。しかし、このプロトコルでは我々 検出いくつかの HSC/LSC マーカー (CD34、CD38、CD45RA、CD90) の同時発現ヒト急性骨髄性白血病の一次爆発細胞に多重流れ cytometry^2,8,9。この抗体の組み合わせ可能性があります任意の標準的な流れ cytometry 研究室で適用してこの流れ MRD の試金は、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) による MRD は不可能、特に興味深いすなわち場合、白血病特有の分子マーカーは、診断のアジア ・ マイル リミテッド サンプルで検出されません。さらに、このプロトコルはより敏感な分子 MRD 技術を補完するものそれは検出し、異常な造血前駆細胞を定量化することを目的として表します機能細胞特性 (図 3)。

臨床検査の大半で使用可能な抗体とフローサイトメトリーによる造血前駆細胞の 3 つの集団と成熟度が異なると推定される LSC コンパートメントを定量化する方法を示します。さらに、対応する患者-派生-異種移植片 (PDX) でこれらの細胞コンパートメントの存在を確認し、治療のフォロー アップ。

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プロトコル

我々 は科学的な目的のための動物の使用のためのヨーロッパ規格に従ってください。本研究は、ローカル倫理委員会 (#3097-2015120414583482v3) によって承認されました。

1. サンプル準備

1. De novo AML 抗凝固エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む管内から骨髄の mL あたり 1.8 mg の濃度で骨髄 (2 mL) を収集します。
2. 続いて、赤血球および顆粒球、単核球を分離する密度勾配分離 Ficoll 分離を実行します。生理食塩水リン酸バッファーの 3 つの容積の骨髄を希釈 (PBS: KH₂PO₄ Na₂HPO₄ 10 mM, KCl 2.7 mM NaCl 137 mM 1.8 mM)。慎重に希釈した骨髄の 1 ボリュームと Ficoll の 1 ボリュームをオーバーレイします。ブレーキなし 300 x g で 30 分間をスピンします。新しい生殖不能の管に mononucleated 細胞の白いバフィー コート層を転送します。
3. 10 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄)、汚染の血清成分を除去するために、5 分間 300 × g で遠心力場します。

2. 赤い血球 (RBC) の換散

1. セル換散バッファー (塩化アンモニウム 0.8%) 2 mL を追加ペレット、渦ゆっくりと 5 分間 300 x g で 5 分遠心室温で孵化させなさい。
   注: 必要に応じて、この手順を繰り返します。
2. 洗浄のセル PBS で前述 (1.3)。

3. 患者は、異種移植片を派生しました。

1. Ficoll 分離後骨髄から細胞を入手し、負の選択を使用して免疫リンパ球枯渇後 (T および B リンパ球の CD20 用 CD3)。製造元の指示に従ってください。
2. 5 x 10⁶急性骨髄性白血病細胞を無条件の NSG マウスの尾静脈に注入します。拘束デバイスを使用して、容易に尾静脈注射。回、個別換気ケージを使用して、層流フードの下で操作まったく従来条件の下で、特に特定病原体フリーの条件の下でマウスを維持します。2 週間ごとに、キャピラリー ヘマトクリット値を用いた顎下コレクションによる血液の 60 μ L を取る。5 mL にキャピラリー丸い底部チューブ。小さな滅菌ガーゼのパッドを使用して穏やかな圧力を適用することで、出血を停止します。きれいな注射器で血を Expulse。
3. 1 ml の溶解バッファーを追加し、5 分間インキュベートします。300 x g で 5 分間 PBS と 300 x g で centrifugre で洗うで 5 分間遠心します。上清、3 μ L 抗ひと CD45 FITC と 1 μ L 抗マウス 10% ウシ血清アルブミン (BSA) 染色で追加 100 μ L の PBS を除去 CD45 APC と 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
4. 10 %bsa と 300 × g で 5 分間遠心する PBS (2 mL) の 2 回細胞ペレットを洗ってください。
5. 流れ cytometry チューブに 100 μ L の PBS あたり 1 x 10 の⁶セルの分注までは。
6. 調査生着させるキメリズム解析による 2 週間ごと (人間対マウス) CD45 表現は、フローサイトメトリー (図 2 a および B) を使用しています。
7. 犠牲 (周辺爆発数 70% または病気の重篤な臨床症状を超える) で収集単核細胞砕いた脾臓や骨髄から脛骨をフラッシュすることによってし、PBS で大腿骨前述した¹³。国際ガイドラインに従う頚部転位によってマウスを安楽死させます。
8. 細胞ペレットには、赤血球が含まれている場合、は、換散バッファー (ステップ 2.1) と赤の血液細胞の換散を実行します。
9. 2 回 10 %bsa と 300 × g で 5 分間遠心する PBS (2 mL) で洗浄細胞ペレット。
10. 流れ cytometry チューブに 100 μ L の PBS あたり 1 x 10 の⁶セルにセルと分注までを収集します。

4. 染色

1. (ステップ 4.2 を参照) に活用された抗体と渦を追加します。室温で暗闇の中で 15 分間インキュベート細胞。
2. 人間プライマリまたは PDX サンプルから成る抗 CD36 FITC の 10 μ L, 抗 CD19 ECD の 5 μ L、5 μ L 抗 CD33 PC5.5 のアンチ CD90 APC の 5 μ L、5 μ L 抗 CD34 AA700、アンチ CD45RA-APC h7 5 μ L、5 μ L 抗 CD38 パシフィック ブルー、5 μ L の次のパネルを使用します。アンチ CD123 PC7 と 2.5 μ L 抗 CD45 KO の。
3. 5 分間 300 × g で遠心分離で 2 mL の PBS のセルを洗浄することにより非連結抗体を削除します。
4. 再最終フローサイトメトリーによる解析の 450 μ L の PBS のセルを中断します。

5. ゲート フローサイトメトリー解析のための戦略

1. 赤、青、バイオレット レーザーを搭載したフローサイトでデータ集録 (少なくとも 500,000 細胞) を実行します。1) 光学アライメント、2) 流体システム、3) 光感度で、4) fluorospheres を使用して標準化に毎日の cytometer 設定を確認します。
2. CD38 式 (図 1) を定義するシーケンシャル ゲート戦略に従います。
   1. 通常骨髄由来細胞を使用して、hematogones または CD38 表現のための肯定的な制御となるプラズマ細胞を定義します。
      注: この門は、その定義に依存する後続の推定 LSC 集団として評価するために特に重要です。
   2. CD45dim/SSC (側方散乱) 低人口基準 (図 1 a) 生理学的前駆体細胞 (通常ブラスト細胞) を定義します。このブラスト集団内で、CD38 を表示する hematogones を定義 + + cd19 表現型 (図 1 b) CD36 および CD33 の式を使用して最後に、生し、monoblasts、および赤芽球 (図 1) を定義します。(図 1E) に示すように、hematogones の CD34 式を決定します。P6 P10 (図 1) として定義されているブラスト細胞内で前駆体のいくつかの集団を評価します。P6、P7, P8 前駆細胞集団に基づいてプリセット CD38 ゲートにブラスト細胞 CD34 コンパートメントを分けます。P8 のコンパートメントに P6 が 1 つ (FMO) コントロール マイナス CD38 蛍光に基づいて CD38 細胞には含まれている、hematogones として同じ CD38 強さを持って爆発が含まれていること、および P7 細胞 CD38 に関して 2 つの両極端の間を保証します。式 (図 1)。
3. CD34 + 38 - (P6) からゲートの細胞は CD90 と CD45RA 式 (図 1 f) を使用して推定 LSC から HSC を区切ります。
   注: HSC 表現型は cd 34 + CD38-CD90 CD45RA +- と多能性前駆細胞 (MPP)、cd 34 + CD38-CD90 - CD45RA-。推定 LSC 表現型は cd 34 + CD38-CD90dimCD45RA + と未熟なダウン ストリーム人口が cd 34 + CD38 として定義されているプライミング リンパ前駆 (LMPP)-CD90-CD45RA +。

6. MRD RT-PCR による監視

1. RT-PCR¹⁴を前述のように MRD レベルを監視します。

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結果

正常および悪性ひと骨髄サンプルで前駆細胞集団を決定する方法をご紹介します。成功 PDX から骨髄および脾臓を収集し、上記のように多重フローサイトメトリーを実行.ブラスト細胞診断患者検体と対応する PDX cd 34 + CD38-前駆コンパートメントでは特に、特に推定 LSC の濃縮のいくつかの集団を比較しました。PDX 診断患者サンプル (0.53%、図 2、 D対 3.48%) と?...

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ディスカッション

膜やフローサイトメトリーによる細胞質マーカーの正確かつ再現性のある評価は、機器の設定、毎日光配向、流体システム、光感度、標準化の適切な機能を確認が必要です。キャリブレーション ビーズを使用しています。

パラメトリック最適化を用いたフローサイトメトリー法による CD90 と CD45RA を使用して急性骨髄性白血病でブラスト セル人口の検出は、比較的単純?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pancoll	PAN-Biotech	P04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)	Ozyme	BLE420301	RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  mice	JACKSON LABORATORY	Stock No: 005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)	Beckman Coulter	PN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)	Beckman Coulter	B36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)	Biolegend	328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)	Beckman Coulter	A07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)	Beckman Coulter	B92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)	Beckton Dickinson	560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)	Beckman Coulter	B92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)	Beckman Coulter	B36294
Anti-CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
Anti-CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
Anti-CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
Anti-hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
Anti-mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep human PE selection kit	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  magnet	Stem Cell Technologies	18551