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Method Article
ここハイドロゲルを用いた複雑な形状設計組織を生成するために使用できるカスタム ポリジメチルシロキサン金型を製造するため急速な安易なと低コスト手法を提案します。さらにこの手法を使用して生産設計された心臓ティッシュの実施される力学的および組織学的評価の結果について述べる。
組織工学の分野が成熟するにつれ組織形状を含む組織パラメーターの広い範囲で関心の高まりがあった。センチメートルのスケールにマイクロメータの組織形状を操作するで、セルの配置を直接し、効果的な機械的性質を変更し、栄養素の拡散に関連する制限に対処できます。さらに、ティッシュが用意されて容器は組織細胞とマトリックスの両方の構造に影響を与えることができますさらに応力場での機械的な制約を与えることができます。再現性の高い次元の形をした組織も、サンプルの寸法は、全体組織力学的解析など、重要なの in vitroアッセイするためのユーティリティがあります。
この原稿は、レーザー エッチングされたアクリルから調製した負のマスター金型を活用した代替製造方法をについて説明しますこれらの金型ポリジメチルシロキサン (PDMS) を発揮、センチ スケールと機能寸法とデザインを許可。25 μ m より小さいサイズし急速に設計し、作製、低コストと最小限の専門知識を持つ。最小限の時間とコストの要件は、最適なデザインを決定するまでに急速に反復処理してティッシュ エンジニア リングの分野を超えても含め関心の任意のアッセイに合わせて簡単に適応するレーザー エッチングされた金型の許可します。
過去二十年以上ソフト リソグラフィに使用されています作製技術として広く特にマイクロ流体システム、材料研究と組織工学1、2の分野で科学的な研究をサポート 3。負のマスター型から所望の形状を持つオブジェクトを作成するレプリカ成形ヒドロゲルを形鋳造用、便利で低コストの製造方法 PDMS に複製は、正を使用ことができます提供しています。ただし、必要な負マスター金型は高価な時間のかかる、サイズに制限は、微細加工技術を使用して生成される通常、クリーン ルーム空間と高度な機器を必要とします。3 D プリントは、潜在的な代替手段を提供、その有用性はやや低価格プリンターと共通の 3 D プリンターのポリマーと硬化を阻害することができます PDMS の化学相互作用の解像度制限により限られています。
大幅により少なく高価なしたがってより研究ツールを製造するためのアクセス両方を切断、プラスチック、木材、ガラス、金属などの材料をエッチングできるレーザー カッター システムは近年します。商業用等級レーザー カッターは 25 μ m より小さい最小機能を備えたセンチ スケール上のオブジェクトの加工が可能なさらに最小限のトレーニング、専門知識、および使用する時間を必要とします。PDMS のアブレーションは、マイクロ流体デバイスの作製で以前使用されています、一方我々 の知識に原稿がプロセスを説明ないレーザー切断された否定的なマスター金型4 からミリとセンチ スケール金型を加工できます。.
栄養素の拡散、細胞の配置、および機械的性質5,6,7を向上させるために設計された組織の形状を操作する主にこのテクニックを使いました。ただし、この手法の汎用性は、成形ゲルが薬剤配達および材料科学研究8など、関心のある任意のフィールドで利用できます。レーザー カッターへのアクセス、PDMS 金型複製はほぼすべてジオメトリの場合 (つまり、本稿の範囲を超えているマルチパート金型なしの除去を阻害するだろう) のオーバー ハングせず作ることができるレーザーのベッドの寸法内に収まる。
1. ベクトル形式マスター金型設計を作成します。
2. レーザー カット アクリル マスター金型
3. セルまたはティッシュ文化の PDMS 金型を準備します。
4. キャストのコラーゲンとフィブリン ハイドロゲル組織
注: は、無菌性を維持するために無菌の適切な手順を使用します。
5. 解析手法: 組織の圧縮
注: 圧縮マトリックス改造に起因は組織の生存率と光学顕微鏡と画像解析を簡単に測定することができます開発の指標です。
6. 解析手法: 引張試験
注: 両方のアクティブな力学 (力または細胞の活動のために設計された組織によって生成される系統) 受動的力学 (力または応用系統または力に応答して生成された系統) が設計された多くの重要な機能特性を組織とこれは特に設計された心臓ティッシュに当てはまります。分析用マイクロメカニカル アナライザーは、材料表の説明です。彼らは、水和テストのため長制御機能がるし、張力範囲と解像度の測定を組織に関連すると仮定すると、他の機械式試験装置を同様に適用でした。5 mN のロードセルは、単一の平方ミリメートル程度の断面積と kPa 万程度の剛性と組織、良いフィット感です。大きくより堅い材料は大きな負荷セルを必要があります。試験前に, 合力トランスデューサーならびに長さコント ローラーの両方に適切に校正されてを確認します。
7. 解析手法: パラフィン組織および免疫組織化学
注: 組織形態は、最高の保存状態、パラフィン ブロックを使用して設計されたティッシュ セクションをイメージングで偉大な成功を収めています。プロセスのすべての手順を慎重に検討および真空または圧力なしのサンプルを処理、経験的適切な抗原検索方法の決定および一次抗体を滴定を含むエンジニア リング組織に合わせた必要濃度。スライドを準備するための冷凍ブロックを使用するなど、他の手法は、目的のアプリケーションに応じて十分な結果を生成しながら以下の時間と費用を必要があります。
8. 解析手法: セルの配置
注: セルの配置は、多くのネイティブの組織の定義機能を調節することが組織の形状と内部応力場を操作します。
レーザー カッターの光学系エッチング深さの増加と寸法は非常にわずかに減少するエッチング エリアとレーザー ビームの先を細くための結果金型の非常に微妙な傾斜が付いている壁。これはキャスト PDMS カビの除去を容易にするのに役立ちますが、負のマスター型を非常に深くエッチングする場合慎重に検討する必要があります (> 6 mm) が必須です (?...
組織培養と互換性のあるカスタムの PDMS 金型形状はあるセルの配置、拡散率、有効剛性などの重要なエンジニア リング組織プロパティをチューニングするための素晴らしいユーティリティです。さらに、これらの金型、ジオメトリは機械的テスト16,17など、重要な分析アプリケーションの組織を準備するため非常に便利です。否定的なマスター金?...
著者が明らかに何もありません。
著者は NIH R00 HL115123 とブラウン大学工学部からの資金を認めます。彼らは訓練のためブラウン デザイン ワーク ショップおよびクリス牛に感謝しています、レーザー カッターでサポートします。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Item | |||
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
Software | |||
Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
Equipment | |||
PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
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