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要約

ここでは、蛍光蛋白質、Eos、生きている動物の表現する特定の領域に紫外線暴露により光電セルを達成する方法を表示するためのプロトコルを提案する.

要約

動物や植物の組織細胞の異なる集団で構成されます。これらの細胞と組織を維持・構築に時間をかけて対話中断されるとき病気を引き起こすことができます。科学者は、細胞のサブセットに蛍光蛋白質を表現することによって特徴とそのまま組織内でこれらの細胞の自然動態を調査するためのテクニックを開発しました。しかし、時は、実験は時単一細胞または細胞の人口のように、組織内の細胞より選択した可視化する必要があります。科学者はこれを実現し、セルの人口内の単一のセルを可視化する蛍光タンパク質の単一セルの光電を活用しています。このテクニックを示すためには、方法を示しますここをそのまま、興味の Eos を表現する細胞に UV ライトを指示するゼブラフィッシュの生活します。私たちは、どのように彼らは組織の変更を確認するそれらの photoconverted Eos+セル 24 時間後をイメージします。二つの手法: 単一セルの光電とセルの人口の photoconversions。これらの技術は、細胞間相互作用、細胞運命と分化、細胞移動、作りそれ多数の生物的質問に適用する技術を視覚化する使用できます。

概要

複数の異なる細胞が複雑な動物や植物の組織の維持・構築に対話します。これらの細胞は、インターカ レートとティッシュの固定を必要とする高分解能顕微鏡なしの単一セルのレベルで近所の人から区別することは困難。しかし、どのようにこれらの組織フォームを理解、維持、病気になるには、組織内の単一のセルを調べることが不可欠がされて時間をかけて相互作用しています。理想的には、これらの実験は、固定する必要がなく非侵襲的な方法で組織内の単一セルのラベルを必要とします。科学者は今この作業1,2,3、4を達成するために多数の技術を開発しました。

発見とクラ ゲの緑色蛍光タンパク質 (GFP) の実装は、組織環境1の異なるセルのラベルの 1 つの刺激的なアプローチだった。細胞特異的発現プロモーターを使用して、それは遺伝子1のラベルが付いているセルのサブセットを選択することが可能です。また、GFP3,4のユーザー選択式の GFP の発現するウイルスを利用できます。GFP 発現の遺伝的媒介が; 組織における細胞のサブセットの内でユーザーが選択した式を許可しませんが、非常に便利でき、GFP のウイルス発現が有利な侵襲的です。単一細胞および複雑な組織2,でそれらの間の相互作用を視覚化することが可能なっている GFP 誘導体および Brainbow 組織内よりまばら異なる蛍光蛋白質を表現するような巧妙な技術の出現で、5します。 ただし、これらのアプローチがランダムな方法で細胞をラベルします。目的の実験には、単一細胞の可視化や実験者によって定義されているセルの人口が必要とする場合そのため制限されます。そのような実験と区別する単一のセル方式で操作できる遺伝子発現蛍光タンパク質を持っているに有利であろう他の蛍光・非蛍光性の細胞から。

この目標を達成するため、複雑な生体組織内の単一セルの細胞生物学を視覚化は、科学的なコミュニティは、異なる蛍光タンパク質6,7,8の単一セルの光電を使用します。緑から赤の蛍光状態紫外線にさらされたときに移行蛍光蛋白質 (すなわち、eos、楓等) の表現を制御する遺伝子を使用して (488 nm) 光、我々 は蛍光に分類されたからの単一のセルを区別できます。隣人6,7,8。このアプローチは、回折限界領域にレーザー スタックからライトを指示することができます私たちの共焦点の顕微鏡に接続されている装置を利用しています。この手法により、我々 はどちらか単一セルまたはユーザー定義の方法9,10,11より大きい人口ラベルできます。手法は、ウイルス ・ GFP の単一細胞注射に比べて低侵襲です。Photoconvert 末梢神経系と脊髄9,10の腹側に位置する細胞のようなより大きい人口を photoconvert 神経節内の単一細胞ことを示して我々 の概念の証拠として 11,12。彼らの動きや開発中に分化に洞察力を得るためにこれら photoconverted のセル人口 24 h 後、視覚化できます。

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プロトコル

すべての動物の研究は、ノートルダム大聖堂機関動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されました。

1. ゼブラフィッシュ標本の作製

  1. 標準的な手順13あたり交尾商工会議所にオス一匹と 1 つアダルト女性 Tg (転換タンパク質) を配置します。本稿では、Tg(sox10:eos) 魚9アクセスが蛍光蛋白質と他の形質転換線を同様に使用することができますを使用します。魚では、配置を行う場合に 1 つ以上の区域を設定します。一晩部屋のままに魚を許可します。
  2. 次の朝は、100 mm のペトリ皿に卵を収集します。上映前に卵を成熟させ 24 時間後受精 (hpf) を許可します。
  3. 上記の動物の遺伝子のヘテロ接合体なら、Tg(sox10:eos) + 488 nm 光源と GFP と胚の画面 24 hpf 料理は解剖顕微鏡のセットをフィルターします。Tg(sox10:eos) + 胚を分離でき、48 に成熟する hpf。
  4. 針やピンセットを使って手動で Dechorionate 胚。
  5. 準備、0.8% 低溶解点アガロース溶液の 5 mL を電子レンジします。
    1. Agarose が touch にクール、場所 3-4 麻酔 Tg (sox10:eos) +48 10 mm のガラス基板の中央に hpf 魚底シャーレ。
    2. カバーガラス、約 1 mL の表面をカバーする十分な agarose を追加します。探針を使用すると、その両側に魚を配置できます。動物の取付を確実に固めるための agarose を許可します。寒天の凝固14まで、ゼブラフィッシュを継続的に再配置する必要があります。凝固は約 2 分です。
  6. 2 分の agarose が凝固した後、ゆっくりと胚培 0.02% アミノ安息香酸エステル (Tricaine) 寒天や皿の底面を水中まで皿を追加します。これは、約 3 mL をする必要があります。

2. 顕微鏡取り付けと事前変換イメージング

  1. 共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャ、フォーカス ウィンドウ [図 1] を選択します。キャプチャ ウィンドウの下には、[キャプチャ設定] タブ [図 1] ドロップダウン ラボ固有の変換イメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定「魚イメージングします」と呼びます
  2. 共焦点範囲に試験片を置き、コースと微調整ノブを使用してフォーカスに。
  3. フォーカス ウィンドウを開き、興味 (すなわち後根神経節) の目的の地域を探します。
  4. C488 レーザー フィルターを設定] メニューの [を選択します。300 ms に露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。
  5. キャプチャの種類] セクションの [3 D] ボックスを確認します。[ 3 D キャプチャ] セクションで、現在の位置を使用してを選択し、電流のまわりの範囲をチェックします。同じセクションの範囲を 35、36、飛行機と 1 ステップ サイズの数に設定します。範囲を増加またはイメージング領域の深さに対応して縮小することができます。脊髄の間 35-40 スタック範囲の値は通常、[図 5] は。
  6. [図 5] の現在の場所を選択します。
  7. 画像を取得するには、[キャプチャ] ウィンドウの下部に [開始。

3. 単一セルの光電

  1. 共焦点ソフトウェアを開き、キャプチャ、フォーカス ウィンドウ [図 1] を選択します。キャプチャ ウィンドウの下には、[キャプチャ設定] タブ [図 1] ドロップダウン ラボ固有の変換イメージング設定を選択します。ここでは、ラボ固有の設定は「魚は全チップを切除」と呼ばれる
  2. C488 c541 レーザー フィルターを設定] メニューの [を選択します。同じ顕微鏡のソフトウェアを使用していない場合、は、別のレーザーと選択、488 nm と 541 nm のレーザーを選択するメニューを見つけます。300 ms への露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。これらのレーザーの設定は、退色または毒性を引き起こすことがなく十分な蛍光シグナルを生成に基づいて選択されます。毒性や退色が視覚化されるレーザー パワーや露出を減らします。
  3. フォーカス ウィンドウを開き、フォーカス ウィンドウの [photomanipulation] タブをクリックします。レーザーのパラメーターを調整します。2、スタックのレーザー出力を変更しをクリックしてGo。ラスター ブロック サイズを 1 に変更し、設定をクリックします。ダブルクリックしてサイズを 4 に変更します。レーザー ラインを v405 に変更 [図 3]。
  4. キャプチャ ウィンドウの高度なキャプチャ設定を開きます。[Photomanipulation] タブを選択し、ダブルクリックして繰り返しを 2 に変更します。[図 4] [ok] をクリックします。
  5. フォーカス ウィンドウで、[XY] タブを選択します。[図 3,図 4] の [photomanipulation] タブで手順 2 からレーザーのパラメーターを再確認してください。Photoconvert なく周囲のセルの光電細胞にレーザーの設定を設定します。
    1. 隣接するセルの光電が存在する場合は、レーザー出力を下げます。セルの光電が発生しない場合は、レーザーを増やすことができます。最適な photoconvert 興味のない周辺地域のみにレーザーの出力を設定します。
  6. タイムラプスをオンにすると、下の種類をキャプチャします。[図 6A] を開始をクリックします。
  7. ライブ タイムラプス ウィンドウが開いたら、[図 7] の上部のツールバーで、[円] ツールを選択します。
  8. セルの中央地域で円を描きます。引かれた円を右クリックして、 FRAP 地域を選択し、3 秒間待ちます。選択した領域は暗くなるべき [図 8]。キャプチャを停止をクリックします。
  9. 1 つ以上の動物をイメージングする場合フォーカス メニューと選択位置 2 [XY] タブに戻ります。手順 4.1 4.6 を繰り返します。
  10. セルの人口を変換するには、手順 4.1 4.4 FRAP 関心領域は、線ツールを使用して円を描くのではなくのプロトコルおよびレーザーのパラメーターします。関心領域に直線を描くし、上記の同じパラメーターを使用して、領域を FRAP します。

4. ポスト光電イメージング

  1. すべてのポイントが photoconverted です。Precoversion イメージング手順 3 に記載されている設定ラボ固有の標準画像のスタックを選択します。これは、キャプチャ キャプチャ ウィンドウ [図 5] タブのドロップダウンの設定下にあります。
  2. C488 レーザーを選択し ms に露出を設定、5、パワー、75 [図 2] に強化します。
  3. C488 レーザーと同じメニューの下にある c541 レーザーを選択します。500 ms に露出を設定、レーザーの電源を 10、および 75 [図 9] を強化します。
  4. キャプチャの種類] セクションの [3 D] ボックスを確認します。[ 3 D キャプチャ] セクションで、現在の位置を使用してを選択し、電流のまわりの範囲をチェックします。同じセクションの範囲を 35、36、飛行機と 1 ステップ サイズの数に設定します。増加または [図 5] 希望のイメージング深さに合わせて減少する範囲数。
  5. XY フォーカス] タブで複数のポイントがある場合は、キャプチャ ウィンドウでマルチポイント リスト オプションを選択します。ない場合は、現在の場所を選択します。
  6. 画像を取得するには、[キャプチャ] ウィンドウの下部に [開始。

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結果

組織6内の個別のセルにラベルを付けるには、蛍光タンパク質の光変換を使用できます。これを示すには、 Tg(sox10:eos)魚9 sox10の規制のシーケンス下の蛍光蛋白質 Eos を表現する使用されました。48 Tg(sox10:eos)動物 hpf が最初にマウントされていると、可能性があります任意の非特異的光電検出イメージを作成します?...

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ディスカッション

複雑な組織の種類セルは特定のドメインに整理します。最近の技術はこれらの大規模な組織の構造の1,2,の3の内で個々 のセルをラベルに利用されています。単一細胞の相互作用および複雑な組織内で細胞人口の相互作用を視覚化する同様に利用できる 2 つの手法を示します。光電技術の利点は、科学者はセルをはっきりと...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

ベルナール ・ Kulemaka とサム ・ コネルとブレント レッドフォード 3i ゼブラフィッシュ ケアのため画像の質問とデボラ ビッグバン カレン耳を傾ける、ケイ ・ スチュワートの守備のための有用なコメントと試薬指導、スミス研究室のメンバーに感謝しますこの作品は、ゼブラフィッシュ研究幹細胞のセンターとノートルダム大学とノートルダム大学で再生医療のノートルダム大学、エリザベスとマイケル ・ ギャラガー家族、アルフレッド ・ p. スローン財団、センターによって支えられました。大聖堂。すべての動物の研究は、博士コーディ スミスに IACUC ノートルダム大学に準拠して行われました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tg(sox10:eos) zebrafish animalsFish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dishVWR25384-302
Embryo mediumEmbryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dishTed Pella Inc.14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)Fluka analyticalA5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filtersZeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion405 nm laser
Slidebook software3i
Methylene blueKordon

参考文献

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

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