単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

要約

デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

要約

感染症の抗体依存強化は、デング熱ウイルスの病因の主要な役割を果たすことに示されています。許容されない細胞の感染を強化する抗体や血清の容量を測定する伝統的なアッセイは、感染を定量化するプラクの試金に続いてメディアにウイルスの出力を使用してに頼ってきました。最近では、これらの試金は細胞を蛍光標識抗体を用いたデング ウイルス (DENV) 感染症を検討しています。これらの両方のアプローチには、これらの技術の広範な使用を制限する制限があります。ここでは、粒子を用いたデング ウイルス記者ウイルス (RVPs) 緑色蛍光蛋白質及び DENV 感染アカゲザルから得られた血清を用いた抗体依存強化 (ADE) を調べる K562 細胞を表す単純の in vitroアッセイについて述べるニホンザル ジカ (ZIKV) 感染後 16 週間。この手法は信頼性が高く、セルの最小の操作が含まれます、ライブ レプリケーション有能なウイルスの使用を含まない、フローサイトメトリーを用いた定量的な読み出しを取得する高スループット形式で実行することができます。さらに、このアッセイは、黄熱病ウイルス (YFV) 日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) など RVPs の利用など他のフラビ ウイルス感染症の抗体依存強化 (ADE) を調べる簡単に適合できます。アッセイのセットアップのしやすさ、データを分析し、結果の解釈になりますほとんどの実験室の設定に

概要

感染症の抗体依存強化 (ADE) は、ウイルスの血清型による部分的に交差反応性抗体がウイルス、高められたウイルスの複製とウイルス血症につながる他の血清型の取り込みを強化するというプロセスです。ADE は、広く 4 つの主要な血清型が流行しているデング熱ウイルス (DENV) 感染症に記載されています。患者のサブセット、ADE はデング出血熱 (DHF) に関連付けられています。ジカ ウイルス (ZIKV) の感染誘導 DENV ADE体外を引き起こし、DENV生体内でウイルス血症¹の強化に貢献した DENV 交差反応性抗体の有意に高い値であることが最近分かった^,2抗体依存強化試金、関連ウイルスの二次感染を強化とフラビ ウイルス感染症の発症機序に貴重な洞察力を提供し、通知に対する抗体の能力を評価する貴重なツール、。ワクチンの開発。

説明アッセイは、ここが感染症に通常許容 K562 細胞と一緒に DENV RVPs を使用します。RVPs が構造的にそのまま複製無能 DENV ウイルス粒子レプリケーション³の単一のラウンドの後に表示されるサブ ゲノム緑色蛍光タンパク質 (GFP) レプリコンをエンコードします。など、RVPs に感染している細胞は緑色の蛍光を発する、フローサイトメトリーや顕微鏡を使用して容易に検出することができます。この試金で使用される RVPs は、商業ソースから得られました。あってもいい、しかし、他のウイルスに対して生成され、本稿に記載されている試金で使用されます。一方、K562 細胞、抗体の Fc 領域に結合し、サブ中和抗体^4、5の濃度の存在下で感染 FcγIII 受容体発現の白血病細胞株であります。

ADE の試金は体外ADE のメカニズムを記述する重症のデング熱の危険因子を調査し、研究で広く使用されている^6,7,8。ここで説明した ADE アッセイ迅速かつ簡単に使える RVPs を使用して生体外で感染を強化し、フローサイトメトリー、現在、使用していずれかを必要とする他の試金と比較してプラーク形成による血清の容量を決定するにはVero 細胞や抗体の汚損の単位 (pfu) 感染細胞^{6,7,8,9,10、11}、どちらも時間がかかり、労働集中的です。

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プロトコル

ここで説明されたプロトコルを示すために使用する血清サンプルは評価・実験動物ケアの認定会で収容されたローカルの状態に従っての世話と連邦の方針であったアカゲザルから得られました。国際 (AAALAC)-施設を認定します。すべての動物実験したレビューし、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され共有プロトコル組織のサンプルが買収されました。

1 日 1

注: 次の BSL 2 実験室での培養に使用される滅菌流バイオのキャビネットで説明すべての手順に従います。

1. 室温で血清サンプルを解凍し、各血清試料 100 μ L を生殖不能の管に転送します。水浴または温度調整可能な thermomixer で 56 ° C で 30 分間熱を不活性化します。冷たい RPMI 10 (10% 牛胎児血清を RPMI) を使用して縮尺を 1:1 に至る血清サンプルの 10 倍のシリアル希薄を作る。
2. 滅菌 96 ウェル V 底プレートの各ウェルに 10 μ L の血清を希釈したサンプルを転送します。だけと、血清サンプルと RPMI 10 のみ RVPs と血清サンプルなしなし制御井戸、RPMI-10 RVPs との 2 つのセットが含まれます。各血清サンプルとトリプリケートで RPMI 10 コントロールを設定します。
3. -80 ° C の冷凍庫と雪解けからデング熱 1、2、3、4 の RVPs を削除するそれらを 37 ° C の水浴。すぐに氷の融解の RVPs に転送します。各血清サンプルの約 170 μ L RVPs を取得 (各血清希釈用 RVPs x 3 井戸の 10 μ L (1:1、1:10, 1: 100, 1:1, 000) ごとに RVP を RPMI 10 RVPs x 3 井戸の 10 μ L は井戸を制御するだけと)。
4. 各血清サンプルを含む 96 ウェル V 底板のもと RVPs (血清ない) コントロール井戸を RPMI 10 に RVPs の 10 μ L をピペットします。RVPs RPMI 10 だけに (ない血清サンプルとない RVP) 井戸を追加しないでください。上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。10 μ l 添加冷 (ない血清サンプルとない RVP) 制御井戸のみ各冷たい RPMI 10 に RVPs の代わりに RPMI 10。
5. 96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO₂の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。96 ウェル V 底プレートを培養すると、一方バイオ セーフティの 70% のエタノールでキャビネットの表面をきれいにし、15 分間紫外線を実行します。
6. インキュベーターから K562 細胞の完全に合流 T75 フラスコを削除、5 mL の滅菌ピペットを使用してセルをミックスし、セルの 5 mL を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。
   注: K562 細胞を RPMI 10 で維持し、1 x 10⁶/mL で継代します。
7. 滅菌 15 mL の円錐管から 10 μ L のセルを削除することによって細胞の数を数えるし、10 μ L tryphan ブルー ミックスします。15 mL コニカル チューブ内のセルの合計数を決定するための診断を使用してセルをカウントします。
8. 10 分間 〜 1,200 x g で細胞と円錐形の 15 mL を遠心、上清をデカント、暖かい RPMI - 10 メディア (2.66 × 10⁶セル/mL) の 80,000 のセル/30 μ L の濃度で細胞を再懸濁します。
9. インキュベーター (ステップ 1.6) から 96 ウェル V 底板を削除、96 ウェル V 底プレートの各ウェルに K562 細胞の 30 μ L を転送し、上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO₂の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
10. 1 時間インキュベート後 5 分のインキュベーターと 〜 1,200 × g で遠心分離から 96 ウェル V 底プレートを削除します。遠心分離の後に、10% の漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって井戸からメディアをデカントします。
11. 暖かい RPMI 10 125 μ L でそれらを再各ウェルの細胞を洗い、ピペット、徹底的に混ぜて、10% 漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって ~ 1,200 x g で 5 分間デカント メディアでプレートを遠心します。この洗浄ステップを 2 回繰り返します。
12. 洗浄後、それぞれに RPMI 10、上下をピペットで移しなさい、ミックス暖かいの 100 μ L を追加し、5% CO₂の存在下で 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい。

2 日目 3

1. 細胞とメディア/ウェル インキュベーターから 100 μ L を含む 96 ウェル V 底板を削除し、バイオ セーフティ キャビネットに移動します。ミックス、マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれの内容もセルを転送し、96 ウェル U 底面にメディア プレート済みラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブ。
2. 1% の 100 μ L で 96 ウェル V 底プレートの各ウェルを洗浄パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) そして最終をもたらすステップ 2.1 から 96 ウェル U 底プレートまたはラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブにそれぞれの井戸に転送 × 1濃度 0.5 %pfa/ウェルまたは管。マルチ チャンネル ピペットを使用して徹底的にミックス、カバー プレート、アルミ箔を 30 分セルを修正するためのインキュベーター内に座らせてください。
3. 準備流れの cytometer (例えば材料のテーブルを見なさい) 無染色の K562 細胞側と前方散乱と蛍光設定のキャリブレーションを実行することによって。必要なだけ蛍光チャネルは、GFP は、細胞から放出される唯一の蛍光 FL1、です。取得 ~ 30, 000-50,000 各サンプルからの細胞します。
   メモ: 単一蛍光を読み取ることができる任意の流れの cytometer は、RVPs 感染細胞が GFP の存在のために緑の蛍光を放出するのみ、他の蛍光チャネルを必要としない、データの集録に使用できます。

3. データ分析

1. 流れフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で取得したデータを分析 (材料の表を参照してください)。
   1. セット最初のゲートは対 FSC H (前方散乱-高さ) を単一細胞分析¹²から自動蛍光ダブレットを含めたり除外する FSC A (前方散乱-エリア) に基づいています。その後、SSC A に基づいて一重項ゲート セルをゲート (側方散乱-エリア) vs される破片を除外する FSC の。
   2. SSC A 対 FSC A ゲート細胞を分析する SSC の対に基づく GFP の表現 GFP A.GFP 陽性細胞の周りにゲートを設定することによって各希釈血清とコントロール サンプルの GFP 陽性細胞の割合を決定します。
2. 帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の合計を 3 で除して各血清サンプルの希釈やコントロール井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値を決定します。
3. RVPs (血清サンプルはない) コントロール井戸を RPMI 10 の GFP 陽性細胞の割合の平均値で割った各希釈血清サンプルで GFP 陽性細胞の割合の平均値を割ることによって感染の倍充実を計算します。
4. 希釈 (x 軸)、対倍強化 (y 軸) をグラフし、多重比較のためのテューキー事後テスト続いて ANOVA を使用して統計分析を実行します。

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結果

4 リーサス macaques、マカク属 ZIKV 感染後収集した 16 週間をされ、その潜在的な DENV 1 を強化するテストの血清、K562 細胞における感染の 2、3、4。動物では、感染後 7 日で検出限界以下であったレベルに低下した感染後 3 日目に 〜 10⁵枚 ZIKV RNA/mL プラズマの x 1 のピーク血を持っていた。16 週間感染後の血漿中ウイルス血症が見つかりませんでした。RVP アッセイ...

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ディスカッション

DENV や ZIKV などの発現は、両方の構造および非構造タンパク質^13,14お互いと交差反応する抗体を生成する相同性の重要な証拠を共有します。これらの交差反応性抗体応答を高めるために示されている感染症の両方との in vitro異種血清または他関連発現^1,2。クロスの感染を高める可能性のある?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348