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要約

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr) を研究への応用を説明します。

要約

遺伝的非正規アミノ酸 (ncAAs) 黄色停止コドン抑制を介して定款は、生細胞に直接人工プローブと反応性タンパク質をインストールするのには強力な手法です。各 ncAA はホストの有機体にインポートされる専用直交サプレッサー tRNA/アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS) ペアが組み込まれます。異なる ncAAs の取り込み効率大幅異なるできいくつかのケースで満足できます。直交ペアは AARS または tRNA のいずれかを操作することによって改善できます。ただし、tRNA や AARS の大規模なライブラリと死者/生きている選択方法を使用しての進化には哺乳類細胞で、可能ではありません。ここでは、哺乳類細胞における直交ペアの効率を評価するための簡易で堅牢な蛍光ベースの分析が表示されます。アッセイは、AAR/tRNA バリエーションそれなりの努力と合理的な時間内の数百数十をスクリーニングできます。ピロリシン直交系の効率を大幅に向上させる新しい Trna を生成するこのアッセイの使用説明は、ncAAs の G タンパク質の研究への応用とともに結合受容体 (Gpcr)、ncAA のオブジェクト挑戦しています。突然変異誘発。最初に、体系的に組み込むことで受容体の細胞外表面部分を通して光橋 ncAA、そのまま受容体の異なる配位子の結合部位は生細胞に直接マップされます。第二に、GPCR に最後の世代の ncAAs を組み込むこと、超高速触媒無料受容体の蛍光色素をラベル付けを発揮、bioorthogonal ひずみ昇格逆ディールス ・ アルダー付加環化反応 (SPIEDAC) 生きている細胞を悪用します。NcAAs できます一般に適用するには、そのサイズに個別に蛋白質をメソッドが関心を持つアプリケーションの数です。また、ncAA 定款は特別な装置を必要としないし、標準生化学研究所で簡単に実行されます。

概要

タンパク質化学プローブの遺伝的定款は、構造および動的な生細胞のネイティブ コンテキストに直接蛋白質機能の調査を促進する強力な手法です。今日では、非正規のアミノ酸 (ncAAs) 装備されて最も異なる化学グループの何百もの生合成1,2,3,4site-specifically タンパク質に組み込むことが。それらの間の 1 つを見つける写真されております5、写真ケージ6,7,8,9写真切替可能なアミノ酸10,などの感光性 ncAAs11, アミノ酸ベアリング緊張したアルケンとアルキン触媒無料 bioorthogonal 化学2,12,13,14,15,16 ,17, ダンシル18クマリン9,19, とプロダン20,21 fluorophores が付いて、運ぶアミノ酸およびアミノ酸として他の生物物理学的プローブを装備ポスト翻訳の修正1,2,3,4,22,23,24,25とも。

NcAA の遺伝のエンコーディングは、専用アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS)、同種サプレッサー tRNA、通常リボソーム合成の際に黄色停止コドンに対応 ncAA を取り入れたペアで有効です。ncAARS/tRNA のペアは、ホストの有機体すなわち内因性のペアしないクロストークで直交になるように設計されています。技術は、原核生物と真核生物のホストと哺乳類に簡単に該当するセルの両方確立しました。哺乳類細胞における定款の ncAA のペアは 3 つの主要な直交システムに基づいています: B. 中等度好熱27 (Ec からチロシン琥珀サプレッサーによるエシェリヒア属大腸菌の26から TyrRS を組み合わせたチロシル システムTyrRS/Bst山芋ペア)、エシェリヒア属大腸菌ロイシル システム (EcLeuRS/tRNAルーCUAペア)6,18,28および古細菌由来ピロリジル システム (PylRS/tRNAPylペア)3、tRNApyl ブランドがあるという自然な琥珀色の抑制。一般に、各 ncAA は特殊な ncAARS によって認識されます。NcAA の構造に応じて、ncAARS は、いくつかの合成は、複数の ncAA を受け入れることができますがの TyrRS LeuRS や PylRS、進化を介して取得されます。

直交のペアは、単にプラスミッドのベクトルを使用して、セルにインポートされます。最も一般的かつ効率的なプラスミドは bicistronic であり、合成酵素と直交ペア29を形成する tRNA の両方をエンコードします。変更用に指定されたサイトで琥珀のコドンを軸受興味の蛋白質のための第 2 プラスミド エンコーディングは cotransfected です。NcAA は細胞成長培地に単に追加されます。ただし、異なる専門のグループはしばしば同じ ncAA の体用もプラスミドの構造のさまざまなバリエーションを使用します。ベクトル合成酵素の種類、コドン使用合成酵素遺伝子、プロモーターの使い方、tRNA と tRNA 式カセット数のバリアントの遺伝子配列で構造が異なります。さらに、異なる ncAAs の取り込み効率は、異なるシンテターゼ、品質、tRNA および他の要因の30の異なる触媒効率のため大幅に変更できます。したがって、それは手で直交ペア、全体的な蛋白質の表現を向上させるいくつかの最適化のステップを実行して、目的のアプリケーションに最も適したシステムを選択する両方の効率を評価する高速で信頼性の高いメソッドを持つことが重要得られます。

直交ペア29 (図 1) の効率を評価するためのシンプルで堅牢な蛍光ベースのアッセイを設けています。アッセイ、細胞が一緒にレポーターの bicistronic プラスミド寛容な位置 (EGFPタグ) 黄色停止コドンを軸受緑色蛍光タンパク質の両方をエンコードの直交ペアのプラスミッドのエンコーディングで cotransfected とmCherry 遺伝子。全体セル lysates の赤と緑の蛍光プレート リーダー、96 ウェル プレートでの独立したチャンネルで読み取られます。赤い蛍光性の強度は、測定サンプルとトランスフェクション効率のサイズの直接推定値を与えるに対し、緑の蛍光性の強度は直接琥珀色の抑制の効率と相関します。蛍光に基づいて同様の試金に関してアシスト セル (FACS) を並べ替え読み上げる31,32アッセイは、詳細セル全体の人口でタンパク質発現の包括的な評価を与える通常の実験条件の代表的な容易なデータ取得と標準ソフトウェアによる処理を提供しています。全体的に、アッセイの主な利点は、サンプル数が多いために、媒体は並行して分析できます。この試金を使用して、Pyl 直交系30の効率を向上させるサプレッサー Trna の合理的に設計されたライブラリを上映しました。この作品は、この分析を実行し、光橋 ncAA p アジドフェニル-L-フェニルアラニン (ウェット) 定款の直交ペアの最適化との比較など、応用事例を示す実験的プロトコルをについて説明します種類のアミノ酸 (図 2) の取り込み効率。

最後の年に ncAA のツールは非常に強力な構造を調査する実証されているし、G タンパク質の機能的な側面結合受容体 (Gpcr)33,34,35,36,37,38. ヒトでは、Gpcr 膜受容体 (800 人) の大家族を形成し、治療薬の主なターゲットを表しています。Gpcr の直接構造解析まだやりがいや補完的な生化学的手法が非常に彼らの調査のため必要があります。我々 が GPCR にサーフェスをマップし、リガンド結合ポケット34を発見光橋 ncAAs の使用の先駆者します。シュワンツの混入のための最適なシステムを使用して、我々 は体系的に生きている哺乳類セルに直接 GPCR の全体細胞ドメイン全体シュワンツを設立しました。UV 照射、シュワンツは近隣の分子が共有結合キャプチャ ナイトレンと反応性の高い種を形成します。リガンドをシステムに追加すると、シュワンツは受容体の位置に近づくバインドされたリガンドを明らかにするための近接プローブとして機能します。このように、神経ペプチド ホルモン私 (Ucn1) クラス B GPCR 副腎皮質刺激ホルモン-放出-因子受容体のタイプ 1 (CRF1R)33 Urocortin のバインディング モード初披露。最近、アゴニスト及びアンタゴニストの同じ受容体38の異なるバインドのパターンを開示しました。同様のアプローチは、orthosteric と他のペプチドや他の Gpcr の39,の40,41,の42の小分子リガンドのアロステリック結合部位を明らかにする他のユーザーによって適用されています。本稿では、光橋 GPCR 表面のマッピングの研究室において実験的プロトコルについて説明します。メソッドは、比較的高速な簡単なと標準生化学演習で適用されるように特別な装置を必要としません。重要なは、立体構造データが不足しており、リガンド結合部位を特定するだけでなく、またファーストクリーニング完全に変更された受容器からの情報を既存の in vitroデータを補完する貴重なツールを提供するアプローチ、生細胞の生理学的な環境。

新規の ncAAs 側鎖化学グループ超高速触媒無料 bioorthogonal 化学に適した軸受の最近の開発は蛋白質に超解像イメージングの最後の世代の蛍光物質をインストールする可能性を開いたライブで直接細胞の2,43を実行します。このようなケミカル アンカーは、緊張した cyclooctyne SCOK14BCNK12,17ビシクロ [6.1.0] nonyne と TCO のトランス cyclooctenes * K13,15,17他の ncAAs の間でノルボルネン16,17,44またはシクロプロペン45,46基をかくまっています。かさばる ncAAs bioorthogonal 化学 PylRSAFとして通常示される PylRS の変形によって組み込まれている (突然変異を示す Y271A、 M. barkeriの PylRS の Y349F)、その他アドホック進化 ncAARSs17よると同様,44. bioorthogonal アンカーがいくつ分43,48ラベリング高利回りを与える逆電子需要ディールス ・ アルダー付加環化反応による tetrazine 試薬47と反応します。ただし、直交の ncAA 設立システムの全体的な効率が低いため Gpcr のラベルにこの強力なアプローチの応用にチャレンジしております。私たちの強化された Pyl のシステムを使用して、我々 は最近 Gpcr と超高速 GPCR は、生きている哺乳類セル30の表面上のラベルにこのようなアミノ酸の高収率定款を実証しました。ラベル付けされた受容体の通り彼らは生理学的アゴニストの受容体を活性化時に内面のまだ機能している。Bioorthogonal 定款の実験的プロトコルが Gpcr に固定し、ラベリング手順をここで説明します。小さな明るい fluorophores が付いている Gpcr で装備は、高度な顕微鏡技術を介して生きているセルの GPCR の構造ダイナミクスの研究に向けた最初の基本的なステップです。

プロトコル

1. 結合効率 (図 1) の蛍光ベースのスクリーニング

  1. ダルベッコ変更イーグル培地で HEK293 細胞を維持 (DMEM; 高グルコース、4 mM グルタミン、ピルビン酸) 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われます。
  2. 種細胞のトランスフェクション前日。
    1. 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリプシン/PBS で 37 ° C で 5 分間細胞をデタッチします。10 cm 皿に 1 mL のトリプシン/EDTA を使用します。完全培地の 10 巻で癒す、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。検定49を使用して懸濁液中の細胞数をカウントします。
    2. 2 mL の完全培地に 6 ウェル プレートのウェルあたり 6.0 × 10 の種5 HEK293 細胞。サンプル、および 2 つの追加の井戸の数としての多くの井戸を野生型 EGFP とモック トランスフェクションのサンプルそれぞれ準備します。
  3. 顕微鏡下で合流 (セルによって占有される領域) を制御します。ポリエチレンイミン (PEI) 試薬を用いた ~ 70% 合流でセルを transfect します。
    1. 0.25 0.5 の最終 ncAA 濃度のすべての井戸に作りたて ncAA 原液の適切な量を追加、トランスフェクション前 1 h mM。野生タイプ肯定的な制御と細胞増殖に及ぼす ncAA によって引き起こされるかもしれない蛍光信号の違いを防ぐために、モック トランスフェクション細胞などを含むすべての井戸に ncAA を追加します。
      注:原液を準備する溶解 0.1 0.5 ncAA M 0.2 0.5 を使用してメートル naoh 水溶液。ただし、いくつかの ncAAs は使用する前に 1 M HEPES (pH 7.4) の 4 つのボリュームで DMSO における初期の可溶化および/または中和を必要があります。一般的には、メーカーはストック溶液を調製するためのプロトコルをお勧めします。
    2. 微量遠心チューブに 1 μ g のプラスミド DNA 記者プラスミド (pcDNA3.0 EGFP183TAG- mCherry) の 1 μ g でテストする ncAARS/tRNA ペアのエンコーディングをミックスします。別のチューブで EGFP 野生型参照を使用して同じトランスフェクションとモック トランスフェクションを準備します。
      注:NcAARS/tRNA ペアのプラスミッドのエンコーディングに埋め込まれている tRNA カセットのコピーの数は、アプリケーションによって異なります。クローン作成を容易にする 1 tRNA コピーが推奨されるときに異なる Trna をスクリーニング (とはいえ厳密には必要ありません) を 4 枚お勧めします一方、テストの別の ncAARS または同じ直交ペアによって異なる ncAAs 定款。
    3. 各チューブを含む DNA は 100 μ L 乳酸 pH 4.0 および 150 mM NaCl で乳酸ナトリウム 20 mM を含むバッファーの食塩水 (ポンド) を追加します。軽く混ぜます。
    4. 各管にポンドで DNA を含むポンドで 1 μ g/μ l プリンスエド ワード島 6 μ L を追加 (ペイ/DNA の比率 = 3/1 w/w) と渦をすぐに。RT で 10-15 分間インキュベートします。
    5. 各ウェルから 400 μ L 細胞用培地を取るし、pH を中和するために DNA PEI の混合物にそれを追加します。セルに DNA の混合物をドリブルします。
      注:DMEM には通常、酸塩基指示薬としてのフェノールレッドが含まれています。中和ステップ チューブで追加の混合物の色は黄色 (酸性) から赤 (ニュートラル) に変更します。酸性 pH でポンドで DNA 複合体の形成を与える最高のトランスフェクション利回り50が、(例えばで無血清 DMEM) pH 7.4 で直接または DNA PEI 錯体を形成できます。フォーム DNA 錯体を DMEM を使用する場合は、中和手順 1.3.5 をスキップします。いずれの場合も、それが欠かせません、血清が存在しない混合物の複合体を形成します。
  4. セル 48 時間後トランスフェクションを収穫します。
    1. 培地を吸引し、2 mL に予め温めておいた PBS (37 ° C) で一度セルをすすいでください。0.5 mM EDTA を添加した PBS の 800 μ L を追加し、37 ° C で 20 分間インキュベート外し、上下にピペッティングにより細胞を中断します。
    2. 5 mM MgCl2で 200 μ L の PBS を含む 1.5 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。
    3. 800 x g で 2 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
      注:プロトコルはここで一時停止することができます。この場合、フラッシュ-凍結液体 N2のペレット、1 か月最大-80 ° C で保存します。常に目の保護ゴーグルを着用します。
  5. 100 μ L トリスバッファーの換散を追加 (50 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl、1% トリトン X-100, 1 mM EDTA とたて追加 PMSF) 細胞ペレットにし、氷上で 30 分間加温します。渦 5 分ごと溶解しやすい。
  6. 4 ° C および 14,000 x g で 10 分間細胞の残骸をスピンダウン黒 96 ウェル プレート上澄みの 90 μ L を転送。蛍光モジュール搭載プレート リーダーを用いた EGFP と mCherry の蛍光を測定します。
    注:適切な刺激および放出フィルターを使用して、EGFP の (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) と mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm)。EGFP の測定値が通常野生型 EGFP から得られる最大値とモック トランスフェクション細胞から得られた最小値範囲に及びます。測定器で正確な測定ウィンドウの設定の世話をします。
  7. NcAA 定款の効率は、サンプルの蛍光と野生型 EGFP の発現から得られる蛍光の比率として計算されます。すべての値は、mCherry 蛍光に正規化されます。
    figure-protocol-3208

2. 遺伝的混入 ncAAs の Gpcr 光橋マッピングの GPCR リガンド相互作用のため (図 3)

  1. 10% (v/v) FBS、100 U/mL ペニシリンおよび 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストマイ DMEM HEK293T 細胞を維持します。
  2. 種細胞トランスフェクション前日。
    1. 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリプシン/PBS で 37 ° C で 5 分間細胞をデタッチします。10 cm 皿に 1 mL のトリプシン/EDTA を使用します。完全培地の 10 巻とクエンチし、上下にピペッティングにより細胞を再懸濁します。検定49を使用して懸濁液中の細胞数をカウントします。
    2. 6 ウェル プレートで 2 mL の完全培地にウェルあたり種子 5.0 x 105 293 t 細胞。各位置に上映されると、バインド コントロール33,38の配位子プラス 1 つの井戸のあたりにも 1 を準備します。野生型 (wt) 受容体と transfected に余分なもは突然変異体の発現量を確認する含まれて可能性があります。
  3. 翌日は、顕微鏡下で合流 (セルによって占有される領域) を制御します。プリンスエド ワード島を使用して 〜 70% 合流でセルを transfect します。
    1. 1 時間前、トランスフェクションからは、最終濃度 0.5 ミリメートルのすべての井戸にシュワンツを追加します。
      1. シュワンツの 0.5 M のストック溶液を準備します。6 ウェル プレートあたり 1.2 mg シュワンツにチューブの重量を量るし、15 μ L 0.5 M に溶かして水酸化ナトリウム。1.2 mL の完全培地で原液を希釈し、混合物の 200 μ L を各ウェルに追加します。
        注:すべての実験のシュワンツの新鮮な在庫ソリューションを準備します。アジ化部位は、特に基本的な pH の水溶液の半減期が短いと、AziRS には、そのまま、また劣化した形が組み込まれています。
    2. 総額ウェルあたり 2 μ g DNA を transfect: 1 μ g のプラスミドは目的の位置と 1 μ g のプラスミド シュワンツ (E2AziRS51と、同系の 4 コピー専用直交ペアのエンコーディングでタグ コドンを軸受フラグ タグ GPCR のエンコーディングサプレッサー tRNA Bst山芋)33,38。
      注:Wt 比較表現のレベルをチェックするを含むときは transfect wt 受容体のプラスミド DNA の低い金額です。に応じて GPCR、0.2 0.5 μ g のプラスミドの変異体プラスミドの 1.0 μ g として wt 受容体収量と同様レベルをエンコードします。モック (例えば空のベクター) と行方不明の DNA がいっぱい、すべての井戸で DNA の同量を transfect します。
    3. 1.3.3-1.3.5 の説明に従います。
    4. 48 時間後のトランスフェクションは、リガンドの光橋の 2.4 の段階のいずれかを進むか、2.5 を直接収穫して受容体の発現を確認するための手順に進みます。
  4. 写真-架橋配位子の。
    1. 1,000 x リガンド原液を準備します。DMSO で 100 μ M の濃度でペプチド リガンドを溶解します。
      注:リガンド濃度は、解離定数 KD GPCR リガンド相互作用に依存します。最終濃度 100 倍 KDはおすすめです。ペプチド リガンドはトリフルオロ酢酸 (TFA) の塩、分子量を計算するときに TFA の重量を考慮 (1 塩基性アミノ酸、ペプチドのあたり x TFA)。また、ペプチドは、一般的な吸放湿することを検討してください。ペプチド粉末の繰り返しの凍結を避けるため、部屋の温度に達していないそれまで決してペプチド コンテナーを開きます。
    2. 0.1 %bsa、0.01% から成る結合バッファーでリガンド原液縮尺を希釈トリトン X 100、5 mM MgCl2解離 HEPES 緩衝液 (HDB) 12.5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) を含む-塩酸 pH 7.4 では、140 mM の NaCl5 mM KCl。 シュワンツ GPCR 変異あたり 1 mL を準備します。細胞の培地をリガンド溶液 1 mL に置き換えます。室温 10 分間インキュベートします。
      注:特定の GPCR は配位子動力学と受容体の内在化のため会計にインキュベーション時間を調整します。インキュベーション時間を延長しても、架橋歩留まりは向上しません。
    3. 365 で UV 架橋剤で 20 分間サンプルを照射管の 5 x 8 W の nm と ~ セルに 5 センチの距離。ピペッティングにより細胞をデタッチし、1.5 mL の反応管にそれらを転送します。800 x g で 3 分のセルをペレットし、上澄みを廃棄します。
    4. プロテアーゼ阻害薬 (PI) 50 x の原液を 1 mL 25 mM EDTA/H2O のカクテルの錠剤を溶解します。分注 PI ソリューションを在庫し、-20 ° C で保存1:25 HDB で 50 x の在庫を希釈し、2 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します × HDB のパイ。フラッシュ-凍結液体 N2のセル。
      注:目の保護ゴーグルを着用します。この時点で、最大 1 ヶ月間、-80 ° c サンプルを格納できます。2.6 手順に進みます。
  5. 直接セルの収穫。
    1. 培地を吸引します。HDB で 0.5 ミリメートルの EDTA の 800 μ L を追加します。常温または氷の上に 10 分間インキュベートします。
    2. 上下にピペッティングにより細胞をデタッチし、1.5 mL の反応管にそれらを転送します。HDB の 5 mM MgCl2 200 μ L を追加します。800 x g で 3 分のセルをペレットし、上澄みを廃棄します。
    3. 2 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します × HDB とフラッシュの凍結液 N2のパイ。目の保護ゴーグルを着用します。
      注:この時点で、サンプルは 1 ヶ月-80 ° C で保存できます。
  6. セルの換散。
    1. 30 45 s と渦の 37 ° C の水浴中で細胞を簡単に解凍します。寒いこれからのサンプルをしてください。2,500 x g と 10 分のための 4 ° C でペレット膜は細胞質蛋白質の大部分を含む上清を破棄します。
    2. 50 mM HEPES 塩酸 pH 7.5、150 mM の NaCl、10% グリセロール, 1% トリトン X-100, 1.5 mM MgCl2、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM DTT、新たに追加された 2 倍の PI カクテルを含む 50 μ L HEPES 換散バッファーでペレットを再懸濁します。ミックス徹底的。氷と渦 5 分ごとに 30 分の細胞を溶解させます。
    3. 14,000 x g で 10 分間、4 ° C の細胞の残骸をスピンします。すぐに新鮮な反応チューブに上清を転送します。
      注:すぐに解析を続行します。Lysates は-20 ° C で保存することができます、しかし、すべて凍結融解サイクルは結果の質を損ないます。
  7. 西部のしみの分析。
    1. サンプルを準備し、3-5 μ L のライセートを取るまでにそれを埋める 7 μ L H2O を追加 2 μ L 1 M DTT と 63 mM トリス塩酸 pH 6.8, 2 %sds、10% グリセロールと 0.04 %bromphenol を含む 3 μ L 4 x サンプルバッファーの青します。37 ° C で 30 分間インキュベートします。
    2. 問題、信号強度を増加し、バンドをシャープ PNGase f deglycosylate サンプルでは、GPCR がグリコ、またはかすれたりにじんだりバンド。次のサプライヤーのプロトコル 10 μ L の総ボリュームで 3-5 μ L ライセートと deglycosylate を使用します。3 μ L 4 x サンプルバッファーを追加します。
      注:膜タンパク質が多い複数のサイトと国家の SDS-PAGE 解析の解像度の品質を損なうグリコ。しかし、deglycosylate ではない成熟した細胞表面受容体の完全にグリコの部分を評価に関係あるため反フラグ抗体を用いたシュワンツ GPCR 変異体の発現レベルの分析用試料を行います。
    3. 標準の SDS ページ経由でサンプルを解決し、PVDF 膜に伝達タンパク質のしみ。
      注意:アクリルアミドは神経毒性です。手袋、眼の保護を着用します。
    4. RT で 1 時間または一晩 4 ° c 5% TBS T 含む 20 mM トリス塩酸 ph 7.4、スキムミルクで膜をブロック 0.15 M 塩化ナトリウムおよび 0.1% Tween 20。
    5. HRP 標識二次抗体が続く反リガンド抗体を用いた膜をプローブします。TBS"T"での間を洗うシュワンツ GPCR の発現レベルを検出するプローブ商業 HRP 抗体を用いた膜 (材料の表を参照してください)。
    6. 自家製の ECL 試薬を用いた化学発光 (ECL) 反応を実行し、暗闇の中で 5 分信号を検出します。

3. 超高速 Bioorthogonal の生きている哺乳類セルの Gpcr のラベル付け

注:4 よくチェンバード coverslips にプロトコルを最適化 (ウェル エリア = 2.2 cm2)。よくサイズが異なるため、プロトコルのそれに応じてスケールが必要があります。

  1. 顕微鏡のスライドの表面塗装。無菌フードの下で全体の手順を実行します。
    1. ポリ-D-リジン臭化水素を準備 (MW = 500-550 kDa) (PDL) 50 mM ホウ酸バッファー (Ph8.5) 1 mg/mL の濃度で原液。6 ヶ月まで 4 ° C で保存します。凍結しないでください。
    2. 25 μ g/mL (作業ソリューション) の最終的な集中に滅菌超純水で原液 1:40 歯根膜を希薄化し、0.22 μ m の滅菌フィルターを通してソリューションをフィルター処理します。
      注:実用的なソリューションは、最大 3 カ月の 4 ° C で保存できます。
    3. PDL 作業ソリューションを 500 μ l 添加の顕微鏡スライドの各ウェルの底を完全にカバーします。室温で 20 分間インキュベートし、PDL 作業ソリューションを吸引します。
      注:PDL の作業ソリューションは、3 回まで使用できます。ソリューションは、再利用する必要があります、スライドに塗ったから新鮮な生殖不能の管に使用されるソリューションを転送、チューブをそれに応じてラベルします。新鮮なソリューションを使用リサイクル ソリューションを混在させないでください。
    4. リンスとも 3 x 〜 700 μ l 滅菌超純水と少なくとも 1 時間乾燥させます。
      注:正確には、PDL ソリューションの残基は、細胞に有毒、井戸を洗浄する非常に重要です。コーティング スライドを顕微鏡用直線距離または 4 ° C で最大一週間保存することができます。
  2. 10% (v/v) FBS、100 U/mL ペニシリンおよび 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストマイ DMEM HEK293T 細胞を維持します。
  3. 種細胞トランスフェクション前日。
    1. 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリプシン/PBS で 37 ° C で 5 分間細胞をデタッチします。10 cm 皿に 1 mL のトリプシン/EDTA を使用します。完全培地の 10 巻で癒す、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。検定49を使用して懸濁液中の細胞数をカウントします。
    2. 種子 1.0 x 105 HEK293T 細胞/ウェル (面積 2.2 cm ²) 600 μ L で色素が完全な DMEM を無料します。
      注:目的をイメージングのため任意の染料を含まない培地で初めから動作するように非常に便利です。染料無料 DMEM 製剤が市販されています。
  4. 脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた ~ 70% 合流でセルを transfect し、顕微鏡下で合流 (セルによって占有される領域) を制御します。
    1. 1 時間、トランスフェクション前準備 TCO の新鮮な 100 mM 原液 * 0.2 M NaOH で 15% (v/v) DMSO K。
    2. 好評につき、TCO の 3 μ l をミックス * 1 M HEPES pH 7.4 の 12 μ L と K 原液。優しく最終的な TCO の井戸にソリューションを追加 * 0.5 ミリメートルの K 濃度。
    3. 総額ウェルあたり 500 ng の DNA を準備します。微量遠心チューブに希釈 200 pcDNA3.1_CRF1R の ng-95TAG-EGFP、200 MbPylRSAF/tRNA エンコードPyl直交ペア プラスミドの ng (tRNA の 4 カセットM15) と 100 pcDNA3.1_Arrestin3 の ngプラスミド 50 μ L 中 (色素フリー、無血清、抗生物質無料)。
      注:一般に、Arrestin との共トランスフェクションは、GPCR の内面を観察する必要はありません。ただし、Arrestin3 の共同株は多くの突然変異体の内面を分析する際、非常に便利である、CRF1R の内面化をスピードアップします。
    4. 50 μ L 媒体 (色素フリー、無血清、抗生物質無料) 脂質ベースのトランスフェクション試薬 (DNA の 1 μ g あたり 2.5 μ L) の 1.25 の μ L を希釈し、DNA の混合物にソリューションを追加します。渦をすぐにし、セルに追加した DNA-リン脂質複合体で 5-10 分間加温します。
      注:我々 の経験で細胞の形態は、PEI による脂質ベースのトランスフェクション ルックスより生理に比べて細胞のトランスフェクションを transfected しました。プリンスエド ワード島は、トランスフェクション効率を与える、脂質ベースのトランスフェクションがイメージング実験のための細胞を使ってより良い選択に対しプリンスエド ワード島は西部のしみのような下流のアプリケーションに適してはずです。
  5. 24 h 後トランスフェクション ラベル蛍光色素を持つ受容体です。
    1. DMSO と DNA 染色染料原液超純粋な H2o. の 10 mg/mL に 0.5 mM 染料 tetrazine 原液を準備します。
    2. 各ウェルから 1.5 mL の反応管に 100 μ L の培地を転送します。染料 tetrazine 原液の 1.8 μ L と 0.3 μ L の DNA 染色染料原液を追加します。井戸に戻す染料を含む培地を転送し、37 ° C で 5 分間インキュベート
      注:Tetrazine オレンジ蛍光染料には、1.5 μ M の最終濃度があります。
    3. 培地を吸引し、色素の過剰な削除する PBS で 2 回細胞を優しくすすいでください。無料成長媒体を予熱した完全な色素の 600 μ L を 37 ° C に追加します。
  6. 蛍光顕微鏡と受容体の内在化。
    1. 下 63 x (または類似の) ラベルの受容体を可視化する GFP の適切なフィルターを使用して倍率 (λabs: 488 nm; λem: 509 nm)、オレンジ蛍光染料 (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) および DNA 染色染料 (λabs: 350 nm;Λem: 461 nm)。受容体を活性化する前に、各フィルターで写真を撮る。
    2. 200 を使用して受容体の内在化を促進する Ucn1 の nM。
      1. DMSO で 200 μ M の 1,000 x Ucn1 原液を準備します。
        注:ペプチドの溶解性によって純粋な水やバッファーの在庫を準備することができます。
      2. 1.5 mL の反応管の井戸から 100 μ L 中に転送し、ペプチド アゴニスト原液の 0.6 μ L を追加します。井戸に中型のバックを転送します。
      3. 顕微鏡下で内面を観察します。内面化 (受容体および Arrestins の過剰発現によって、時間に 10-15 分) が明確に検出可能な発生した後写真を撮る前に説明したフィルターを使用して。

結果

蛍光アッセイの概要は、図 1に描かれています。アッセイは、3 つのアプリケーションで採用されています。まず初めに、Pyl 直交ペアで Lys(Boc) の定款の tRNA の亜種の数は除かれます。Lys(Boc) は、アミノ酸立体 Pyl のようです。Pyl は市販、Lys(Boc)、PylRS の標準的な基板として使用されます。選別された Trna を tRNA に基づくpyl ブランド。そ?...

ディスカッション

プロトコルでは、直交ペアの ncAAs の哺乳類細胞で発現したタンパク質混入の効率を評価するためにシンプルで信頼性の高いアッセイについて説明します。FACS に基づいて広く使用されているアッセイを尊重しこの方法の主な利点は同時準備と多数のサンプルの測定を可能にしては簡単に普通のソフトウェアを使用して分析データを提供します。哺乳類細胞における直交ペアを分析する媒体ス?...

開示事項

著者を宣言する競合があります。

謝辞

この作品は CO822/2-1 (Emmy Noether プログラム) と CO822/3-1 陽性の補助金の下で、ドイツ研究振興協会 (DFG) によって設立されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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