生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

要約

このプロトコルでバキュロ ウイルスは Sf9 細胞にトランスフェクション バキュロ ウイルス プラスミドのプロデュース、無血清培養で増幅されます。上清はヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、超遠心法でさらに集中しています。このプロトコルは、生産およびバキュロ ウイルス遺伝子治療応用のための浄化に役立ちます。

要約

バキュロ ウイルスは、組換えタンパク質、ワクチンの生産のため伝統的に使用されています。しかし、最近では、バキュロ ウイルスは遺伝子治療応用のための有望なベクトルとして現れています。ここでは、バキュロ ウイルス バキュロ ウイルス プラスミド DNA (バクミド) のトランスフェクション Sf9 細胞の付着性文化で生産されています。バキュロ ウイルスは、希望の音量が得られるまでその後 Sf9 細胞の無血清培養に拡張されます。それは、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いた培養上清の文化から精製します。ウイルス上清は、バキュロ ウイルスのエンベロープ糖蛋白のヘパリンの親和性により上澄みでバキュロ ウイルス粒子を結合するヘパリンの列に読み込まれます。列は汚染物質を除去するためのバッファーで洗浄、バキュロ ウイルスは高塩バッファーを持つ列から溶離されます。溶出液が等張液の塩濃度に希釈され、バキュロ ウイルス粒子がさらに遠心を使用して集中しています。このメソッドを使用して、バキュロ ウイルス感染粒子の 25% 回復を 500-fold まで集中してすることができます。ただし、ここで説明されているプロトコルは、1 L までの文化から生産と精製、バキュロ ウイルスを示します、メソッドできますがスケール アップ遺伝子治療応用のための臨床グレードのベクトル生成閉鎖系の培養における。

概要

バキュロ ウイルスは主に組換えタンパク質とチョウ目ハスモンヨトウ fugiperda (Sf) 9 でワクチンの生産の使用組換えハイブリッドバキュロとmulticapsid の核多角体病ウイルス (AcMNPV) を用いた昆虫細胞^1,2,3,4. もっと最近、遺伝子療法アプリケーション⁵の有望なベクトルとして浮上しています。幅広いホストおよび組織の親和性を持っている知られているし、静止して増殖細胞に感染して、非病原性はホスト染色体^4,5,6には統合されていません。また、スケーラブルでありクローズド システムの将来の臨床生産¹の処理は、無血清浮遊培養でバキュロ ウイルスを生成できます。

バキュロ ウイルス粒子の純度は細胞毒性^7,8,9を最小限に抑えながら効果的な伝達を達成するために重要です。バキュロ ウイルスは、遠心または接線流ろ過 (TFF) 伝染性の影響は限定的で集中することができます。しかし、これらの手順だけでなくウイルス粒子を集中、また細胞の残骸と Sf9 から蛋白質文化、毒性の in vitro (個人的な観察) できるし、炎症や使用する免疫反応を引き起こす可能性があります生体内で。ウイルス株を集中して高度な場合は特に、これを避けるため、バキュロ ウイルス感染を精製し、粒子を汚染から分離する必要があります。

いくつかの方法は、バキュロ ウイルスのベクトル^10、11,12の濃縮精製に報告されています。使用可能なアプローチのヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは低濃度タンパク質¹²を汚染の浄化のシングル ステップの高レベルのことができます。メソッドは、バキュロ ウイルス^13,14の受容体としてのヘパラン硫酸の同定に基づいています。列とバキュロ ウイルスのバインディングに Sf9 細胞上清をロードした後列は非連結またはゆるく縛られた汚染粒子を除去する生理学的な (等張性) バッファーで洗浄できます。ヘパリンへのバインドはリバーシブルなのでバキュロ ウイルス粒子は不活性化を防ぐために生理学的 (等張性) 塩濃度に希釈はしてすぐに浸透衝撃¹²高 salt のバッファーで溶出することができます。また、上のキャプチャと同様に、バキュロ ウイルスの生産とクロマトグラフィー カラムからの溶出実行できます現在の優れた製造基準 (cGMP) に互換性のあるクローズド システム プロセスを使用しています。

ここでは、製造、精製、およびアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いた感染バキュロ ウイルスの濃度の詳細なプロトコルを提供します。簡単に言えば、付着性文化のバキュロ ウイルス プラスミッド DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションによってバキュロ ウイルスを制作・無血清培養で感染バキュロ ウイルスをさらに拡大します。我々 はヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスを浄化し、高い遺伝子治療用ベクターを集中する最後のステップとして遠心を使用します。

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プロトコル

プロトコルをまとめた図は、図 1を参照してください。

1. バキュロ ウイルス プラスミド DNA の精製

1. 流体培養基 LB の抗生物質; での 200 mL の baculoviral プラスミド DNA (バクミド)¹⁴を含む細菌文化を成長します。カナマイシン (50 μ G/ml)、テトラサイクリン (10 μ G/ml)、ゲンタマイシン (7 μ g/mL)、300 rpm で軌道シェーカー設定 37 ° C で 16 時間。
2. 標準散プロトコル¹⁵を使用して細菌文化からバクミド DNA を浄化し、TE バッファーでバクミドを溶解します。

2. バキュロ ウイルスの生産

1. 135 rpm、ポリカーボネート昆虫無血清培^1,2,3を含む三角フラスコで 28 ° C で軌道シェーカー インキュベーターで培養 Sf9 細胞。
   注:Sf9 細胞が凍結ストックからフリーズ解除、回復し、成長指数段階を入力するセルのために少なくとも二週間を許可します。
2. トリパン ブルー染色後の診断と成長指数段階で収穫した Sf9 細胞を数えます。種子 1 x 10⁶ Sf9 細胞培地 2 mL に 6 ウェル培養処理プレートのウェルあたり。インキュベーターで 28 ° C で 1 時間付けるセルを許可します。
3. 成長培地を無血清培グレースの昆虫培養液 1 mL に置き換えます。
4. 昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を用いた Sf9 細胞に DNA バクミドを transfect します。
   1. ミックス 8 μ L 昆虫の細胞のトランスフェクション試薬グレースの昆虫媒体の 100 μ L で。
   2. 希釈培昆虫媒体の 100 μ L に DNA バクミドの 2 μ g、ボルテックスで軽く混ぜます。
   3. 希釈昆虫細胞のトランスフェクション試薬を希釈した DNA を組み合わせて、軽く混ぜます。室温で 15 〜 30 分間インキュベートします。
   4. セル上に滴下し DNA 脂質混合物を追加します。28 ° c 約 5 h のインキュベーターで孵化させなさい。
5. 細胞からトランスフェクション混合物を削除し、2 ml の PBS のセルを洗浄します。
6. 昆虫培養液 2 mL を追加し、インキュベーターで 28 ° C で、文化メディアを変更せずに続行します。
   注:バクミドには蛍光タンパク質が含まれています、その式がセル 48 時間後トランスフェクションで検出できます。バキュロ ウイルスは transfected Sf9 細胞によって生成され、その後融合細胞を感染する培養液に分泌されます。セル全体人口は、5 日間でバキュロ ウイルス感染し、細胞変性効果とも呼ばれます、ウイルス感染の兆候を示しています。細胞直径が含まれます、細胞質、細胞増殖の停止と死亡または分離細胞の液胞/顆粒が細胞培養の存在。ただし、トランスフェクションや感染効率が最適ではない、文化がない明らかな細胞変性効果が表示されます。200-400 倍の倍率で倒立位相差顕微鏡で細胞変性効果を視覚化できます。バキュロ ウイルス感染細胞は、抗 gp64 抗体¹¹との汚損によって検出できます。
7. 収穫バキュロ ウイルス上清 5 日トランスフェクションとラベル後 P₁ウイルス ストックとして。
8. PBS、バキュロ ウイルス上清、0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) で暗闇の中、光に敏感であるに格納します。短期 (90 日まで) のための 4 ° c または長期的には-80 ° C で保存します。
9. 昆虫培養培地 10 mL に 10 cm 培養処理板のシード 6 × 10⁶ Sf9 細胞。セルに初期バキュロ ウイルス上清 (₁P) の 1 つの mL を追加します。
10. バキュロ ウイルス上清 (P₂) 5^th日後感染症での収穫します。
11. シード 50 mL 三角フラスコ 250 mL ポリカーボネートで昆虫培地の培養における Sf9 細胞 (3 x 10⁶セル/mL) と軌道シェーカー インキュベーターでフラスコの場所。セルに P₂株式の 2 mL を追加し、28 ° c. の一定した温度を維持しながら 135 回転で振る
    注:感染後 3 〜 4 日 Sf9 細胞母集団高価バキュロ ウイルス生産の指標である細胞変性効果が表示されます。
12. 音量 (P₃P₄、...) を取得するまで、順番にバキュロ ウイルス上清を増幅する各後続の感染における細胞培養の 50 のボリュームを 10 増。
    注:P₃は感染 Sf9 の 1 l、500 mL の細胞培養は、P₂バキュロ ウイルス上清; の 10 〜 20 mL に感染することのラウンド 3^rdP₄は感染 Sf9 のどの 5 ~ 10 L の細胞培養は、P₃バキュロ ウイルス上清の 100 に 200 mL に感染することのラウンド 4^thです。通常、ml 昆虫無血清培地で/3 × 10⁶細胞 Sf9 細胞がシードされます。
13. バキュロ ウイルス細胞の残骸を削除し、ゲノム DNA および RNA を消化する 37 ° C で 2 h の 50 単位/ml ヌクレアーゼ (250 単位/μ L の株式) と清のバキュロ ウイルスの治療に 4 ° C で 30 分間 1,000 x g で上清を遠心します。0.45 μ m のろ過ユニットを介して培養上清をフィルター処理します。

3. クロマトグラフィー システムの準備

1. 順番に、サンプルとバッファー ライン各滅菌水、1 N 水酸化ナトリウム、水の洗浄によってクロマトグラフィー システムを準備し、線形流量 50 mL/分で洗浄バッファー (含む 150 mM 20 mM リン酸ナトリウム塩化ナトリウム バッファー、pH 7.0)。
2. カラムの洗浄バッファー (5 CV 滅菌 20 mM リン酸ナトリウム バッファー含む 2 M の塩化ナトリウム、pH 7.0) を順番に実行して、ヘパリン 50 μ m 列 (10 × 10 cm、7.9 mL 列ボリューム (CV)) を準備および線形流量 7 mL/min で 5 CV 洗浄バッファー。

バキュロ ウイルスをベクターの清浄化

1. クロマトグラフィー システムをとおり設定します。
   1. バキュロ ウイルス上清をロードするための入口ポートを読み込むサンプルを使用します。
   2. 洗浄バッファーの読み込みバッファーの入口ポート A1 を使用します。洗浄バッファーの少なくとも 500 ml のボトルを準備し、瓶の中に洗浄バッファーの行を配置します。
   3. 溶出バッファー (1.5 M の塩化ナトリウム、pH 8.0 で 20 mM リン酸ナトリウム) を読み込むためのバッファー入口ポート A2 を使用します。溶出バッファーの少なくとも 500 mL の瓶を準備し、瓶の中に溶出バッファーの行を配置します。
   4. 列パススルー バキュロ ウイルス上清を収集する一部のコレクター、洗浄バッファー、および溶出バキュロ ウイルスいくつかの 50 mL の円錐管に挿入します。
2. 洗浄バッファー (40 mL) 線形流量 7.0 mL/分での 5 つの 7.9 mL 列ボリューム (CVs) とヘパリン コラムを平衡させ。
3. バキュロ ウイルス上清 2.0 mL/min の線形流量でクロマトグラフィー システムのサンプル ポンプ (入口サンプル ポート) を使用して、ヘパリン列に 250 mL をロードします。
4. 紫外線 (UV) 吸光度曲線になるまで洗浄バッファーの線形 2.0 mL/min の流量でヘパリン列を介して 10 CVs (80 mL) を実行 (280 nm) がベースラインに戻ったなり安定します。
5. ヘパリン列からバキュロ ウイルス粒子を切り離して考えるとき線形流量 4.0 mL/分時計タンパク質クロマト グラム上のシャープな溶出ピークで溶出バッファーの 5 CVs (40 mL) を持つ 7.9 mL ヘパリン列からバキュロ ウイルス粒子を溶出します。
6. 後の溶出、すぐに 10 倍その後遠心分離中に浸透衝撃からバキュロ ウイルス粒子の不活性化を防ぐために水に 20 mM リン酸ナトリウム緩衝を使用して溶出バキュロ ウイルス上清を希釈します。
7. 各分画の 100 μ L をストアは、バキュロ ウイルス上清、洗浄バッファー、および溶出液の読み込み中に収集された列の通過など。HT1080 浄化プロセス (セクション 6 を参照) を評価するためにこれらのバキュロ ウイルスの分数に感染します。
8. カラムの洗浄バッファーと洗浄バッファーで列をきれいに。最後に、線形 7.0 mL/分の流量で 5 CV 滅菌 20% エタノール水で列を洗い、4 ° C で保存
9. 水、1 N 水酸化ナトリウムを水と再び 20% エタノール水 50.0 mL/min の線流速とクロマトグラフィー システムをきれいにし、20% エタノールでシステムを格納します。

5. バキュロ ウイルスの濃度

1. オートクレーブを用いた遠心管を消毒済み。ティッシュ文化フードの各遠心チューブにバキュロ ウイルス上清の等しいボリュームを追加します。バランス チューブの重量を測定し、滅菌 PBS で遠心管の内容の重さを調整します。
2. SW 32 Ti ローターのバケツを反対に超遠心機チューブのそれぞれを配置します。
3. 80,000 × g で、超遠心機を実行4 ° C で 90 分
4. ティッシュ文化フードの遠心管を開き、無菌バキュロ ウイルス ペレットを削除せず、液体を吸引します。
5. 積極的に上下に 200 μ L 0.5% (w/巻) BSA を含む PBS でピペッティングによる各チューブのペレットを再懸濁します。
6. クリオバイアル (バイアルあたり 50 に 100 μ L) に集中バキュロ ウイルスを転送し、-80 ° C で保存

6. バキュロ ウイルスの滴定

1. 感染、前日は、トリパン ブルーとセルを青色に染色後、検定を用いた HT1080 細胞をカウントします。2 ml のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む 6 ウェル プレートのウェルあたりの種子 1 x 10⁵ HT1080 細胞。種子いくつか追加井戸細胞感染の時に存在の正確な数を決定することができます。37 ° C、5% CO₂でインキュベーターで培養します。
   注:HT1080 細胞は、他のセル行¹⁶と比較するとヘパラン硫酸のより高いレベルを表現しており、滴定に使用されます。HT1080 細胞が付着、滴定はより簡単なより伝統的な Sf9 による滴定を使用する場合に比べて時間がかかる。
2. 感染症の日に井戸からセルをカウントすることによってウェルあたりの細胞数を決定します。設定されていた脇カラム精製前とサンプル列の流れを通じて、洗浄、および溶出画分から、希薄化後の元バキュロ ウイルスを追加することによって、細胞に感染します。各サンプルの希釈と経験的バキュロ ウイルス感染粒子に基づいてボリュームを決定し、3 通の各ウェルに感染します。
3. 感染後 2 日間は、興味の遺伝子の表現のための細胞を分析します。細胞を蛍光蛋白質 (例えばGFP)¹⁷を表する場合流れの cytometer を使用して分析できます。
4. 細胞感染、希釈倍率、数式を使用してセルの蛍光蛋白質の割合の時に存在の数に基づいて価 (1 mL あたり感染単位) を計算: (蛍光タンパク質の感染 × 割合の中にセルの数陽性細胞 × 希釈倍率)/mL でバキュロ ウイルスのボリューム。
   注:たとえば、感染症の時もあたりのセル数の合計が 1.2 × 10⁵、蛍光タンパク質の割合は 5%、希釈倍率は 100、追加希薄バキュロ ウイルスの量は 10 μ L、力価は 6 × 10⁷感染単位 (IU)/mL です。

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結果

提示されたプロトコルは、フロー図 (図 1)。手順にはバクミド板の付着性文化、無血清培養、ヌクレアーゼ治療、遠心分離と濾過によって明確化以降の増幅でバキュロ ウイルスを生成する DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションが含まれます超遠心法による濃度がヘパリン親和性クロマトグラフィーによる浄化が続きます。

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ディスカッション

ここで提示されたプロトコルでは、Sf9 細胞懸濁培養におけるバキュロ ウイルスの生産とヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスの精製をについて説明します。このプロトコルで使用されるパラメーターは収量を最大化し、感染バキュロ ウイルスの不活性化を最小限に抑えます。ここで提供されるプロトコルは、⁹他の人が達成したバキュロ ウイルス?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akta Avant 150	GE Healthcare	28976337	Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column	ThermoFisher Scientific	4333414	Heparin column
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	Non-catalog item	Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube	Beckman-Coulter	326823	Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator	ThermoFisher Scientific	Non-catalog item	Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks	ThermoFisher Scientific	238071	Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks	ThermoFisher Scientific	238072	Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Tissue culture treated plate
10-cm plate	ThermoFisher Scientific	08-772E	Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF	EMD-Millipore	SCHVU05RE	Filtration unit
Kanamycin	ThermoFisher Scientific	15160-054
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit	ThermoFisher Scientific	10360-014	Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell	ThermoFisher Scientific	12331-013	Competent cell for bacmid
TE buffer	In-house	Non-catalog item	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit	ThermoFisher Scientific	K2100-06	For bacmid purification
Sf9 Cells	ThermoFisher Scientific	11496-015	Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium	ThermoFisher Scientific	11605-094	Transfection medium
PBS	ThermoFisher Scientific	20012227	Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media	GE Healthcare	SH30278.02	Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA	In-house	Non-catalog item	Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II	ThermoFisher Scientific	10362	Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4737	Stabilizes Baculovirus
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	For storage of Baculovirus
HT1080 cell line	ATCC	CCL-121	Fibroblast cell line
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Growth media for cell lines
Wash buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water	In-house	Non-catalog item	For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.09137	For Akta Avant cleaning
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7073	For Akta Avant cleaning