導電性足場を調節して幹細胞を提供するには

要約

このプロトコルを記述するように導電性高分子足場の in vitro電気刺激および幹細胞播種の足場を使用しての注入その後体内の幹細胞の播種細胞培養系の作製、低侵襲技術。

要約

幹細胞療法が治療、エキサイティングなストロークとして浮上しているが、最適な配信方法は不明のまま。マイクロインジェクション法は脳卒中モデルで幹細胞を提供する何十年も使用されてきましたが、この手法は注入前に幹細胞を操作する能力の欠如によって制限されます。本稿では、幹細胞配信用導電性高分子足場の使用法を詳しく説明します。導電性高分子足場を用いた幹細胞の電気刺激は、細胞の生存、炎症反応とシナプスのリモデリングに関与する幹細胞の遺伝子を変更します。電気前処理後は、足場に幹細胞は遠位の中大脳動脈閉塞ラット モデルで頭蓋内移植されます。このプロトコルは、導電性高分子足場経由で幹細胞を操作するための強力な手法をについて説明し、さらに幹細胞を用いた治療法を開発するための新しいツールを作成します。

概要

ストロークは、世界の死の 2 番目の主要な原因とアメリカ合衆国の死の 5 番目の主要な原因です。にもかかわらず、これらの高死亡率、脳卒中の回復のための治療現在無し医療選択肢の現在利用可能な¹課題のまま。うちだけ 40 利用幹細胞の虚血性脳卒中を扱う 300 の臨床試験について現在あります。前の研究は、幹細胞治療にストローク修理^2,3に有益な効果があることを示しています。脳由来神経栄養因子 (BDNF) やトロンボスポンジン 1 (THBS-1) 移植ひと神経前駆細胞 (hNPCs) から放出されたなどのパラクライン因子の増加に関連付けられているメカニズムを通して機能の回復機能の向上が示されています。シナプス形成、血管新生、樹状突起分岐、新しい軸索投射だけでなく、免疫系^4,5,6を調節すること。ただし、幹細胞の最適な配信方法は、とらえどころのないままです。

脳に成功した幹細胞配信課題のまま。現在、幹細胞を提供する注射ハイドロゲルと高分子足場システムが導入されています。移植時に幹細胞を保護し、宿主の炎症反応と低酸素の条件^7,8,9を含む過酷な脳卒中後の環境からの保護を提供するこれらの送付方法^,10します。 ただし、最も一般的に使用される材料は、不活性細胞¹¹の連続変調方式 (すなわち、電気刺激) の使用を制限します。電気刺激は分化、イオン チャネル密度、および幹細胞¹²の神経突起伸展に影響を与えるです。不活性ポリマーと比較して、導電性高分子は電気刺激と幹細胞²の操作を現在可能を運ぶことができます。ただし、電気刺激、(すなわち、 BDNF および THBS 1) 神経栄養因子の遊離を調節する正確なメカニズムはまだ完全に検討されます。

このプロトコルでは、導電性高分子の足場は、体外の電気刺激は、ポリピロール (PPy) から成る細胞培養系を構築する手順を示します。細胞培養系を作製方法により遷延皮質に幹細胞シード足場の後続の注入が可能です。このシステムのため我々 電気的前提、裏付け足場に幹細胞注入前に短期間のため。次の電気刺激は、低侵襲による頭蓋内細胞を運ぶ導電性高分子足場は正常に注入しました。

プロトコル

すべての幹細胞と動物の手続きは研究所動物愛護 (SCRO 616、APLAC 31909) のスタンフォード大学の管理パネル、スタンフォード大学の幹細胞研究管理委員会によって承認されました。

1. ガラス基板エッチング

1. インジウム錫酸化物 (ITO) の準備-ガラスの導電面にマスキング剤を配置することによって覆われ、ガラスのスライド。
   注: ほとんどの市販の透明テープは、マスキング剤として使用できます。
   1. 刃を使用して余分なマスクを削除、ガラスに覆われた目的の最終的な伊藤設計の形状だけを残してします。
2. 硝酸の 5% (v/v) と 45% (v/v) エッチング ソリューションを準備するヒューム フード内ガラス ビーカーに塩酸を組み合わせます。
   1. 70 ° C でエッチング液の温度を維持するのにホット プレートと温度計を使用します。
3. エッチング液 70 ° C に達すると、過剰の ITO 層を取除くために 2 分のためのソリューションにマスク ITO ガラス スライドを配置します。
   注: テープ マスキングは酸溶液への暴露から ITO 層を保護します。
4. スライドをソリューションから削除し、脱イオン (DI) H₂o. でそれをすすいでください。
5. マルチメータを使用して残りの伊藤が維持されていることを確認するマスクおよび測定抵抗を慎重に取り外します。目的のエッチング領域のリードアウトは、約 0 Ω をする必要があります。

2. ピロール溶液の調製

1. 1000 mL のガラス瓶の中・ ディ ・ H₂o. の 600 mL のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム (NaDBS) の 70 g を溶かす
2. NaDBS が解散した後 14 mL 0.2 M ピロールと・ ディ ・ H₂O の mL の 386 をソリューションに追加します。
3. アルミ箔とソリューションをカバーし、4 ° C で保管

3. めっきガラス基板上ヘのポリピロール

1. NaDBS は完全に再溶解されるまでは、部屋の温度にピロール解決を暖めます。
   注: これは、約 15 〜 20 分かかります。
2. ピロール溶液 25 mL をビーカーに注ぐ。
3. マルチメータにエッチングのガラス基板を接続し、ピロール ソリューションにスライドが水没します。
   1. 0 Ω 抵抗側がプラチナ メッシュ参照電極に向かって直面していることを確認します。
4. PPy マルチメータ (電流 3 mA/cm²で 4 時間制御) を用いた ITO 表面にめっきを開始する電流を適用します。
5. デジタルマルチメータと洗って電気めっき-PPy ・ ディ ・ H₂O 残留界面活性剤を削除するから ITO ガラスを削除します。
6. かみそりの刃を使用して ITO ガラスからめっき PPy プレートを注意深く取り外します。
   1. 常温 PPy プレートを格納します。

4. ポリジメチルシロキサン (PDMS) の準備

1. ヘラと計量皿を使用して、基本エージェントの 18 g を混ぜて硬化剤 2 g と 2 つ 10 cm × 8 cm ガラス金型に流し込みます。
2. 15 〜 20 分の真空チャンバーを使用して金型から泡を削除します。
3. 3 h の 70 ° C のオーブンで金型を配置します。
4. いったん冷却、金型から、PDMS を削除するのに平らなヘラを使用します。

5.体外刺激チャンバーの作製

1. オートクレーブ 1 時間 120 ° C で金属板 (WxL、2.5 cm × 12.5 cm) とフロー バルブします。
2. チェンバー スライドをテンプレートとして使用して、PDMS の 2 つの部分をカットします。
   注: PDMS のワンピースは、セル室の細胞部屋から 2 つの隣接する正方形の排気切替器との境界として機能します。もうひとつ、PDMS 商工会議所の境界の概要であります。
   1. カット内部をセル商工会議所、それは正方形形、セル室の図形と一致します。PDMS の両方の部分の全体の形状は長方形、チェンバー スライドのと一致することを確認します。
3. 層材料のトップに下から次のよう: (1) メタル プレート、 (切り抜き)、なし (2) PDMS (3) PPy プレート (PDMS に垂直)、 (切り欠き) PDMS (4) と (5) セルの商工会議所。
4. 一度完全に整列装置を一緒にクランプします。
5. 金属線の 2 つの 60 cm 部分をカットし、商工会議所の外側から突き出ている PPy 板の両端に 1 本のワイヤーを接続する銀ペーストを使用します。その線がインキュベーターの外側に装置を拡張するのに十分な長さを確認します。
6. 銀ペーストの硬化後、強化し、エポキシとワイヤーの接続をシールします。
   1. 応用分野は、各商工会議所で同じであることを確認するテスターを使用して抵抗を記録します。
   2. 注入、削除線;細胞培養チャンバーをアンクランプし、PDMS し、それらを導電性の足場から分離します。注入された足場の寸法は、約 1 × 3 × 0.25 mm です。

6. ひと神経前駆細胞 (hNPCs) PPy 上のめっき

1. 2 時間の紫外線の下で組み立て室を滅菌します。
   1. 1 時間後回転組み立て室 90 °。
2. 滅菌後、PPy コーティング基板の 800 μ L でチャンバーの下部の表面をコート、1 h の 5% CO₂で 37 ° C でインキュベーターで PPy プレート上を固めるため基板を許可します。
3. 1 時間後の部屋から上澄みを除去し、ウェルあたり DPBS + Ca、Mg の 1 mL で優しくすすいでください。
   メモ: は、基材の剥離の原因になります、力強く PPy の表面を洗浄しないでください。
4. 新鮮な携帯メディアを使用して、機械的に穏やかなピペッティングで組織培養プレートからチャンバー用培養細胞を切り離して考えます。
   注: セルは 90-100% 解離に合流をする必要があります。
5. 8000 × g で 5 分間遠心分離を用いた hNPC ペレットを収集します。
6. 診断を使用して、カウント、100,000 セル/cm²のボリュームに細胞を再懸濁します。
7. 各商工会議所よく (100,000 セル/cm²メディアの 1 ml) に 100,000 細胞をプレートします。
8. 5% で 37 ° C でインキュベーターに部屋を戻る CO_2.

7. hNPCs の刺激

1. 1 日播種後、チャンバーに細胞は、細胞に電気刺激を適用するのに波形発生器を使用します。
2. 刺激の前に各商工会議所からも古いメディアを削除し、新鮮なメディアの 800 μ L で補充します。
3. メディアが変更された後チャンバーをインキュベーターに配置、インキュベーター、外ワイヤーを拡張し、波形発生器に接続
4. 注 mV、100 Hz と 1 h で方形波信号を細胞に刺激を適用されます。
5. 、刺激後ワイヤーを取り外して 5% CO₂と 37 ° C で設定インキュベーターの別の日の両院を孵化させなさい。
6. セル実行可能性および量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) 次の製造元のプロトコルを含む後続の生物学的解析を実行します。

8. PPy体内注入

1. T 細胞欠損の遠位中大脳動脈 (dMCA) 閉塞ストローク モデルを実行として成人男性裸ラット (NIH RNU 230 ± 30 g) は前述²。注入 1 週間ポスト dMCA オクルー ジョンを実行します。
2. 手術の前日は、ケージ水ラットにアンピシリン (1 mg/mL) を与えます。
3. 使用して誘導室にラットを麻酔イソフルラン吸入による投与の 0.5 - 3 %mg/kg。
4. つま先ピンチ反射応答の欠如によって、ラットの anesthetization を確認してください。
   1. 動物は、麻酔下では、その膜の色、呼吸パターン、および直腸温 15 分毎に監視を継続します。
5. Anesthetization を確認した後は、乾燥を防ぐためにラットの目に人工涙液を適用します。
6. 無菌が滅菌手袋、滅菌手術用ドレープ¹³を使用して、この手順の間維持されることを確認します。滅菌フィールド内で無菌手術器械を保ちます。
7. 麻酔下ラットですが、左の皮質上頭をドリルします。硬膜を開きます。
   1. マイクロ薄い手術用の針を使用して脳から硬膜を削除します。
8. インプラント システムの in vitroラット大脳皮質から導電性足場。
   注: 実験の日 3 hNPC めっき後体外から足場を注入しました。
   1. 脳卒中病変の内側半影野で主にインプラントを配置します。
9. 足場を配置すると後、は、皮膚縫合の動きを防ぐためにインプラントの上 surgicel を置きます。
10. 縫合傷がシャット ダウンし、ブプレノルフィン SR 定位手術と dMCA の閉塞に伴う痛みを管理するための 1 mg/kg の用量でラット皮下注入します。
11. 意識を取り戻すと、回復ケージにラットを配置します。
    1. 動物が離れないで意識ではありません。
    2. それは完全に意識を得ているまでは、他の人と動物を置かないでください。
12. 体重減少、減少食品/水の摂取量、削減グルーミング/ボサボサ コート、自発運動の減少/増加、異常姿勢、脱水/スキン ・ テンティング、くぼんだ目、隠れ、自傷などの痛みの兆候を毎日動物を監視します。急速な呼吸、開いて口呼吸、けいれん、震え、震えと発声。
    1. 食べる、飲む、グルーミング、体重; 表示されるまで毎日動物を監視します。毎週体重増加の後。
13. 飲んで食べてない、表示される任意の動物に CO₂吸入と (のような動物が正常な酸素供給のポスト CO₂吸入による復活しないようにする) euthanization の二次確認を介して初期の euthanization が発生して初期手術後の体重苦痛に表示されます。または運動皮質の赤字を予想よりも大きいため行動のテストを完了することができませんが表示されます。

結果

図 1に示す回路図は、hNPCs および潜在的なダウン ストリーム アプリケーションの電気刺激の全体的なワークフローを表します。幹細胞治療で現在の制限は、幹細胞が炎症や虚血性の条件を含む厳しい移植後環境にさらされていることです。そうこれらの困難な条件は、その治療効果^14,15を制限します?...

ディスカッション

成長の証拠として新規ストローク療法幹細胞の約束を実証しています。この約束は、少なくとも 40 進行中または完了した臨床試験とベッドサイドに幹細胞治療を進めるための主要な努力になりました。ストローク病理学では、幹細胞療法に向いている急性侮辱後回復を防止する神経変性プロセスがないためユニークな神経疾患を提供しています。幹細胞が強化された脳卒中の回復の正確なメ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706