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要約

緑膿菌感染症は、脆弱なホストで重大な合併症を引き起こします。膿ひずみ PA14、PA14NR を設定すると、指定の非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリー多数プロセスの遺伝子機能の解析が容易になります。ここに提示 PA14NR セット変異ライブラリーの高品質のコピーを生成するためのプロトコルです。

要約

緑膿菌は、人間環境のユビキタス多様な表現型と際と適応性グラム陰性菌です。膿はバイオ フィルムを形成、抗生物質耐性、病原性因子を生成、慢性感染の過程で急速に進化することができます。したがって膿が両方急性と慢性、感染症を治療することは困難特定の患者集団で重大な合併症の結果として行われます。膿株 PA14 はさまざまな PA14 この病原体を研究するための魅力的なひずみを作る哺乳類と nonvertebrate のホストに感染する保存されたゲノム構造をもつ人間の臨床分離株です。2006 年、4,596 予測 PA14 遺伝子に対応する 5,459 変異体を含む非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリが生成されました。それ以来、PA14 ライブラリの配布は、個々 の遺伝子の機能と緑膿菌の複雑な経路を理解する研究コミュニティを許可しています。レプリケーション プロセスによるライブラリの完全性の維持には、適切な処理と正確な技術が必要です。そのために、この原稿はライブラリのレプリケーション、ライブラリの品質管理および個々 の突然変異体の適切なストレージに関連する手順の詳細を記述するプロトコルを示します。

概要

緑膿菌は、多様な表現型と際と適応性グラム陰性菌で土壌、水、最も人間環境と皮膚の細菌叢に存在です。膿は、5.5-7 Mbp 高 G + c コンテンツ (65 〜 67%) の比較的大規模なゲノム多くの菌種に比べると。さらに、その遺伝子の大部分は代謝適応性に関与しているし、環境ストレス1への応答に大きな柔軟性を可能にする規制のネットワークの一部であります。膿病原因子の茄多を表現、フォーム バイオ フィルムに性癖を展示、複数クオラムセンシングで経路を介して応答を調整する能力を持って、抗生物質耐性を開発する顕著な容量が表示されます。許容値2,3,4,5,6,7,8。これらの属性は、膿によって引き起こされる感染症を治療するための重要な課題を提示します。

慢性的な膿菌感染は多くの病気の状態で発生することが。嚢胞性線維症 (CF)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝病の結果、気道内で濃縮、感染した分泌物進歩的な気管支拡張症と、最終的には、死呼吸不全9。成人では、CF の患者の大半慢性膿、罹患率と死亡率のこの疾患10に関連付けられている重要な役割を果たしていると感染しています。さらに、重症熱傷の傷害11、気管切開12、関節置換術13、または留置カテーテル14患者フォームする細菌の能力に関連するp. 緑膿菌感染のリスクがバイオ フィルムとエスケープ ホスト炎症反応15。多抗生物質耐性や寛容の人口は広域スペクトル、連続的抗菌薬治療12,16,17によって選択後に、植民地化の競争がなければを発生するさらに、,18.膿の病態の理解を深めるお越しの数多くの病気の状態に大きな影響を与えます。

PAO1、PA103、PA14、朴セリは、系統を含む、 P. 緑膿菌臨床分離株が盛ん膿病因のさまざまな機能を調査します。ひずみ PA14 は臨床分離株はない広範囲継研究室で最も一般的なクローンのグループ世界19,20の 1 つに属しています。PA14is 顕著なエンドトキシンによる感染症の脊椎動物モデルにおける高度病原性プロファイル21、線毛構造22、病原性島23、タイプ III の分泌システム (TTSS)、哺乳類への毒性細胞24と抗生物質抵抗性と永続性25のプロファイル。さらに、PA14 はまた多数の宿主-病原体モデル システムにおける高度病原性植物葉を含む浸潤モデル26,27,線虫感染モデル28, 29昆虫モデル30,31, と同様にマウス肺炎モデル32,33皮の焼跡モデル34。

ゲノム変異ライブラリ不要な遺伝子ゲノム規模での遺伝子機能の分析により有機体の生物学を理解するための非常に強力なツールを構成する同質遺伝子変異体のコレクションです。膿に建設された 2 つの飽和近くトランスポゾン挿入変異ライブラリは現在配布です。トランスポゾンの挿入サイトは、両方のライブラリの決定されています。これらのいわゆる非冗長ライブラリ時間がかなり短縮されて細菌菌株のゲノム研究を容易にし、コストに関わるスクリーニング, ランダムなトランスポゾン変異体。膿の PAO1 トランスポゾン変異ライブラリー、MPAO1 に建設された分離はトランスポゾンを用いた歪み PAO1phoA/ほら、lacZ/ほら35がワシントン大学の Manoil 研究室によってキュレーションです。ライブラリのコレクションで構成、シーケンス確認 9,437 トランスポゾン変異体のゲノム広いカバレッジを提供し、ほとんどの遺伝子36の 2 つの突然変異体が含まれています。膿PAO1 トランスポゾン変異ライブラリーに関する情報が http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm で公共のインターネットにアクセスできる Manoil ラボのウェブサイトでご利用いただけます。膿ひずみ PA14 非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリー (PA14NR セット) トランスポゾンMAR2xT7テネシー州phoAを用いた歪み PA1437に建設された現在の配布は小児科学マサチューセッツ総合病院。PA14NR 設定には、不要な遺伝子37単一トランスポゾン挿入 5,800 以上の突然変異体のコレクションが装備されています。PA14NR 設定の構成の詳細については、PA14NR の使用を促進するオンライン検索ツールのさまざまなを含む公共のインターネットからアクセスできるサイト http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB のとおり設定します。

オリジナル PA14NR セット約 34,000 ランダム トランスポゾン挿入変異体の 4,596 予測 PA14 遺伝子すべて予測 PA14 遺伝子37の 77% を表すに対応する包括的なライブラリから選択された 5,459 変異株で構成されます。新しい突然変異体が追加された 2006 年に図書館の建設以来、現在約 4,600 PA14 遺伝子を表す 5,800 以上の変異体38含まれている PA14NR の設定。PA14 トランスポゾン変異体の大半は、野生型背景37に生成されました。遺伝的背景など、変異ライブラリーの各メンバーに関する詳細については、オンライン データベースを検索または非冗長ライブラリ スプレッドシート PA14 ウェブサイト (http:// で利用できる両方の機能をダウンロードすることによりpa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi)。突然変異体の大部分は、MAR2xT7 を使用して作成された (MrT7) トランスポゾンが TnPhoA (phoA) トランスポゾン37を使用して作成された小さなセット。各トランスポゾンが抗生物質耐性カセット、ゲンタマイシン (MrT7) またはカナマイシン (phoA) を使用して突然変異体の選択を可能にします。突然変異体の PA14NR セット 63-96-ウェル プレートに格納され、2 つの追加の 96 ウェル制御プレート、野生型 PA14 から成っている接種が含まれています、プリセット パターンに挟在非接種の井戸。オンライン検索ツールとペアに大きく 96 ウェル プレート形式は、スクリーニング アッセイ突然変異体の表現型に関わる遺伝子を簡単に識別できるのカスタム開発を促進します。オンライン検索ツールには、検索してさらに研究に必要な追加の関連する変異体の選択も容易します。

PA14 と PAO1 トランスポゾン変異ライブラリは科学的なコミュニティのための非常に重要なグローバル リソースであり、彼らは未知の遺伝子の機能とこの細菌の病原体の経路を検証する際にお互いを補完します。偶然にも、PAO1 と PA14 トランスポゾン変異ライブラリの構築、以来多くの緑膿菌の全ゲノム DNA シーケンス解析を示している PAO1 と PA14 P. aeruginosa の別の主要なサブクレードに属しています。系統7,39,40,41。臨床緑膿菌株が発見されてサブグループ系統、PAO1 と PA14 異なる膿に属している事実全体に分散比較 2 トランスポゾン変異ライブラリーの価値の向上研究。

文書構造を記述して膿ライブラリ35,を含む細菌の突然変異体ライブラリのスクリーニング3742,,、文献で容易に利用できます。しかし、我々 の知識の限りで公開プロトコルの詳細な手順と、レプリケーションに使用される技術を記述する保守、および細菌変異ライブラリの検証がありません。

この文書に記載されている方法では、使用を容易にする 3 つのプロトコルのセットと PA14NR セットのメンテナンスについて説明します。最初のプロトコルでは、PA14NR 設定の受信者にお勧めのライブラリのレプリケーションについて説明します。2 番目のプロトコルには、ストリー キング、成長、および PA14NR のセットを使用して識別される個々 の変異体を格納するためのガイドラインが含まれています。3 番目のプロトコルでは、トランスポゾン変異体からの断片の PCR の拡大や突然変異体の身元を確認するそれに続くシーケンスなど、品質管理手法について説明します。この一連のプロトコルは、レプリケーションおよび他の細菌の突然変異体のライブラリやコレクションの維持の適応もあります。細菌変異ライブラリやコレクションのレプリケーションは「マスター コピー」の整合性を維持するために非常にお勧め (原本を受け取った)。ルーチン検査用 PA14NR セットの複数のコピーのレプリケーションでは、マスター コピーの間の汚染の可能性を最小限に抑えます。

プロトコル

注意: は、膿、人間の病原体を処理するときに標準 BSL-2 安全対策を利用します。免疫障害を持つ個人は、または、細菌感染するあなたの感受性を高めるすべての病状、 Pで作業するとき特別な注意してください。緑膿菌。あなたの施設におけるバイオ セーフティ オフィスに相談し、使用前に主治医の承認を得る、PA14 NR 設定や病原性細菌の突然変異体のライブラリ。

figure-protocol-283
図 1: PA14NR のプロトコル i: レプリケーションの概要を設定します。1 日目: LB 寒天培地上に PA14NR 設定の「マスター コピー」から冷凍の突然変異体の文化を複製し、37 ° C で一晩変異体の成長2 日目: 深いよくブロック LB 液体スープを含む LB 寒天培地上から突然変異体の成長に転送、950 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩成長します。3 日目: グリセロール、混ぜて一晩 LB 文化し、長期保存のための 96 ウェル先プレートに転送します。フラット-80 ° C のフリーザーの場所 96年ウェル プレート。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: セットアップをお勧めします。適切な予防措置を使用して不妊とスムーズなワークフローを維持しなければなりません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

1. プロトコル i:、PA14NR のレプリケーション設定

注: 16 板の各 4 週連続で処理することができます 4 つのサブセットに PA14NR 設定で割ってライブラリのレプリケーションを実現できます。6 に 1 コピーの世代は世代以上 6 枚の表 2 に毎週ワークフローに従います、表 1 に記載されている毎週のワークフローに準拠しています。PA14NR セットの 12 のコピーを生成するため液体の LB 媒体 2 日目に同じ PA14NR サブセットを接種して再び (寒天の 1 日目の複製の同じセット) から日 3 と転送で一晩変異文化 3 日目と 4 日目のコピー板にそれぞれ。

0 日目日 1日 2日 3
準備日PA14NR セット LB 寒天培地上の突然変異体の成長PA14NR セット液体 LB 媒体の突然変異体の成長行先プレートへの突然変異体文化の PA14NR の設定の転送

表 1: PA14NR セットの 1-6 コピーのレプリケーションのスケジュール。少部数の複製は、毎週のワークフローに従う可能性があります。

0 日目日 1日 2日 3日 4
準備日LB 寒天培地の PA14NR 設定突然変異体の成長LB 液体培地における PA14NR セット変異体の成長します。PA14NR セットの 6 枚の 1 セットを生成する日 3 突然変異体文化の伝達PA14NR セットの 6 枚の第 2 セットを生成する日 4 変異文化の伝達
PA14NR セット液体 LB 媒体の突然変異体の成長

表 2: PA14NR セットのコピーを最大 12 個のレプリケーションのスケジュール。レプリケーション コピーの大きい数の毎週のワークフロー内での階層化が必要になります。

  1. 1 日目: PA14NR 設定マスター コピー LB 寒天培地プレート上の成長
    1. 手袋、白衣、PA14NR 設定を処理するためのマスクを着用します。
    2. ベンチをオフにし、70% エタノールで表面をふきます。
    3. LB 寒天培地メディア43を準備し、オートクレーブで滅菌 25 分クールなメディア 55 ° C の水でお風呂し、Tnを含む突然変異MAR2xT7トランスポゾンの挿入、または 200 μ G/ml カナマイシンを含む変異体のいずれかの 15 μ G/ml のゲンタマイシンを追加 phoA挿入。
    4. プレートごとメディアの約 60 mL を使用して長方形の板の溶融 LB 寒天を注ぐ。約 1 時間前に無菌フードのドライ プレートを使用します。寒天の表面に結露がないことを確認します。必要に応じて、4 ° C でプレートを格納します。
    5. エタノール ワイプ ベンチ上ブンゼン バーナーで滅菌フィールドを作成し、レプリケーター ピン殺菌のための適切なソリューションを持つコンテナーを設定 (手順 1.1.9 参照)。使用を開くプラスチック容器 (5.25"L x 4.25"x 1.75"H 近似サイズ W) レプリケーター ピン殺菌のため。オートクレーブ使用前にプラスチック製の容器。
      注: ブンゼン バーナーの炎の熱は、熱対流現在、炎の上のスペースを加熱し、滅菌作業領域を維持する、下の冷たい空気から空気中の微粒子を持ち上げるを作成します。
    6. (不要な融解を避けるため) に-80 ° C のフリーザーから最大 4 つの PA14NR の設定のマスター プレートを外し、4 L 氷パンでドライアイスの上に置きます。
    7. 時間がかかるだけドライアイスからレプリケートし、簡単な解凍を許可し、ベンチにマスター 96 ウェルのプレートにレプリケーターのピン (約 3-4 分) (手順 1.1.8 参照) の殺菌に必要です。プレス前に寒天培地プレート上の座標を A1 の位置をマークします。マスター プレートと A1 座標は、左上隅の両方のプレートの寒天プレートに合わせます。
    8. 以下の手順で「ピン」レプリケーターを滅菌します。余分な液体を削除する各手順の後少しレプリケーターをタップします。
      1. 0.3 0.5 の 250 mL のピンを浸す % 亜塩素酸ナトリウム (10% 世帯の漂白剤) を 30 秒間。それはピンの損傷につながる可能性としては、ナトリウム次亜塩素酸のソリューションとの接触を最小限に抑えます。250 mL 滅菌 ddH2O のピンを浸すか、10 秒、30 秒、250 mL 70% エタノールでし 2 分の 95% エタノール 250 mL に滅菌超純水。
      2. 火炎滅菌レプリケーター ピン ブンゼン バーナーの炎にレプリケーターを垂直に保持し、エタノールに火をつける、まで炎にゆっくりと近づいてすぐに炎から撤退します。炎を一度すべてエタノール火傷を消すでしょう。近くに維持蓋または類似のコンテナー燃焼エタノールを窒息するため必要な場合。
        注: は、エタノール炎の近くで作業するときに細心の注意を使用します。炎の上に直接レプリケーターを保持しません。
      3. 30 秒の LB 寒天を含む未使用滅菌平板上に固定することでクールなピン。
    9. 簡単に暖かいアルミ シール PA14NR 設定マスターからあなたの手でプレートを剥離する前に。レプリケーター ピンを冷却しながらこれを行います。アルミ プレートをレタッチからシールを防ぐために慎重にシールを削除します。アルミシールの残党をはがすピンセットを使用します。
    10. 静かに押し下げて、マスター プレートとピンのように、すべての 4 方向にスイングのレプリケーターにレプリケーターのピンを挿入それぞれ 96 ウェルの冷凍の細菌文化との接触。プレートの端に位置する井戸で冷凍の文化に対して replicator ピンを押すことにより、プレートの外側のエッジにある井戸に余分な注意を払います。
    11. ゆっくりレプリケーター寒天プレートの表面上にピンを配置します。それぞれの変異株の約 4 〜 5 mm のフォーム ミニ芝生にわずかな円運動にレプリケーターを移動します。交差汚染を避けるために、ミニ芝生が重なる可能性があります可能性を避けてください。
    12. 新しい滅菌アルミシールと PA14NR 設定のマスター プレートをシールします。汚染を避けるために任意の時点でアルミのシールの粘着面に手を触れないでください。プレート ローラーを使用して、各ウェルとプレートのエッジが完全に密封されることを確認します。ドライアイスに戻り 96年ウェル プレート。
    13. 各マスター プレートに対して手順を繰り返します。
    14. PA14NR セットを処理した後、70% エタノールですべての作業面を拭きます。
    15. 転送は 37 ° C の定温器に寒天をレプリケートされ、一晩インキュベートします。
  2. 2 日目: 流体培養基 LB 液体で PA14NR 設定マスター コピーの成長
    1. テネシー州phoAの挿入を含む突然変異MAR2xT7トランスポゾンの挿入、または 200 μ G/ml カナマイシンを含む変異体のいずれかの 15 μ G/ml のゲンタマイシンを含む LB 液体スープ43を準備します。
    2. 不要な機器の層流フードをオフにして作業を開始する前に 10 分以上のフード送風機を入れます。フード面と 70% のエタノールを使用してフードに配置されたすべてのアイテムを拭きます。
    3. 層流フードの 50-1200 μ L 12 チャネル電子ピペットを使用して適切な抗生物質を含む LB 液体スープの 525 μ L で 2 mL ディープ ウェル ブロックを入力します。その後、エタノール ワイプ ベンチ トップへメディアいっぱいディープ ウェル ブロックを転送します。ヒントは、無菌状態が維持される限り、再利用します。
    4. PA14NR の設定を処理するためのマスク、白衣、手袋を着用します。
    5. ベンチをオフにし、70% エタノールで表面をふきます。
    6. ベンチの上に一晩成長変異株と寒天をもたらします。
    7. エタノール ワイプ ベンチ上ブンゼン バーナーで滅菌フィールドを作成し、レプリケーター ピン殺菌のための適切なソリューションを持つコンテナーを設定 (次の手順を参照してください)。
    8. 下記手順に従ってレプリケーター「ピン」を殺菌します。余分な液体を削除する各浸漬後少しレプリケーターをタップします。
      1. 0.3 0.5 の 250 mL のピンを浸す % ナトリウム次亜塩素酸を 30 秒間。それはピンの損傷につながる可能性としては、次亜塩素酸ナトリウム溶液でレプリケーターの端子に接触を最小限に抑えます。没頭する 250 mL 滅菌 ddH2O のピンまたは純水を 10 秒間、その後の 30 秒間 70% のエタノール 250 mL にし、2 分の 95% エタノール 250 mL に。
      2. 炎は、30 秒の LB 寒天を含む未使用の長方形の板に固定して、レプリケーターのピン、そしてクールなピンを滅菌します。
        メモ: エタノール炎の近くで作業するときに細心の注意を使用して (1.1.8 を参照)。
    9. 優しくレプリケーター変異体成長とピンが寒天プレート上 96 変異体すべてと接触していることを確認を含む寒天培地プレート上にピンを配置し、流体培養基 LB 液体を含む深い井戸にピンが水没します。ピンと井戸の側面に触れることを避けてください。
    10. シール滅菌通気性封止膜をディープ ウェル ブロック。各個人もが正しく密封されるようにプレート ローラーを使用します。
    11. 寒天培地ごとに手順を繰り返します。
    12. PA14NR セットを処理した後、70% エタノールですべての作業面を拭きます。
    13. ハイスピード シェーカーを使用して利用可能な 950 rpm で 37 ° C で 15-16 h のため接種の液体文化を育てます。
      注: 高速シェーカーを使用できない場合 250 300 rpm でシェーカーでディープ ウェル ブロックの孵化は可能。しかし、小さなコロニー亜種 (Scv)25低酸素条件下で新興の大きなチャンスがあります。したがって、シェーカーの低い速度でディープ ウェル ブロックに文化が成長して 15-16 h 下回インキュベーションを保つために非常にお勧めです。ライブラリを使用して遺伝子スクリーニングを行う場合、変異井戸の Scv の不要な増殖は突然変異体の表現型を変更できます。
      PA14NR の設定で特定の井戸成長/非-成長の遅い変異体のクローン、不足しているまたは非接種のメディアを含みます。これらの井戸の場所は記録されている、この文書に含まれている井戸情報の設定補足 PA14NR ファイルで見つけることができます。
  3. 3 日目: 行先プレートに伝一晩文化の PA14NR の設定
    1. 層流フードをオフにして作業を開始する前に 10 分以上のフード送風機を入れます。フード面と 70% のエタノールを使用してフードに配置されたすべてのアイテムを拭きます。
    2. 接着防水ラベルを印刷 (補足 PA14NR 設定ラベル テンプレートのファイルを参照してください)。プラスチックから削除 96年ウェル プレートは、層流フードの内部ラップします。はがしプレート ラベルし、行先プレートの H1 の井戸に A1 に近いプレートの端に沿ってそれを置きます。わずかに行先プレートの蓋を持ち上げ、板は蓋で覆われているときにラベルを表示する下の端にラベルを配置します。
    3. 60% グリセロール (v/v) の 3.5 L を準備し、20 分のオートクレーブで滅菌します。
    4. PA14NR の設定を処理するためのマスク、白衣、手袋を着用します。ハイスピード シェーカーや正規シェーカーからディープ ウェル ブロックを削除します。
    5. 滅菌の層流フードにディープ ウェル ブロックを転送し、通気性の封止膜を慎重に取り外します。アルミシールで置き換えます。スピンダウン結露を収集する非常に低い速度でディープ ウェル ブロック (50-150 x g で 30 秒、減速 quicky 遠心ブレーキを持っていることによって)。
    6. ディープ ウェル ブロックを無菌フードと 50-1200 μ L 12 チャネル電子ピペットを使用してに転送し、滅菌フィルターのヒントは、各ウェルにグリセロール/LB 液体スープ ミックス (等しい部品 LB 液体スープと 60% グリセロールの解決) の 525 μ L を追加します。軽くピペッティング 300 μ L を上下 3 回電子ピペットとミックスします。滴下を防止するヒントを取り出す前に井戸の側にヒントをタップします。ヒントを取り出し、ディープ ウェル ブロック全体を完了するまで、次の行に進みます。
    7. 早かった時などの汚染を防ぐために 12 チャンネル電子繰り返しピペットとフィルターのヒントを使用して、突然変異体の文化の 900 μ L を引いて、ライブラリ プレートの 6 のコピーを生成する各 96 ウェル先プレートに 150 μ L を分注します。行先プレートへの文化の移動を開始する前にヒントと井戸の壁に触れることにより点滴を防止します。繰り返しピペットが使用できない場合は、150 μ L を滴下を防止する上記の方法を使用して六つの 96 ウェル プレートのそれぞれに分配するマルチ チャンネル ピペットを使用します。
    8. 滅菌アルミのシールを使用して、カバー、プレート、および完全にシール プレート エッジとすべての井戸にプレート ローラーを使用します。アルミのシールとラベル識別子をカバーすることを確認してください。文化は井戸の両側やアルミシール スプラッシュがありますよう、板を振るか。
    9. フラット、-80 ° C のフリーザーでも表面のフードと場所のプレートからシール プレートを取り外します。
    10. ライブラリを処理した後、70% エタノールですべての作業面を拭きます。
    11. ライブラリのレプリケーション後、ライブラリを使用して遺伝スクリーン (議定書 III を参照してください) を実行した後は、品質管理チェックを実行します。

2. プロトコル II: 処理と PA14NR セットから個々 の突然変異体のストレージ

  1. 1 日目: ストリーク関心変異体
    1. PA14NR 設定リンク http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS を通じて関心の変異の場所を識別または非冗長 Library.xls ファイルを使用してリンク http:// からダウンロードしました。pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi)。すべての特定の突然変異体は (ゲンタマイシン、カナマイシン) を選択するために必要な抗生物質のメモしておきます。
    2. LB 寒天培地のメディアを準備、20-25 分のオートクレーブで滅菌し、55 ° C の水浴中にクールします。TnphoAトランスポゾン挿入を含む突然変異MAR2xT7トランスポゾンの挿入、および 200 μ G/ml カナマイシンを含む変異体の 15 μ G/ml ゲンタマイシンを追加します。プレート (円形または長方形の板が適切) LB 寒天媒体を注ぐ。1 時間に前に約 30 分間滅菌フード ドライ プレートを使用します。
    3. オートクレーブすべての容器、使用前に滅菌供給。
    4. PA14NR の設定を処理するためのマスク、白衣、手袋を着用します。ベンチをオフし、PA14NR セットを作業する前に 70% のエタノールで表面を拭いてください。
    5. ブンゼン バーナーで滅菌フィールドを作成します。
    6. -80 ° C のフリーザーからの興味の突然変異体の 96 ウェル プレートの PA14NR 設定を削除しドライアイスの上に置きます、ベンチにドライアイス コンテナーを取るし、若干 (約 1-2 分) を解凍できるようにベンチの上に 96 ウェル プレートを簡単に配置。
      注: ライブラリ プレートへのアクセスなどの汚染の大きなリスクと相関するいるとすべて PA14NR 設定 96 ウェル プレート連勝個々 の突然変異体は、アクセスの記録をつける
    7. それを剥がして、シールがプレートをレタッチするを防ぐために注意しながら前に手で暖かいアルミのシール。アルミシールの残党をはがすピンセットを使用します。
    8. 96 ウェル プレートに興味の突然変異体を探します。個々 の興味の突然変異体をも含むから少量の冷凍の文化を選択する滅菌木の棒または滅菌ピペット チップのいずれかを使用します。
    9. 単一突然変異コロニーのため寒天プレート上のカルチャを次のように冷凍の連勝: 軽く広げ連勝 1、新鮮な滅菌木製スティックやピペット チップを使用してを作成するプレートの部分に細菌連勝 1 をドラッグし、の 2 番目のセクションに細菌を広げるプレート、2 連勝を作成します。3 滅菌木製スティックやピペット チップを使用して、2 連勝をドラッグし、連勝 3 を作成する、プレートの最後のセクションに細菌を広げます。
    10. シールは、新しい滅菌アルミ製シール板をソースします。汚染を避けるために任意の時点でアルミのシールの粘着面に手を触れないでください。プレート ローラーを使用して、各井戸とプレートのエッジが完全に密封されることを確認します。ドライアイス-80 ° C のフリーザーに戻り 96年ウェル プレート。
    11. 寒天培地で 37 ° C の定温器を一晩インキュベートします。
    12. ライブラリを処理した後、70% エタノールですべての作業面を拭きます。
  2. 2 日目: 流体培養基 LB 液体の興味の突然変異体の成長
    1. 15 μ g/mL ゲンタマイシンやトランスポゾン挿入あたりの 200 μ G/ml カナマイシンを含む流体培養基 LB 液体を準備します。
    2. 膿を処理するマスク、白衣、手袋を着用します。
    3. ベンチをオフにし、70% エタノールで表面をふきます。ブンゼン バーナーで滅菌フィールドを作成します。
    4. 流体培養基 LB の適切な抗生物質との 3-5 mL を無菌培養チューブ キャップ付きに転送します。
    5. 滅菌アプリケータまたは滅菌ピペット チップを使用して、変異株のシングル コロニーをピックアップし、LB 媒体に接種します。
    6. ポンド 225 250 rpm でシェーカーの 37 ° C で液体培養を一晩インキュベートします。
    7. 膿を処理した後、70% エタノールですべての作業面を拭きます。
  3. 3 日目:-80 ° C のフリーザーの興味の突然変異体を格納します。
    1. 突然変異の名前、抗生物質のラベル クリオバイアルは流体培養基 LB とストレージの日付に追加されます。
    2. 500 ml 50% のグリセロール (v/v) し、オートクレーブで滅菌します。
    3. 膿を処理するマスク、白衣、手袋を着用します。
    4. ベンチや洪水層流フードをクリアし、70% エタノールで表面をふきます。
    5. シェーカーから突然変異体の文化を有するチューブを取り外します。
    6. ドライアイスの小さい容器を準備します。
    7. 層流フードを使用してまたはエタノール ワイプ ベンチ上ブンゼン バーナーで滅菌フィールドを作成します。
    8. 滅菌条件を使用してラベルのクリオバイアルに細菌培養と 50% のグリセロールの同量を追加し、ピペット混ぜて優しく (最終巻 1-2 mL/バイアル使用クリオバイアルのサイズによって)。急速凍結するドライアイスのクリオバイアルを配置します。
    9. -80 ° C のフリーザーでラベルの付いたボックスにクリオバイアルを配置します。
    10. 処理後 70% エタノールですべての作業面を拭く膿。

3. プロトコル III: PA14NR セットの品質管理

  1. (30-40 台を突然変異体を推奨テスト) など汚染を検出する新しくレプリケートされたプレートから突然変異体のランダムなセットを選択します。
    メモ: 使用する特定の遺伝子の突然変異体の身元を確認する必要がある場合、勧めを含む遺伝子の知られていたシーケンス用に設計された遺伝子特異的プライマーを用いた PCR 増幅を実行する、トランスポゾンの挿入。遺伝子特異的プライマー トランスポゾン変異体から断片を DNA 増幅ループミラーときではなく、PCR のプライマーが大規模な突然変異確認と可能性の存在を検出する機能性を含めるがより困難な任意の使用の利点汚染物質。品質管理の目的のため必要はありませんすべてランダムに回転の突然変異体の高品質 PCR シークエンス データを取得する限り、突然変異体の十分な数が誤り率を評価するために上映されます。
  2. デルスト リークし、変異株の成長を「プロトコル II」に従ってください。
  3. オートクレーブすべての容器、使用前に滅菌供給。
  4. 最寄りの法によるゲノム DNA を分離します。この作品で説明する分析のゲノム DNA 抽出用キット製造元のプロトコルを次に利用されました。複数の突然変異系統を同時に解析することがあります。
  5. 微量分光光度計を用いたゲノム DNA 濃度を測定します。約 100 ng/μ L にゲノム DNA の濃度を調整します。
  6. テンプレートとしてゲノム DNA を使用して、前述のステップ 1 の表 3、Arb1 PCR のフラグメント (図 3) を生成する「PCR1 反応」を実行。このステップのためのプライマーは、表 4 のとおりです。
  7. 10 倍 PCR1 反応の 5 μ L にローディングバッファーの 0.5 μ L、1.5-2% の agarose のゲルにロードし、80-150 V でゲルを実行できます。
    注: 特定のフラグメントの長さまたは特定のフラグメント範囲が想定されて、任意プライマーが複数の場所にバインドすると、1 つ以上のバンドがあります。
  8. テンプレートとして PCR1 反応から DNA を使用して、ステップ 2 の表 3、Arb2 PCR のフラグメント (図 3) の生成で説明されているように、「PCR2 反応」を実行しますします。このステップのためのプライマーは、表 4 のとおりです。
  9. 10 倍 PCR2 反応の 5 μ L にローディングバッファーの 0.5 μ L、1.5-2% の agarose のゲルにロードし、80-150 V でゲルを実行できます。
    注: 特定のフラグメントの長さまたは特定のフラグメント範囲が想定されて、任意プライマーが複数の場所にバインドすると、1 つ以上のバンドがあります。
  10. シーケンスの適切なトランスポゾン特定のプライマーと一緒に PCR2 反応を送信します。
  11. PA14NR 図書館のウェブサイト (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi)、直接の特定の遺伝子シーケンスに対してそれらをブラスト ブラスト リンクを使用して完全な PA14 ゲノムに対してそれら提供シーケンス結果 byBLASTing を解析します。興味の突然変異体。
    注: 選択した変異株については、PA14NR 設定サイト (検索 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS またはダウンロード リンク http:/ から非冗長の Library.xls ファイルを検索して見つけることができます。/pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi)。

figure-protocol-13415
図 3: PCR トランスポゾン挿入変異体の拡大そして配列。ステップ PCR の拡大に関与して突然変異体の身元確認のためのゲノム配列の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

PCR 反応セットアップ
ステップ 1ステップ 2
PCR1反応: PCR2反応:
23.25 μ L 水 (分子生物学グレード)19.15 μ L 水 (分子生物学グレード)
3µL 10 x Taq ポリメラーゼ バッファーTaq のポリメラーゼ バッファー x 5 μ 10
0.5µL Taq のポリメラーゼ0.6 μ L Taq のポリメラーゼ
0.625 μ 20 μ M プライマー Arb1D (表 4)0.625 μ 20 μ M プライマー Arb2A (表 4)
0.625 μ 20 μ M トランスポゾン特定のプライマー (PMFLGM。GB 3 a または Tn5Ext) (表 4)mL 20 本 0.625 μ M トランスポゾン特定のプライマー (PMFLGM。GB 2 a または Tn5Int2) (表 4)
1 μ L 10 mM dNTPs1 μ L 10 mM dNTPs
1 μ L genomic DNA 100 ng5 μ L PCR1反応
30 μ L 反応量30 μ L 反応量
PCR 反応の設定
PCR1たちの条件: PCR2たちの条件:
95 ° C-2 分95 ° C-2 分
5 サイクルを繰り返します。30 サイクルを繰り返します。
95 ° C-30 s95 ° C-30 s
30 ° C-1 分54 ° C-30 s
72 ° C-1 分72 ° C-1.5 分
30 サイクルを繰り返します。72 ° C-10 分
95 ° C-30 s4 ° C-ホールド
45 ° C-30 s
72 ° C-1 分
72 ° C-10 分
4 ° C-ホールド

テーブル 3: 任意の PCR に使用される PCR 反応セットアップとたち条件。任意の PCR の反作用は、順番に実行される、PCR1 反応中に生成するフラグメントは PCR2 反応のテンプレートとして使用されます。特定たち設定は反応のセットごとに使用されます。

プライマー名プライマー シーケンス
MAR2xT7 トランスポゾン固有プライマー
PMFLGM。GB 3aTACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM。GB 2 aTGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 トランスポゾン配列のプライマー
PMFLGM。GB-4 aGACCGAGATAGGGTTGAGTG
TnphoAトランスポゾン固有プライマー
Tn5ExtGAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TnphoAトランスポゾン配列のプライマー
Tn5IntCGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
任意プライマー
ARB1DGGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2AGGCCAGGCCTGCAGATGATG

表 4: 品質管理で使用されるプライマーのリスト実験。使用されるプライマー PCR 増幅の突然変異体の身元を確認するトランスポゾン挿入変異体の配列。

結果

PA14NR セットの 12 の新しいコピーは、生成される新しいコピーの品質管理評価・議定書 III を使用して実施されたプロトコルを使用してレプリケートされていました。

PA14NR セット野生型 PA14 から成っている制御板と共にミュータント プレート接種し接種コントロール プリセット パターン (図 4 a) に?...

ディスカッション

P。緑膿菌PA14NR 科学のコミュニティのための貴重なリソースです。Clarivate 分析指標データベース、Liberatiらから 2017 年 3 月のデータセットによると(2006 年)37、PA14NR セットの構造を記述するは、微生物学の出版物の上位 1% にランクされています。Google Scholar は Liberatiらの以上 600 の引用を報告します。2017 年 8 月現在 (2006 年) の元の原稿。ライブラ?...

開示事項

金融利害の衝突を報告しません。Eliana Drenkard とフレデリック Ausubel は、PA14 非冗長トランスポゾン変異ライブラリーの作成に参加しました。ブライアン ハーリーと Lael Yonker 現在家、マサチューセッツ総合病院で小児科学の一部として変異ライブラリーを配布します。

謝辞

データベース検索で彼女の指導の MGH トレッドウェル仮想ライブラリのリサ Philpotts に感謝したいと思います。この仕事に支えられた嚢胞性線維症財団 (YONKER16G0 および HURLEY16G0) および NIH の NIAID (BPH と ADE: R01 A1095338)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50Corning Life Sciences353072via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25Corning Life Sciences3960via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60Thermo Scientific Rochester242811via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L)Corning Life Sciences432104via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300Cardinal HealthAT7509via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100Diversified BiotechALUM-100via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100Diversified BiotechBEM-1via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100SorensonS50100via Westnet Incorporated
Plate rollerVWR60941-118via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheetsGA InternationalRCL-11T1-WHvia Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicatorV & P Scientific, Inc.Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm longvia V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubatorInfors HTl10003Pvia Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic PipetteSartorius735491PRvia Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960Biohit14-559-512via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry IceUser-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
NanoDropThermo ScientificND-2000via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lidsThermo ScientificAB0404via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL)Molecular BioProducts, Inc.Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification KitEpicentreMCD85201via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-useThermo ScientificSM1333via ThermoFisher
RediLoad Loading BufferInvitrogen750026via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1LSigma AldrichG5516via Sigma-Aldrich
LB BrothPer 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
TryptoneSigma AldrichT7293via Sigma-Aldrich
Yeast ExtractSigma AldrichY1625via Sigma-Aldrich
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653via Sigma-Aldrich
Sodium HydroxideSigma AldrichS8045via Sigma-Aldrich
LB  agarSee preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto AgarSigma AldrichA5306via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10gBioReagent1405-41-0via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfateGibco11815024via ThermoFisher
Ethanol, 190 proofDecon04-355-221via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
PrimersUser-preferred vendorSee primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade WaterCorning46000CVvia Fisher Scientific
Taq Polymerase BufferInvitrogen10342020via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinantInvitrogen10342020via ThermoFisher
dNTPsInvitrogen10297018via ThermoFisher
AgaroseSigmaA9539via Sigma-Aldrich

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