全身麻酔を使用してプロシージャのマウスにおける体系的な評価

要約

全身麻酔を使用してプロシージャの間にマウスの福利を評価するためのプロトコルを開発しました。グルココルチコイド代謝物を分析しただけでなく幸福のレベルを示す行動パラメーターのシリーズ。プロトコルは、動物を中心とした科学的な厳しさの度合いを推定する一般的な援助として使用できます。

要約

ラッセルとトリーバーチの原則 (交換、削減、洗練された) が開発した 3 r、合わせて科学的な研究は、可能な限り動物実験に代わる方法を使用してください。動物実験に代わるものがない、実験動物使用数の合計は貴重なデータを取得するための必要最小限にする必要があります。さらに、痛み、苦しみ、そして実験手順に伴う苦痛を最小限にする適切な洗練の手段が適用されるべき。痛み、苦しみ、そして苦痛の程度を分類に使用されるカテゴリは、非回復、軽度、中程度、または重度 (EU 指令 2010年/63) です。カテゴリは、個々 のケースで適用するには、それは科学的に正しいツールを使用する重要です。

ここで示したよくあ評価プロトコル中に全身麻酔を使用するプロシージャです。プロトコルは穴を掘るなど幸福の指標としての動作の造巣ホーム ケージ活動、マウスのしかめっつらスケールと豪華な行動に焦点を当てください。また、特性不安関連行動の自由探索的パラダイムを使用します。24 時間麻酔後に急性ストレスの指標として糞便中コルチコステロン代謝物を測定します。

プロトコルはマウスの全身麻酔の幸福の科学的に確かな情報を提供します。その簡単のためプロトコル簡単に適応でき計画研究の統合します。それが EU 指令 2010年/63 のカテゴリーにおける苦悩を分類するスケールを提供していない研究者が科学的データを用いた手法の厳しさの度合いを見積もることができます。それは、動物を中心とした科学的方法で幸福の評価を改善する方法を提供します。

概要

EU ディレクティブ 2010年/63¹は、ラッセルとバーチ²によって開発された 3 r 原則 (交換、削減、改良) は動物実験が必要な場合に適用することを定めています。EU 指令の究極の目標はすべての動物テストを段階的に、ディレクティブ、当分の間、いくつかの動物実験がまだ必要な人間と動物の健康を守る研究を行うことを認めています。したがって、動物実験は、任意の別の方法で置き換えることはできません、実験動物の最小数のみは、信頼性の高い結果を得られます。さらに、痛み、苦しみ、そして実験プロシージャを伴う苦痛の量は適切な洗練の手段を使用して最小化する必要があります。EU ディレクティブ 2010年/63 は、手順の重大度は、非回復、軽度、中程度、または重度の¹として前向き分類される必要が定めています。重症度分類は、ケースバイ ケースに基づいて決定は、特定の手順の重大度を推定するための科学的ツールを持つことが重要です。

モートンとグリフィス³提案としてスコア シートは、幸福⁴に対するマイナスの効果を含む正常な状態からの任意の偏差を検出するに必要不可欠なツールです。スコアシートが遡及的痛み、苦しみを決定する使用され、実験によって引き起こされると (例えば体重、毛皮、歩行)、個々 の動物の物理的な状態で目に見える変化に焦点を当てる。附属書 VIII の EU 指令 2010年/63 は、それぞれに重要度カテゴリの例を示します、データに基づく科学的を使用して指定されたプロシージャの厳しさの度合いを推定する研究者まだ欠如ツール。

否定的な幸福を示す指標の不在は、動物の状態を判断する唯一の方法ではないです。肯定的な幸福を指す指標の存在はまた重要な^5,6,7,8です。たとえば、動物は穴を掘るのような豪華な行動を表示や入れ子建物動作に不可欠なニーズが満たされたときのみ。幸福を縮小した場合高級動作^5,7を拒否する最初のです。幸福の評価で使用されるプロトコルは、詳細かつ包括的な⁹の彼らの幸福感を評価するために物理的な生理学的/生化学的、および動物の心理状態を指すインジケーターを含める必要があります。

洗練されたコンテキスト内でプロトコルはこれらの要件を満たすために、マウス¹⁰の福利に全身麻酔を含む手順の効果を評価するために開発されました。同時に目標は、与えられた実験にプロトコルの簡単な統合を有効にする追加のストレスを最小限に抑えることでした。プロトコルは、行動、活動、食物摂取、入れ子などホーム ケージ動作と特性不安関連行動を掘り進むと見なします。さらに、糞マウス顔をしかめるスケール (MGS) とコルチコステロン代謝物質の非侵襲的な分析を含みます。プロトコルは、科学的かつ動物中心に幸福の評価を容易にして厳しさの度合いの分類をサポートする福利に関する情報を提供するために設計されています。スコア シートの他のプロシージャの重症度分類に有用な情報を提供できます。プロトコルを実行する簡単です広範な装置を必要としない、研究の結果に影響を与えることがなく継続的な実験に統合できます。注意すべきこと動物の研究: レポートので生体実験 (到着) ガイドライン¹¹は、動物実験、改善設計、分析、およびレポートの目的を含むすべての調査で観察されます。

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プロトコル

研究ドイツ動物福祉法が定めたガイドラインに従って行われ、ベルリン州当局によって承認された ("Landesamt こだわり健康を祝して und Soziales"、許可証番号: G0053/15)。

注: このプロトコルの主な目的は、グルココルチコイド代謝産物の繰り返しなされる麻酔の効果を調べるためだった。使用される動物の数を決定するためのサンプル サイズの計算を行った: n ≥ 2 (s/μ₁- μ₂) ײ (z_α +_βz) ײ。μ₁- μ₂が作られていますサイズ計算力およびサンプルの作成手段の間の違い (α = 5%、β = 80%); z_α = 1.96 と z_β = 0.84 が標準正規分布の分位数。図 1は、このプロトコルのタイム ラインを示します。プロトコルのパラメーターは、コントロールのレベルとの違いを示しています、動物を密接に監視する必要があり、パラメーターは適当な期間の後に再度測定する必要があります。たとえば、特性不安関連行動が増加する場合この動作テスト必要がありますもう一度一週間後、完全復旧までの期間を確認するため。タイム ポイント、このプロトコルでは定義されている期間は、他のプロシージャで使用するために合わせることができます。時間ポイントを変更すると、馴化期間はプロトコルで説明されているように保つ必要があります。マウスの動作に影響を与えるかもしれない要因を減らすためには、マウスの通常の動作を妨げてはテストの後より多くの操作が必要なテストを実施しなければなりません。図 2は、スコアリングのサマリー シートを用いたプロトコルのすべてのテストをまとめたものです。図 3は、テスト結果を解釈する方法の概要を与える幸福のグレードの簡略化されたスケールを提供します。

1. マウスを実験者による処理に娯楽 habituating

1. 別の施設または仕入先から取得されて、少なくとも 2 週間の動物施設に慣らすためにネズミを許可します。
2. グループのマウスの家および 12:12 h の光: 暗いサイクル (室温 22 ± 2 ° C; 相対湿度 55 ± 10%) の標準的な条件の下でそれらを維持します。
3. 標準濃縮としてトンネルと綿の nestlets をすべてのグループに提供食品や水の自由。
4. トンネルやカップ、少なくとも¹²のテスト前一週間を処理するすべてのマウスを慣らします。
   ストレスや不安、幸福に影響を与えるとも、このプロトコルの¹²の結果に大きな影響は、注: を引き起こすことができる尾によってマウスを拾います。

2. 行動の実験室と装置の準備

注: は、テストでは、理想的には動物が飼われている部屋の近くの別の部屋を提供します。手順を実施する前に、テストの部屋、少なくとも 60 分ホーム檻の中でマウスを転送します。可能であれば、このプロトコル手順の実施、同じ実験室でのすべてのテストを実施します。

1. 穴を掘る動作⁸をテストし、MGS¹³ (図 4) で使用するため写真を撮影する観測ケージを準備します。
   1. 約 220 mm × 290 mm の面積と高さ 390 mm のガラスの箱を使用します。
   2. このボックスの寝具材料の約 0.5 cm の床をカバーします。
   3. 新しい環境によって引き起こされる苦痛を減らすために新しい寝具材料の上にホームのケージから使用される寝具材料の一握りを散布図します。
   4. 食品、食事と水供給は通常同じ種類を提供します。
      注意: もし可能であれば、マウスは寝具の材料と水鉢を埋めることができるので水のボトルを使用します。
2. ケージを準備 (タイプ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) をマウスを個別に収容されて 24 時間観察期間 (図 5)。
   注: 個々 の住宅の期間を最小限にするため、この期間中に動作、ホーム ケージ活動、食物摂取量と糞便コルチコステロン代謝産物 (FCM) の造巣のデータを収集します。
   1. 苦痛を減らすためにケージ (約 0.5 cm 深) と散布使用寝具素材新素材の上にホームのケージから糞便がなく一握りの材料を新しい寝具の場所。
   2. 環境エンリッチメント (材料の表を参照) だけ¹⁴として定義された重量の標準化された正方形の綿の nestlet を提供します。
      注: 商業 nestlets は重量で異なる場合があります。したがって、我々 は執事によって記述されている nestlet の重量を変更し、代わりに 2.7 g¹⁴2.0 g を使用します。
   3. 赤外線センサーを使用してホーム ケージ活性を測定するとき、ケージの上部に赤外線センサーをマウント (材料の表を参照)。
   4. 食べ物、食事、通常付属している同じ種類を提供して広告自由の水します。

3. マウスのしかめっつらスケール

注: 写真の 3 つの時点で観察ケージで、MGS の撮影です: (i) 2 日前処置後 (iii) 150 分、手順の後 (ii) 30 分 MGS のレコードのベースライン レベル プロシージャ。幸福は損なわれる、MGS のスコアが増加します。増加の MGS のスコアは 150 分後まだ観察される、後の段階で追加の写真を取る。

1. 写真の高解像度カメラを使用します。
2. そっと観察ケージにマウスを転送し、少なくとも 30 分間、新しい環境に慣らすために、マウスを許可します。
3. 約を継続的に取るたびに、30-40 写真ポイント 1-2 分以内。
4. すべての写真を並べ替えるには、正面または側面写真の鮮明さを選択してぼやけた写真や正面または側面ビューよりも他の視点からマウスの顔を見る写真を破棄します。
5. 各時間のポイント、(つまり2 日前の手順、手順の後の 30 分と手順の後 150 分) 各マウスから一枚の写真がランダムに選択します。
6. 体の位置は、表示されている¹³ではないマウスの頭だけを表示する写真をトリミングします。
7. それぞれの写真に 1 枚のスプレッドシート ファイルを作成し、各シートに MGS の 5 顔アクション ユニットを含むテーブルを追加します。
   注: ファイルには、写真投稿手順と同様に、ベースラインの写真が含まれています。
8. シートの順序をランダム化します。
9. ラングフォードらによって開発された MGS を使用し、3 ポイント スケールを使用して顔のアクション ユニットをスコアそれらを以前受けた 3 つの独立した人にコンピューター画面上のファイルを提示 (0 = 存在しない、1 = 中程度の提示、2 明らかに =現在)。
   注: 得点パラメーター¹³次に基づいて: 軌道引き締め (「しっかりと閉瞼や目スクイズの眼窩領域の狭小化」);鼻のふくらみ (「丸みを帯びた鼻の橋の上に見える皮膚の延長」);頬の膨らみ ("凸"の外観頬筋);耳の位置 (「耳か、垂直方向の尾根に戻って描画されている耳のヒントのおかげでそのフォームを特徴と離れて引っ張られ、彼らのベースラインの位置から戻って」);ウィスカ変更 ("のベースラインからのひげの動き位置いずれかの後方、顔またはフォワードに対して最後に立っているかのようひげがまた一緒に群生」)。
10. 通り (ラングフォードらから適応のスコアを分析します。¹³)。
    1. MGS スコアを生成するそれぞれの写真にすべての表情のユニットを平均します。
       注: 顔アクション ユニットの一つも、得点がない場合は平均残りの顔アクション ユニットです。
    2. ベースライン写真各マウスの MGS 違いスコアを取得する写真ポスト プロシージャの平均からの平均値を減算します。
    3. 人 (関連ある標本のノンパラ メトリック検定) の MGS 違いスコアの違いをテストします。
       注: 場合有意差 (p < 0.05)、スコアすべての写真やいくつかの写真のスコアだけが、人の間違いかどうかを決定します。後者が true の場合は、これらの写真の得点を繰り返します。それ以外の場合、人は MGS トレーニングを繰り返して、写真を再びスコアします。
    4. 平均、MGS 差異スコア各マウスの別の得点から得られる場合は、すべての人の結果が大幅に違いはありません。
    5. ノンパラ メトリック検定を使用すると、研究グループ間の平均 MGS 違いスコアを比較します。

4. 穴を掘る行動^8,,1516

1. 巣穴を準備するには、通常標準的な不透明なプラスチック水ボトル (250 mL、150 mm の長さ、直径 55 mm、ボトルの首の直径 45 mm)⁸食として供給される 140 ± 2 g の餌ペレットを配置します。
   注: マウスを好むワイド チューブ、68 の mm の直径の穴使用できます執事¹⁶のとおり。
2. 巣の場所は順化の手続きの前に 5 日間ホーム ケージに餌ペレットでいっぱい。
   注: 檻の中正規食品調剤ユニットは削除されませんする必要があります、マウスが使用されている食品ペレットでいっぱいにする必要がありますもこれに。
3. 2 回手続き (ベースライン) の前に 2 日間のテストを行う最後の 30 分の投稿手順を実行します。
   1. 少なくとも 30 分、MGS の写真が撮影された観測ケージに慣らすマウスをしましょう。
   2. プラスチック製の水のボトルの場所は食品ペレット観測ケージの後ろの壁に平行に満ちています。
   3. 2 h 後に穴に残って食品ペレット (g) の重量を量る。
4. 初期重量 (%) を基準にしてマウスで穴から削除食品ペレットの重量を計算します。

5. 24 時間観察期間

注: マウス、2.2 で説明されているように、個別に収容されます。(図 5)、24 h にわたり、食品を測定するために摂取量、ホーム ケージ活動巣作り行動と FCM レベル。24 時間観測が行われる二度: (ii) プロシージャの日に基準レベルは前の手順 (i) 2 日。

1. 食品の摂取量
   1. 体重 (スコア シートの部分) の任意の変化を評価するために定期的 (例えば麻酔、麻酔、麻酔後 2 日と毎週麻酔後の直前に前に、2 日) でマウスの重量を量る。
      注: 体重は、体重の 1 グラムあたりの食品摂取量の計算に必要です。水の摂取量は、24 時間観測期間中も測定できます。食品の摂取量が減少し、幸福感が損なわれます。
   2. ケージ (約 100 g) の食品単位で提供する標準的な食品食事療法 (グラム) の初期の重量を決定します。
   3. 24 時間観察期間の終わりに標準的な食品ダイエットの重量を決定します。
   4. 食品流出の慎重に食品の単位の下にケージ側をスキャンし、任意の余分な食品ペレット食品ユニットの残りの餌ペレットの重量が判明を追加します。
   5. 単位体重当たりの食品の摂取量を計算します。
2. ホーム ケージ活動
   注: 次の手順は、赤外線センサーの使用を参照してください (資料の表を参照)、ホーム ケージ活動が別のプログラムも行われるが。ホーム ケージ活動制御レベル (例えば自発運動の抑制、多動性) からの偏差障害者幸福の印であるかもしれない。
   1. プログラムを起動します。
   2. 1 分のサンプル間隔と衝動が 24 時間 1 分ごとを記録されることを意味、24 h の捕捉時間を選択します。
      注: 実験者が何度か部屋に入る記録を開始した後場合、のみ使用、マウスが邪魔なかったときの期間からのデータ (すなわち暗期)。
   3. インパルスの 10 分間隔をまとめます。
   4. (インパルス × 分) 時間曲線下の領域を計算します。
3. 巣作り行動
   注: 複雑・高の巣は幸福を示すインジケーターとして使用できます。
   1. 正方形の綿 nestlet を配置 (材料の表を参照してください) 檻の真ん中に定義された重量 (例えば2.0 g)。
   2. 次の朝、約 2 時間点灯後執事¹⁴によると 5 点満点 (下記参照) に巣をスコアします。初期 nestlet 重量の少なくとも 5% を任意の untorn の nestlet の部分の重量を量る。スコア通り¹⁴巣
      1. 90% そのままの nestlet の場合は「1」スコアを割り当てます。
      2. 50-90% そのままの場合は、「2」スコアを割り当てます。
      3. 割り当てるスコア「3」の場合は、nestlet の 50-90% は千切り。
      4. 割り当てる 90% 以上は千切り、巣はフラット、その円周の 50% 未満が丸くマウス本体高さより高い場合に「4」を獲得します。
      5. 割り当てるより 90 %nestlet は千切り、巣が高いとその円周の 50% 以上が背を丸めてマウスの平均身長よりも高い場合、「5」をスコアします。
4. 糞便中コルチコステロン代謝物
   注: コントロール レベル以上 FCM の増加 24 時間麻酔後に急性ストレスのレベルに合わせてください。
   1. 24 時間観察期間の終わりに鉗子を使用してケージからすべて乾燥糞便ペレットを収集し、尿で汚染されたぬれたペレットを排除します。
   2. パルメらによると FCM を抽出します。¹⁷、次のようにします。
      1. 60-70 ° C の温度で乾燥糞便
      2. モルタルを使用して糞便をホモジナイズしてください。
      3. 複数の渦に 30 分間遠心管中の 80% メタノール 1 mL に 0.05 g の因数を振る。
      4. 15 分間 2500 x g でサンプルを遠心します。
      5. 別の遠心チューブに上清の 0.5 mL のピペットします。
      6. -18 ° C 最低糞便 (物) を保存します。
      7. 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one 酵素免疫測定法 (EIA)^18,19または別の完全に検証された EIA を使用して FCM を分析します。
   3. FCM ベースライン FCM 濃度に対する濃度値の変化率を計算します。

6. 無料探索的パラダイム

1. ラックからホームのケージを取る、24 時間観測期間の終わりにテーブルの表面に置きます。
2. ケージの長い側に 45 ° の角度でケージに (食糧または水のボトル) なしグリッド ケージ上部を配置します。
   注: マウスの隠れ場所として、巣を破壊しないが、巣の上ケージ上部を斜めに配置。
3. モニターまたはビデオ記録約 1.5 m の距離から 10 分間マウス。
   1. タイマーを開始します。
   2. すべて時マウス (ケージの上のすべての 4 つの足) のケージの上に登って (ケージの床に足を 1 つまたは複数) とケージ上部の葉に注意してください。
      注: いくつかのマウスがケージの上に登って、ケージの端に沿って歩くためにそれを残します。いくつかのマウスをケージの上にリアできます。マウスがまだ上のケージなら、これらの場合を扱います。
4. バートらの後にパラメーターを評価します。²⁰。
   1. 待機時間 (単位は秒) の最初の調査を分析します。
   2. 探検の数を分析します。
   3. 探査の合計時間 (秒) を分析します。
      注: 最初の調査、探査、数が少ないと探査の低総期間に待ち時間特性不安の高いレベルを示すことができます。

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結果

このプロトコルはもともと C57BL/6JRj マウスのイソフルラン麻酔の経験を 1 つの幸福を評価するために開発された (45 分麻酔セッションは 1 つ、n = 13 女性) または繰り返しのイソフルラン麻酔 (6 麻酔 45 分のセッション 3-4 日で麻酔セッション、n 間 = 13 女性) マウスの幸福と比較して (n = 女性 6 名)¹⁰麻酔を受け取らなかったが、同じ手段によるとテスト...

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ディスカッション

プロトコルは、単一の麻酔または繰り返しのイソフルラン麻酔を受けた C57BL/6JRj マウスの福利を評価するために元々 開発されました。結果は幸福を評価するため機密性の高いメソッドが他の手段 (例えば無料探索的パラダイム MGS、穴居性の食品の摂取量) と同様に、高級な動作テストをするを確認します。繰り返しイソフルラン麻酔には、特性不安関連行動、MGS、潜砂行動の短期的な?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH	1214
InfraMot - Sensore Units	TSE Systems	302015-SENS
InfraMot - Control Units	TSE Systems	302015-C/16
InfraMot - Software	TSE Systems	302015-S
Nestlet N	Ancare - Plexx	NES3600
Camera EOS 350D	Canon