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要約

我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ ラストの大量の準備のためシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。

要約

大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) は重要な作物を遺伝学的、生化学的経路の研究マメ科のモデルとなっています。そのため、大豆の効率的な一過的遺伝子発現系を確立することが重要です。ダイズプロトプ ラストの準備のための単純なプロトコルと非定常の機能解析への応用を報告します。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉が高品質のプロトプ ラストの大量に起因したと分かった。ペグ カルシウム仲介された変形方法を最適化することにより、大豆含むプロトプ ラストを用いた高い変換効率を達成しました。このシステムは、ライブ ダイズ細胞における複雑な規制とシグナル伝達メカニズムの検討の効率的かつ汎用性の高いモデルを提供し、ヘルプは、マメ科植物の多様な細胞・発達・生理学的なプロセスを理解するかもしれない。

概要

プロトプ ラストは、削除される細胞壁を持つ植物細胞です。機能のほとんどは、植物細胞の活動を管理するのでプロトプ ラスト観察・多様な携帯電話イベントを評価する良いモデル系、1体の交配を研究し、植物の再生2する貴重なツールです。プロトプ ラストは、細胞壁がブロックされセルに DNA の通過以来工場変換3,4、5、また広く利用されています。プロトプ ラストは生理学的な応答のいくつか、したがって細胞内タンパク質局在6,7、8を研究する基礎研究の基本的な値を提供して、そのまま植物の細胞プロセスを所有しています。蛋白質蛋白質の相互作用の9,10、プロモーター活動11,12,13ではセルを住んでいます。

196014で最初に報告された植物プロトプ ラストの分離と分離とプロトプ ラストの変形のためのプロトコルを開発し、最適化します。葉の切断と非消化組織破片からリリースされた原形質体の分離に続いて、細胞壁の酵素消化、原形質体の隔離の標準的な手順が含まれます。エレクトロポレーション15,16、マイクロインジェクション17,18、およびポリエチレング リコール (PEG)4,5,19手法変革戦略が含まれています。種の広い範囲は、原形質体の隔離、柑橘類20、アブラナ科21、ナス科22その他の観賞用植物家族23,24を含む成功報告されています。モデル植物シロイヌナズナの葉から分離したシロイヌナズナ葉肉プロトプ ラスト (TEAMP) に一過性発現系が確立した25をされている様々 な種では、多様な組織型が使用されて、多様なアプリケーションに広く採用されています。

大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) 最も重要なタンパク質の 1 つで、油作物26。異なり、シロイヌナズナイネ、遺伝子組み換え大豆の植物を得ることはむしろ困難と低効率に知られています。アグロバクテリウム-仲介された浸潤一般に使用されているタバコ27で表皮細胞およびシロイヌナズナ28,29, 苗の一時的な遺伝子発現研究に対しサツマイモネコブセンチュウは大豆30植物毛状根の変形のために使用されています。ウイルス誘導性遺伝子のサイレンシング アプローチは、ターゲット遺伝子の31,32と過渡式の33のダウンレギュレーションを系統的に利用されています。プロトプ ラストは、貴重な汎用性の高いこれらのアプローチ方法を提供します。プロトプ ラストは大豆の地上材料から得ることが、発現の迅速かつ同期ができます。しかし、1983年34ダイズプロトプ ラストの最初の成功した分離以来報告されている限られた大豆35,36,37,プロトプ ラストの応用38、主にダイズプロトプ ラストの比較的低い収穫のため。

ここでは、ダイズプロトプ ラストの分離のためのシンプルで効率的なプロトコルと一時的な遺伝子発現研究への応用について述べる。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉を使用すると、数時間以内の重要なプロトプ ラストの大量を取得することができました。さらに、ペグによるカルシウムの変換法はシンプルで高効率で大豆プロトプ ラストに DNA を提供する低コストを最適化しています。

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プロトコル

1. 植物の成長

  1. 大豆の 5-10 ダイズ種子 (ウィリアムズ 82) 長日条件 (16 h 1,500 µmol m-2の-1光) カスタム土壌ミックスの 25 ° c の下で温室で 13 cm ポットに種をまく (、1: 土、パーライト、魚雷の砂の比率 1:1)。

2. DNA のプラスミッドの準備

  1. 滅菌ピペット チップやつまようじを使用すると、単一コロニーを大腸菌興味の遺伝子を含んでいるプラスミッドを運ぶ冷凍グリセロール ストックを選ぶし、20 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) 液体培地 50 mL のフラスコに適切な抗生物質で予防接種します。
  2. シェーカーで一晩 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。5 分間室温で 12,000 × g の懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して細菌を収集します。抽出・精製プラスミド プラスミド準備キットの製造元の手順を実行します。

3. プロトプ ラスト単離

  1. 10 日間の古い大豆苗 (図 1) から新しく拡張された単葉の葉をカットします。
    注: 適切な発達段階で葉の選択は大豆プロトプ ラスト調製成功への鍵です。初期の発達段階で展開直後の葉だけ使用します。成熟した葉、消化する細胞壁と難しくなってください。
  2. 新鮮なかみそりの刃を含む葉と 0.5-1 に残る mm ストリップ、カットから主脈を削除します。
    注: 2 つの単葉の葉 10 mL の酵素液で消化は以上 10 変換のため十分なプロトプ ラストを与えます。
  3. 葉が 10 mL を 15 mL チューブに作りたての酵素液 (表 1) にすぐにそして軽くをストリップ鉗子、転送のペアを使用しています。真空潜入葉ストリップ部屋の温度で 15 分。
  4. 室温で 4-6 h の低照度下で穏やかな攪拌 (40 回転) と酵素液で葉の細片を孵化させなさい。プロトプ ラストがリリースされると、酵素液が黄色緑を回すことを確認します。(X10) 顕微鏡下で酵素/プロトプ ラスト ソリューションを確認してください。
    注: リリースのプロトプ ラストは球状形、未消化の細胞が不規則なまたは楕円形です。
  5. そっとして 50 mL のチューブで酵素/プロトプ ラスト溶液 10 mL を転送し、消化を停止するために室温 W5 溶液 (表 1) 10 mL を追加します。穏やかに数回チューブを反転します。未消化の葉身を削除する 50 mL のチューブの上に置かれたきれいな 75 μ m ナイロン メッシュに酵素/プロトプ ラストの溶液を注ぐ穏やか。
  6. 室温で 1-2 分の 50 mL のチューブで 100 x g でプロトプ ラスト酵素/フロースルー ソリューションを遠心します。プロトプ ラストのペレットを乱すことがなく 10 mL の血清ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。
  7. プロトプ ラストを再懸濁し、プロトプ ラスト (x10) 顕微鏡で血球の数を数えることによって 2 x 105 mL-1 4 ° C に冷やした W5 ソリューションでの濃度に希釈します。30 分間氷の上プロトプ ラストをしてください。
  8. 室温で 1-2 分の 100 x グラムの懸濁液を遠心し、原形質体の餌を乱すことがなく 1 mL ピペットを使用した W5 ソリューションを慎重に取り外します。室温で 2 x 105 mL-1濃度で MMG 解決方法 (表 1) プロトプ ラストを再懸濁します。

4. プロトプ ラスト

  1. プロトプ ラスト (2 x 104プロトプ ラスト 2 x 105 mL-1) の 100 μ 因数は 1.5 mL 低接着マイクロ遠心チューブ用ノーカット 200 μ L ピペット チップを使用してします。ネガティブ コントロールとして機能する 1 つの因数脇を置きます。プロトプ ラストの残りの因数のそれぞれにプラスミド (10-20 μ g) の 10 μ L を追加します。
  2. ゆっくり 1.5 mL 遠心チューブの内壁に作りたての止め釘の解決 (表 1) の 110 μ L を追加し、軽く反転ソリューションが均質になるまでチューブを回転させてください。
  3. 15 分間室温で変換の混合物を孵化させなさい。
  4. 変換を停止するには、ゆっくりと室温で 1.5 mL チューブに W5 ソリューションの 400 μ L を追加し、ソリューションが均一になるまでやさしくチューブを転倒させます。室温で 1-2 分の 100 g でチューブを遠心分離、ピペットを使用して上澄みを廃棄します。
  5. チューブに無線ソリューション (表 1) の 1 つの mL を追加し、1-2 回を軽くピペッティングによって再懸濁します。表面をコートし、プロトプ ラストが板にくっつかないように 6 ウェル培養プレートの各ウェルに 5% (巻/巻) 滅菌子牛血清 1 mL を追加します。
  6. 数秒後、ピペットを使用して子牛血清を破棄します。再懸濁のプロトプ ラスト培養プレートのウェルに移転します。蓋付きプレートをカバーします。

5. プロトプ ラストの培養と収穫

  1. 暗闇の中で 1-2 日間室温でプロトプ ラストを孵化させなさい。
    注: 1 日培養に比べて一般に強い蛍光蛋白質信号を 2 日間培養に利回りし、蛍光蛋白質信号が 3-4 日間続く可能性がありますがわかった。
  2. プロトプ ラストのソリューションを 1.5 mL の低接着微量遠心チューブに転送します。プロトプ ラストを収穫するために室温で 1-2 分の 100 x g でチューブを遠心します。ピペットを使用して上清を除去し、スライド ガラスに 10 μ L プロトプ ラストを転送します。
  3. 蛍光共焦点顕微鏡又は蛍光信号を観察します。(信号を守らなければなりませんない) 陰性対照として非変形プロトプ ラストを使用します。

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結果

プロトプ ラストの調製 (図 1) を 10 日間の古い大豆のさまざまな器官を調べた (図 2) 顕微鏡下では認められなかった.胚軸, 上胚軸から細胞壁がほとんど消化して、そしていくつかの細胞 (図 2 b, 2 C) 互いに接続されています。子葉 (図 2 D) とルート (図 ...

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ディスカッション

ダイズプロトプと一過性発現研究への応用の分離のこのプロトコルは徹底的にテストされており、当研究室では非常にうまきます。手順はシンプルで簡単な一般的な機器を最小コストを必要とされます。我々 のプロトコルは、以前に報告された方法34,35,36,37,38に比べて?...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、全米科学財団 (NSF-PGRP IOS-1339388) から植物ゲノム研究プログラムによって支えられました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
nylon meshcarolina652222N
Tissue Culture PlatesUSA ScientificCC7682-7506
Razor BladesFisher12-640
hemacytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA plasmid miniprep kitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Centrifuge 5810eppendorf5811000827
Centrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet ControllerJencons14526-202
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeissN/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450
15 mL Centrifuge TubesDenvilleC1018-P
50 mL Centrifuge TubesDenvilleC1060-P
Newborn Calf SerumThermo Scientific16010159
SoilIngram's Nursery
perliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)FisherBP1427-500

参考文献

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