ターミナル媒介 dUTP を使用してニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7 がカエルツボカビ、カエルのメジャー表皮細胞死に試金します。

要約

ツボカビの 2 つの方法を使用して、カエルの表皮細胞死を定量化します。まず、臨床的に感染し、感染動物の差異端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場で組織を使用します。第二に、カスパーゼ 3/7 タンパク質解析を用いた感染症でアポトーシスの時系列分析を行っています。

要約

両生類は、世界的に生物多様性に大きな損失を経験している主要な原因の一つ、伝染性の病気カエルツボカビです。病原菌ツボカビ菌(Bd) に感染するとカエルの表皮の妨害によって引き起こされるしかし、病理学的変化があるされて明示的に特徴付けられない。アポトーシス (プログラムされた細胞死) は、ホスト組織を損傷する病原体により使用できますが、耐病性の病原体の除去のためのホスト メカニズムことができます。本研究で我々 は 2 つの異なるアッセイを使用して感染し、感染動物の表皮細胞死を定量化: ターミナル トランスフェラーゼを介した dUTP ニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7。遵守、tunel の腹側、背側と太ももの皮膚組織を使用して細胞表皮細胞はその場で臨床的に感染している動物の死と蛍光顕微鏡を用いた感染動物と細胞死を比較します。感染症はもちろん、表皮におけるアポトーシス レベルはどのように変化を決定するためには、8 週間以上隔週趾先サンプルを削除し、抽出されたタンパク質とカスパーゼ 3/7 試金を使用して、サンプル内の活動を定量化します。我々、伝染ロード カスパーゼ 3/7 アクティビティに関連付けます。TUNEL 法は細胞死の場でのローカリゼーションのため便利ですが、サンプルあたりコストと時間がかかるのです。カスパーゼ 3/7 試金は大きいサンプルの大きさと時間の効率的なコースの実験。ただし、カエルつま先先端生検が小さいので限られた抽出利用できるあるサンプル標準化等を通じたタンパク質定量、ブラッドフォードの試金のため。したがって、サンプルの標準化の中にエキスを消費を避けるためにつま先生検の写真分析を通して皮膚表面積の推定をお勧めします。

概要

両生類が現在 1 つすべての脊椎動物の分類群の¹のグローバル生物多様性の最大の損失を経験してください。これらの減少の主要な原因は、ツボカビ菌 Bd²病原菌によって引き起こされる致命的な皮膚疾患ツボカビです。病原体表面的に重篤な電解質の喪失、心停止と死³皮膚機能の中断につながることが表皮に感染します。抗菌ペプチド^4、5、皮膚細菌叢⁶免疫細胞受容体^7、8など、 Bdに対してさまざまな潜在的なホスト免疫メカニズムを検討中リンパ球の活動^9,10。しかし、ほとんどの研究は、上皮のアポトーシスと細胞死がこの致命的な病原体に対して免疫機構かどうかを します。

細胞死のいずれかを介してアポトーシス (プログラムされた細胞死) や表皮の壊死 (プログラムされていない死)、 Bd感染病理があります。前の研究Bd感染可能性があります皮膚外植体を遊走子清体外¹¹.にさらされているとき細胞接合の破壊を観察がアポトーシスを誘導することを示唆しています。さらに、 Bdの退行性表皮変化-電子顕微鏡^12,13を使用して感染したカエルを観察。トランスクリプトーム解析を示しアポトーシス経路は、感染した皮膚¹⁴で亢進、両生類の脾細胞アポトーシスを受けるは、 Bd の in vitro培養上清¹⁵にさらされる場合。Bdが引き起こすことができることを示唆する証拠の増加量にもかかわらずアポトーシスとホストの細胞死体外、体内の研究を探索したり、感染の進行中のメカニズムに欠けているアポトーシスを定量化します。さらに、それは、ホストがBd感染と戦うため防御免疫戦略としてアポトーシスを使用している場合、またはアポトーシスと疾患の病理は、知られているは。

本研究では感染している動物の生体内で2 つの方法を使用して表皮細胞死・ アポトーシスを検出目指して: カスパーゼ 3/7 蛋白質の試金と端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場での試金。各測定は、細胞死の¹⁶のさまざまな側面を検出した、一緒にこれらのメソッドは細胞死に関与するメカニズムの完全な理解を提供し、効果の正確な測定を確保します。カスパーゼ 3/7 アッセイは、両方の組み込みと外因性アポトーシス経路の定量化を可能にするエフェクター カスパーゼ 3 および 7 の活動を定量化します。対照的に、TUNEL アッセイは、アポトーシスや壊死 pyroptosis¹⁷を含む細胞死のメカニズムによって引き起こされる DNA 断片化を検出します。TUNEL 法を使用して、3 つの異なる肌のセクションを使用して臨床的に感染していると感染していないの両方の動物の表皮内の細胞死の場所を調査する: 背部、ベンターとPseudophryne のお祭りの腿。このメソッドは、特定の表皮層内での位置を区別することと同様、細胞死の解剖学的サイトを識別します。Litoria verreauxii アルピナで 8 週感染症全体のアポトーシスの時間シリーズの定量化を実施するのにカスパーゼ 3/7 試金を使用しています。我々 は同じ動物から隔週つま先先端サンプルを取る、カスパーゼ 3/7 活動に病原体伝染ロードを関連付けることです。

プロトコル

ジェームス ・ クック大学は、 l ・ v ・ アルピナのP. コロボリーと A1897 と A2171 アプリケーション A1875 で動物の倫理を承認しました。

1. 動物飼育および監視

1. 適切な水の供給とクリーニングのスケジュールと、種のために適切な環境で動物を個別に家します。動物を毎日チェックします。
   1. 絶滅危惧Pseudophryne コロボリーのアダルト個体 (Tunel、セクション 4) を使用し、(カスパーゼ 3/7 試金のため、セクション 5)、絶滅危惧Litoria verreauxii アルピナ寄付から飼育下繁殖施設。苔上の 15-18 ° C で動物を維持し砂礫質、逆浸透膜水を毎日それらを霧し、読み込んでコオロギと毎週 3 回をフィードします。
2. 毎週ごとの個別の 1 回のデータを収集します。ステップ 2.1 で説明されるようにBdの個人、綿棒します。近づいたときの 0.1 g、尺度を使用してそれぞれの動物の重量を量るし、ダイヤルのカリパスを使用して最も近い 0.01 mm (SVL) 長さを口に鼻を測定します。
3. (セクション 3 に従って) 接種後動物の倫理ガイドラインに準拠して (不規則な皮膚泥沼、inappetence、足の発赤、倦怠感、または遅延の立ち直り反射) 感染の臨床症状に毎日動物をチェックします。臨床症状と合併症が存在する場合、動物を安楽死させます。
   1. トリカインメタネスルフォネイト (MS222) の過剰摂取で安楽死 (0.1 w/v MS222 高齢者の水道水中の炭酸水素ナトリウムと ph 6-7)。10 分停止の動きすべての後、彼らは刺激への応答を表示しない MS222 で動物を飼います。

2. Bd感染試験

1. Bdのかみ
   1. 各動物は、新しい滅菌レーヨン綿棒 (1 頭につき 1 つ綿棒) と綿棒します。次の拭き取り方法: 各太もも、サイド、および四肢の 5 回にあわせて、5 回。これは、45 ストロークの合計です。
   2. 中に、DNA の効果的なキャプチャを確保するためストローク間やさしく綿棒を回転します。1.5 mL 遠心管を綿棒の先端を切るし、抽出まで-20 ° C で保存します。
2. DNA の抽出と qPCR 法
   1. 0.5 mm シリカビーズの 30-40 mg の市販 DNA 抽出試薬 50 μ L を追加することによって、綿棒からゲノム DNA を抽出します。ビーズは、2 分の最大速度でビーズ ビーター細胞ホルモンでサンプルを破った。次のビーズ ビーター ステップ 1 分 2,000 x g でサンプルを遠心します。
   2. 100 ° C 10 分でサンプルをインキュベート、冷まします。3 分間 5,000 × g でサンプルを遠心し、個々 の 1.5 mL マイクロ遠心チューブに上清を転送 qPCR まで-20 ° C で保存します。
   3. ボイルらを次の量的な PCR (qPCR) を使用します。2004¹⁸感染の負荷を分析します。次の変更を使用します。
      1. DNA 抽出のサンプル 6:100 二重脱イオン水で希釈します。ウシ血清アルブミン (BSA) の 0.7 μ L を各ウェル PCR 阻害を防ぐために追加します。Singlicate では、各サンプルを実行します。各プレートの希釈標準の一連の遊走子 (感染症) の負荷を推定するのに負 (テンプレートなし) コントロールと肯定的なコントロールを使用します。

3. 接種

1. 文化Bd
   1. 1 L の脱イオン水にトリプトンの 16 g、ゼラチン加水分解物、2 g および 4 g の乳糖 (TGHL) を追加することによって文化のスープを準備します。オートクレーブ (121 ° C で 40 分) スープを冷却することができ。
   2. (この場合は、ニューサウス ウェールズ州分離、AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1 通路番号 11 から分離された) でBd分離を接種する TGHL スープの 23 ° c、7 d のため成長し、スープ文化を TGHL 寒天培地プレートに転送。
   3. 板をするためには、トリプトンの 16 g、ゼラチン加水分解物 2 g、4 g の乳糖 (TGHL)、および細菌寒天 10 g を 1 L の脱イオン水とオートクレーブ (40 分のための 121 ° C) に追加します。混合物が十分に、クールなしかし、それが固化する前に、TGHL 寒天に注ぐ 92 mm 直径培養皿、クラス II 生物学的安全キャビネットでは、1/4、1/3 完全。
   4. 寒天が固化と完全に冷却、液体スープからBdの 0.5 mL、各プレートを接種して均等に。約 1 h の皿の上を乾燥させると、プラスチック パラフィン フィルム プレートをシールBdスープ混合物を許可します。5-7 d の 23 ° c 下平板寒天培地側を孵化させなさい。
2. 遊走子接種ソリューションの洪水プレート
   1. 接種前に「毎日の生存を確保するため倒立顕微鏡下で遊走運動を確認します。水泳の遊走子のう外多数の遊走子を高い、遊走子リリースのとき文化は接種の準備ができて。
   2. 高齢者の水道水や人工池の水 3 mL、各プレートをプレートに水を注ぐと水の中に解放する遊走子を許可する 10 分間室温でインキュベート洪水します。潜伏期間後に、新しい滅菌コンテナーに遊走子懸濁液をデカントします。
   3. 製造元の指示に従って、haemocytometer を使用して遊走子濃度を推定します。遊走子懸濁液の濃度が判明すると、高齢者の水道水を 3 mL あたり 1 x 10⁶遊走子の濃度に懸濁液を希釈します。
3. 動物に接種します。
   1. そのベンター¹⁹個別 50 mL 容器の上接種混合注ぐ 3 mL を各動物を接種します。過剰接種接種コンテナーのベースに収集するを許可します。感染症を確実に 24 h の個別接種コンテナーで各動物を残すし、24 h, 接種後消毒テラリウムに個々 を返します。
      1. 13% のボリューム (v/v) 商業漂白ソリューション²⁰を使用して terraria を消毒、すすぎ、少なくとも 2 回水、24 時間以上乾かします。
   2. Bdの-負のコントロール、模擬 3.2 3.3 の場合と同じ方法を使用して動物に接種するが、 Bdの洪水-接種した寒天版Bdの高齢者の水道水 5 mL で無料寒天を代わりに。

4. Tunel

1. 1.3.1、ステップとBdの等しい数で説明されているようにはツボカビの臨床徴候を示している動物の安楽死-負の制御動物。
2. 皮膚の解剖 (背側、腹側と太もも) それぞれの動物からのサンプル。4 %v/v リン酸緩衝ホルムアルデヒドの 2 h の肌サンプルを修正します。短いと一貫性のある時間を修正により、完全に確定するために組織の効果的かつ正確な免疫組織化学染色ができます。区分のための埋め込みまでを 80% エタノールに転送します。
3. 次の標準的な方法²¹組織の準備のためのパラフィン ワックスに皮膚を埋め込みます。簡単に言えば、プロトコルは次のとおりです。
   1. エタノールの一連の階級における組織の脱水、キシレンとエタノールをクリアします。組織をパラフィン ワックスで埋め込むし、1 つのパラフィン ブロック内の個々 のすべての 3 つの皮膚のサンプルを配置します。
4. 次の標準的な組織学的準備²¹ミクロトームを使用してセクションのスキンです。セクションは 5 μ m で連続的組織、親水性のガラス スライドを押さなければ。スライドごとに肌タイプごとの 4 つのシリアル histosections を配置します。シリアル皮膚セクションと個人ごとの 3 つのスライドは、各スライドが貼付されている各組織の 4 つのセクションを持っていることを覚えています。
5. 次の順序でスライドを染色するには。
   1. ヘマトキシリン エオシン (H & E) counterstaining が続くと、最初のスライドを染色します。このスライドは、皮膚内でBd胞子嚢の位置を視覚化することです。
   2. 2 番目のスライドは次の組織学的準備のため市販の tunel 染色し、は以下の製造元の指示に従ってください。
      1. まず、キシレン洗浄、あたりの 5 分の 3 つの変更とスライドを洗浄することにより coplin jar に切片を deparaffinize、100% のエタノールの 5 分の 2 つの変更で洗うたびに従ってください。5 分の PBS のワンウォッシュと 95% のエタノールの 3 分し、3 分仕上げの 70% のエタノールの 1 洗浄に従ってください。
      2. 新鮮な希薄蛋白質消化酵素 (20 μ g/mL の PBS で希釈した濃度ではプロテアーゼ K) と組織を前処理し、スライドに直接追加します。15 分洗浄 2 分の coplin jar に PBS の 2 つの変化間インキュベートすることができます。
      3. 余分な液体をオフにタップし、室温で 2 分間 coplin jar に PBS の 3.0% 過酸化水素で癒します。5 分間、PBS で 2 回すすぎ洗うたび。
      4. 余分な液体をオフにタップ、スライドの組織に直接平衡バッファーの 75 μ L/5 cm²を適用します。セクションの周り余分な液体を 10 s. タップ間インキュベートし、遊離 tranferase (TdT) 酵素の作業の 55 μ L/5 cm²を適用します。37 ° C で 1 時間加湿チャンバー内で孵化します。
      5. 作業強度停止/洗浄バッファーの coplin jar にスライドを置く TdT 孵化後 15 の扇動 s と室温で 10 分間インキュベートします。洗浄あたり 1 分の PBS の 3 つの変更を使用してスライドを洗います。余分な液体オフをタップします。
      6. 組織、65 μ L/5 cm²に部屋の温度に温められてアンチ ジゴキシゲニン共役 (ローダミン) を適用します。室温で 30 分間加湿チャンバー内で孵化、光への暴露を避けます。洗浄あたり 2 分の PBS の 4 つの変更で洗ってください。余分な液体オフをタップします。
      7. 0.5 - 15 μ L 追加で仕上げカウンター染色として動作するスライド スライド マウント中 1 μ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)。その後、カバー スリップでカバーし、爪のマニキュアやゴム系のシール。試金は光に敏感、暗闇の中で乾燥するスライドを許可します。
   3. 汚れ 3 スライドは染色 DAPI 対比染色、tunel を使用して、各サンプルのポジティブおよびネガティブ コントロールとして使用します。
      メモ: コントロールのスライド 4 の histosections の最初の 2 が肯定的な制御の複製と最後の 2 が陰性対照をレプリケート。
      1. 肯定的なコントロールの代わりに、ステップ、4.5.2.2 前 DN バッファー (pH 7.2、MgCl₂、4 mM 0.1 mM DDT 基本、30 mM trizma) で組織を扱うし、5 分間室温でインキュベートを聞かせてください。Dnase DN では 0.1ug の最終濃度のバッファーを溶解し/mL、スライドに直接それを適用します。室温で 15 分間インキュベートします。 その後、スライドで洗う dH₂O 5 洗浄 3 分洗うたび。余分な液体オフのしみ。4.5.2.3 のセクションの指示に従って、tunel を再開します。
      2. マイナス コントロールの追加しないでください遊離 tranferase (TdT) 酵素それらのサンプルを (前述のセクション 4.5.2.4)。
6. 分析の完了後直ちに TUNEL スライドを観察します。
   1. かかる写真、アポトーシス細胞を明らかにし、紅白 DAPI すべて核を明らかにし、青で表示されますが表示されます、ローダミン汚れ両方のフィルターを使用して、蛍光顕微鏡を用いた X 200 の各皮膚セクションに沿って間隔をランダムに、オーバーレイ細胞を生成することができます。セルが少なくとも 100 サンプルごと皮膚セクションごと撮影されているを確認します。-20 ° c. で暗い顕微鏡ボックスでスライドを保存します。
   2. 画像あたり (青い DAPI 染色) のセルをカウントします。皮膚セクションあたり少なくとも 100 セルがカウントされますを確認します。セルが 100 に達すると、イメージ内のすべてのセルをカウントします。以下、100 のセルが 1 つのイメージに存在する場合は、動物あたり皮膚セクションあたり少なくとも 100 のセルに達するまで別のイメージをカウントします。
   3. 次に、同じ画像 (赤いローダミン染色) における TUNEL 陽性細胞数をカウントします。壊死や背景ではなく、アポトーシスを示す TUNEL 陽性細胞は、明細胞エッジ (膜がない溶解をそのまま) を持つ単一のセルです。時々 セル縮小アポトーシス体を形成します。
   4. TUNEL 法でカウントを設置し、H & E 染色の histosections に対応する領域を分析します。H & E 染色標本がBdを保証するBd伝染のサイトに対応していることを確認-TUNEL 法でアポトーシス細胞をカウントする場合は、感染したサイトが使用されます。

5. カスパーゼ 3/7 アッセイ

1. ( Bd- 露出とBd- 負の両方)、それぞれの動物からつま先のヒントを収集一度毎週週 3 ポスト接種と隔週個人ごと 8 つま先までの実験の終わりを通して。
   1. 火炎滅菌ハサミで第 2 指骨でつま先先端をカットし 1.5 mL マイクロ チューブに配置し、-80 ° c. ですぐにフリーズ
2. 冷凍つま先サンプルからタンパク質を抽出します。
   1. サンプルバッファー (25 mM HEPES pH 7、5 mM MgCl₂) 1.5 mL スクリュー キャップ チューブの 2 つのステンレス ビーズ (3.2 mm) の 100 μ L のサンプルを置きます。4 サイクル 1 分ビーズ氷の上 3 分続く (で使用されるステップ 1.2.1 として同じビーズ ビーター) の最大の速度で打つことによってサンプルを溶解させます。溶解後、12,000 g x と 4 ° C、アッセイに使用する 5 分上澄みでサンプルを遠心します。
3. ブラッドフォードの試金を使用してサンプルあたりのタンパク質濃度を定量化します。
   1. 384 ウェル プレートでブラッドフォード試薬を 10 μ l 添加 10 μ L 蛋白質のエキスをミックスし、室温で 2 分間インキュベートします。重複の各サンプルを実行、5 のシリーズと一緒に折る BSA 希釈標準。595 で吸光度を読み nm 吸光プレート リーダーに。
4. また、つま先先端サンプルが小さすぎる (タンパク質濃度最低標準に近い手順、4.3.1 でブラッドフォードの試金から決定されたまたはある場合はサンプリング カエル未満 3 g 総重量) 場合は、皮膚表面を推定してサンプルを標準化します。ブラッドフォードの試金の代わりに写真を使用しての領域。
   1. カスパーゼの試金のためのサンプルからタンパク質を抽出する前に写真の倒立顕微鏡を使用して 40 倍の倍率で指を実行します。
   2. つま先部の推定によるイメージング ソフトウェア、コンピューターを使用してつま先のサンプルを分析します。つま先クリップの端の周りに線を描画することによってこれを行うし、図形のイメージング ソフトウェア見積もりエリアがあります。3次元皮膚サンプルの表面積を概算 π (3.14) でその領域を乗算 (断面積 × 長さとして (円周率 × 直径) チューブの外側の表面の領域を与える)。
5. カスパーゼ 3/7 分析を実行します。
   1. 384 よく発光板で市販カスパーゼ 3/7 試薬を 10 μ l 添加し、タンパク質抽出液の 10 μ L を追加します。3 通では、各サンプルを実行します。
   2. 室温で 30 分間光から離れたプレート 15 s. 加温のためゆっくりと板を振ることによって試薬を混ぜます。発光プレート リーダーを使用して発光を測定します。

結果

Tunel

感染していない対照動物のよりも感染した動物にもっと TUNEL 陽性細胞があった。Tunel 陽性細胞の異なるその場の場所は、感染し、動物を制御します。対照動物の TUNEL 陽性細胞、真皮と表皮皮膚 (図 1A参照)、低レベル層が、感染している動物には TUNEL 陽性細胞が表皮 (

ディスカッション

我々 は、上皮のアポトーシスおよび致命的な病気カエルツボカビの検査またはBdの影響を受けやすい種の病害抵抗性のメカニズムの潜在的なメカニズムとして細胞死を探った。表皮、tunel 表皮細胞死解析その場での感染の進行中の表皮細胞死を監視するためのカスパーゼ 3/7 アッセイにおける細胞死を評価する 2 つの方法を使いました。細胞死・ アポトーシス伝染ロードに関連?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
POLARstar Omega	BMG Labtech		Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate	Corning	3707
384 well low flange white flat bottom plate	Corning	3570
Agar Bacteriological (Oxoid)	Fisher	OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	6764254
Lactose Broth (Oxoid)	Fisher	OXCM0137B
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP328-500
Tricane-S (MS-222)	Fisher	NC0872873
Tryptone	Fisher	BP1421-500
Bovine Serum Albumin	Invitrogen	15561020
Sterile rayon swab	Medical Wire & Equipment	MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit	Merck Millipore	S7165
Coomassie Bradford reagent	Pierce	23200
Caspase Glo  3/7	Promega	G8090
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887-20ML
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic	Sigma-Aldrich	G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)	Thermo/Life	20-012-043
Prepman	Thermo/Life	4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444556
Parafilm	Bemis	PM996
Clorox bleach	Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade	Fisher	BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope	Carl Zeiss		Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads	BioSpec	11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)	Taqman		Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′)	Taqman		Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′)	Taqman		Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments	Qiagen		qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Fisher	02-681-372
Cell culture petri plates	Nunc	263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm	BioSpec	11079105Z