齧歯動物の睡眠時間の非侵襲的で高スループットの測定

要約

睡眠測定活動ベース ホーム ケージの監視の高スループット方法について述べる。このメソッドでは、脳波・ ベースの従来の方法上の利点を提供しています。それは総睡眠時間の定量検証するには、ひと疾患の齧歯動物モデルで睡眠を監視する強力なツールをすることができます。

要約

伝統的に、睡眠は、脳波計 (EEG) によって監視されます。齧歯動物の脳波の研究では、長い回復期間続いて電極の外科的移植を必要があります。脳波記録を行う動物は、ヘッド マウントに不自然なテザーを作成する受信機に接続されます。脳波モニタリングは時間がかかる、運ぶ、動物を危険にさらすし、睡眠の測定のため完全に自然な設定ではありません。代替方法のハイスループット ファッションで特に睡眠を検出する睡眠研究分野大きく前進するでしょう。ここでは、アクティビティ ベースの家ケージの監視を介して睡眠を検出検証法について述べる.以前の研究では、このメソッドを介して睡眠では、伝統的な脳波ベース メジャーによって定義される睡眠の契約の高度を示しています。このメソッドは、総睡眠時間の検証が、一方より時間解像度を持つ脳波睡眠時間の長さを評価することに注意してくださいすることが重要です。急速な目動き (レム) とレム睡眠、睡眠の正確な性質についての詳細を与えて、脳波は区別もできます。それにもかかわらず、アクティビティ ベースの睡眠測定は邪魔されずに睡眠の複数の日を分析し、(ストレス) のような急性のイベントへの応答として睡眠を評価するために使用できます。ここでは、毎日腹腔内注射マウスの応答を検出するこのシステムの電源を示します。

概要

睡眠は体と脳の覚醒¹毎日の負担を次の復元のための重要な機能です。それは、睡眠が記憶力と一般的な脳の可塑性¹の役割を果たすことが示されています。脳波は、睡眠²を検出するためのゴールド スタンダードです。齧歯動物、脳波モニタリングには、ヘッド マウント後動物必要²を回復する時間の期間に貼付電極の外科的移植が必要になります。リカバリ後動物録音デバイスに接続し、別を与えられる慣れ²の期間。回復と慣れのこれらの必要な期間のため脳波は時間がかかり、骨の折れると大規模な合理的に実行できません。さらに、電極注入の手術は動物に固有の危険を運ぶ。最後に、脳波の研究で睡眠をスコアリングのためのデータ分析も非常に骨の折れるです。代わりに、睡眠を監視する非侵襲、高スループット方法大きく齧歯動物の睡眠研究を支援しました。

脳波研究の制限に対処する、アクティビティ ベースの家ケージ監視システム睡眠を検出するために使用します。単純な前提は、アクティブでない動物は眠っている動物である可能性が高いです。それはそれを示されている 40 (10 秒エポックのビニング) 連続的な非アクティブの s は、睡眠脳波 (88-94% の契約に示されている)³によって測定した、信頼性の高い測定。ホーム ケージ ・監視システムは、最小限のセットアップ時間と動物の大規模なグループを研究する使用できます。我々 は、動物約 1 日かかります脳波研究²に必要な回復の週間と対照をなしてホーム ケージ監視システム⁴の住宅に慣らすに示されています。さらに、いくつかのセットアップは、体温、心拍数、利用状況、給餌などの生理学的パラメーターも検出できます。温度と心拍数は、小型送信機の移植から決定されます。これらのパラメーターは、マウスに関するより多くの情報を提供でき、さらに睡眠とそれの影響を理解するために追加する睡眠記録と並行して使用する可能性があります。

それは強力なツールが、アクティビティ ベースの家ケージの監視から取得できるデータの種類に制限があります。脳波の研究は、レムと非-レム睡眠、睡眠構築のより深い理解のために重要かもしれない区別できます。アクティビティ ベースの家ケージ ・監視システムだけ総睡眠時間のデータを提供できます。さらに、ホーム ケージ監視のアクティビティ ベースの出力を与えるについては睡眠時間の長さが、40 秒間隔³の固有の限定のためを試合時間正確に把握できません。これらの制限にもかかわらずホーム ケージが睡眠時間の監視動物の健康および行動⁵を含む多くの下流因子に影響を与える可能性があります重要な生物学的指標を提供します。

アクティビティ ベースの家ケージの監視は、その多様性を示す多くの研究で睡眠を検出する使用されています。私たちはこれらの研究^{4,6,7,8,9,10、11,}の¹²のサンプルを引用します。紹介した方法も独自の制限^13,14を含む各監視アクティビティ ベースを介して睡眠を検出の他の方法があります。長時間 (72 時間) 連続睡眠は、24 h のブロックのいくつかを調べる睡眠中これらの研究のいくつか調べる。本研究では、毎日腹腔内 (IP) 注射と脆弱 X 症候群 (Fmr1 KO マウス) のマウス モデルにおける変更が定期的なケージに対応した 24 時間の期間ごとに睡眠解析を提案します。睡眠⁴を減らした、仮説に感覚情報¹⁵に超反応するのでFmr1 KO マウスを選びました。我々 のデータでは、ストレスの多いイベントに応答の睡眠パターンの変化を検出する能力を強調表示します。このメソッドは、マウスの大規模コホートで睡眠についての一般情報を取得に最適です。メソッドは、睡眠に特定の遺伝子変異、薬理学的治療法やストレッサーなどのイベントへの応答の効果の効果を理解するために役立ちます。さらに、メソッドはより複雑の研究を開始する前に検診の応答の簡単な手段を提供します。

プロトコル

すべての手順は、国立研究所の精神健康動物ケアおよび使用委員会によって承認され、ガイドラインに沿って行われ、国立機関の健康ケアの動物の使用。

1. 睡眠検出ユニットの設定

1. ユニットとソフトウェアの必要な数を購入します。
2. 監視システムを設定する指示に従います。
   1. エミッタの反対側の検出器の位置を合わせます。赤外線ビーム内側に直面している同じ高さに揃えて配置されることを確認します。
   2. 付属のネジを使用して、金属製のスタンドの高さの探知器およびヒーターを配置します。この高さは、ケージのベッド、赤外線ビームを下回って、ビームが動物の活動を検出する適切な高さに調整必要があります。これにより、27 cm × 32 cm の内部領域 (10.625 × 12.75 で)。
      1. さらにネジが必要な場合、ハードウェアでより購入保存 (鍋頭ねじの ¼ 6-32)。
3. 各エミッタと各検出器を接続します。エミッタを受信機にリンク指定したハブに接続します。X、y 平面のこれを実行します。すべてのセットアップのためには、この手順を繰り返します。
4. 受信機を付属の USB ハブをコンピューターに接続します。

2. ソフトウェアのセットアップ

1. 解析ソフトウェアをインストールし、既定として指定されたハードウェア構成ファイルを選択します。ハードウェア構成ファイルは、当社によってのみ変更する必要があります。
2. ファイルをクリックして |実験構成を開く。既定の実験構成を開きます。
3. 実験をクリックして |プロパティ。
4. 10スキャン レートを変更して] をクリックスキャンタブ s。
5. 10活動サンプリング レートを変更] をクリック、[活動] タブ s。
6. ファイルをクリックして |実験として保存今後の実験計画のこれらの設定を保存します。

3. 動物のセットアップ

1. 単独で 31 cm (12.25 インチ) の長さは 16.5 cm (6.5 インチ) 広い、きれいなケージ内マウスを家します。寝具を構築し、ビームを妨害からマウスを防ぐためには、3 mm の深さで寝具を使用します。マウス用追加ネスト材料を提供しません。
2. 食糧へのアクセスを持つマウスを提供し、梁の邪魔にならないケージの上部にかかっているワイヤ供給装置による水の自由。必要に応じて、食品を補充し、ケージが研究の期間中すべての 3-5 日を変更された場合、水のボトルを変更します。
3. マウスの完全なカバレッジを梁のほぼ真ん中にかかっていることを確保する設定、赤外線ビーム ケージに合わせます。
4. 光マウスの通常の住宅事情の光暗い周期をミラー化または実験に基づいて必要に応じて変更部屋の暗いサイクルを設定を確認します。

4. 医薬品の準備と注射

1. 滅菌水と滅菌シクロデキストリンを取得します。
2. すべて注射 25.5 30.5 G 皮下針を 1 mL の注射器を使用します。それぞれのマウスには、新しい滅菌針と注射器を使用ください。
3. 注射の間の時間を減らすためには、事前にすべての注射器を組み立てます。
4. シクロデキストリン注射用: 30% シクロデキストリン水溶液を作るために水 10 mL にシクロデキストリンの 3 g を追加することによってシクロデキストリン ソリューションを準備します。
5. 0.3 mL の生理食塩水または IP 注入によるシクロデキストリンを管理します。

5. ソフトウェア レコードの睡眠に

1. 既定のハードウェア構成ファイルを開きます。
2. ファイルをクリックして |実験構成を開く。希望を開くか、または実験構成。
3. 実験をクリックして |セットアップ。
   1. データ ファイルの保存場所とバックアップ ファイルを保存する場所を指定します。ソフトウェアでは、データ ファイルが特定のプログラム フォルダーの下のプログラム ファイルに格納する必要があります。
      注: 一部のコンピューターは、敏感なプログラム ファイルを表示、ことを考えるデータ ファイルにアクセスできない可能性実験の後。したがって、ローカル コンピューター上、機密ではない別の域にバックアップ ファイルを保存することをお勧めします。
   2. 動物を指定各睡眠する ID 商工会議所し、必要に応じて動物の重量を入力します。チェック ボックスをオフでチャンバー実験で使用されていない、その商工会議所が無効にされます。識別情報を入力すると、完了をクリックします。
4. ファイルをクリックして |実験として保存目的のファイル名の下の現在の実験構成を保存します。
5. 実験をクリックして |実行またはf5 キーを押して録音を開始します。すべての部屋が活動を選んでいることを確認する 10 s 新紀元のため待機。動物だけ注入して、動物が移動する赤外線ビームにより検出する十分な可能性が高いです。
   1. アクティビティが検出されない場合は、ビームを拾う動きを確認する手動でマウス ケージを移動してください。トラブルシューティングを続行またはアクティビティがまだ記録されていない場合、作業室に移動します。
      注: は、注射が終わったらすぐに実験を実行します。
6. コンピューターの画面を光を遮断する不透明なカバーでカバーします。アクティビティ メーターのライトが点滅をカバーします。
7. 24 時間の実験を実行します。
   注: 注射を実行に必要な時間が、まい完全 24 時間。注射は、毎日同じ時間に実行する必要があります。注射時に睡眠を記録されませんする必要があります。
8. 次の日は、注射の時にクリックして実験 |停止録音を終了するします。ファイルをクリックして |エクスポート |対象の csv ファイルを生成各マウスの生データを収集します。
   注: エクスポート、すぐにこれを行うし、コンピューターを処理している間注射を続行するいくつかの時間がかかることがあります。
9. ファイルをクリックして |エクスポート |睡眠生を開くことによって各実験のため睡眠ファイルにエクスポートします。CDTA ソフトウェアがインストールされている任意のコンピューター上のデータ ファイル。
   1. 検出パラメーター アクティビティのソースの下には、x 軸と y 軸の両方のボックスがオンになっているを確認します。
   2. しきい値新紀元の睡眠、下 4 新紀元が選択されていることを確認します。
   3. 睡眠活動しきい値の下、0 の数が選択されていることを確認します。
   4. 明暗サイクルを、[明暗サイクルの適切な時期を確認します。
   5. 解析ウィンドウ、[分析の目的の時間を選択します。注入試験の場合に、既定値として日を残します。ExpSTART としては、開始時刻を設定します。24:00 24 時間解析ソフトウェアは、最大 72 時間のため行うことができますを使用するための期間を設定します。
   6. データをエクスポートするための時間を節約する設定を保存します。
   7. [更新] をクリックします。
   8. CSV ファイルを生成をクリックし、目的の場所にファイルを保存します。

6. データの分析

1. 記録セッションごとに睡眠ファイルを開きます。サブジェクトの ID を割り当てる、各商工会議所のサブジェクト ID を決定するための個別の CSV ファイルを開く両方のライトのTOT 睡眠 hh:mm:ssとすべての動物の暗い段階を記録します。
   1. 不整合記録の失敗を示す個々 の主題の CSV ファイルを確認します。ハイビームのカウントが 1 つの平面で検出された他の平面上のカウントが発生しない場合は、これはビームのエラーを示します。
      注: 光と闇の両方の段階を含んでいるトータル レコーディング期間に対して計算されて「% 眠っている」と暗期の。12 h 明暗サイクル 12 h 光または暗期で「% 睡眠」を得るための 2 によってこの数を乗算します。注射の研究完全 24 時間計算のため行っていないことを考える"% が眠っている"ことは正確ではありません。正しいを生成する「% 睡眠」除算「TOT スリープ hh:mm:ss」、"実験経過時間: hh:mm:ss"、2 で乗算して、% を取得する 100 を乗算します。光の段階で注射を行い場合、光の位相のみをこの方法で調整する必要があります。
2. 別の日、フェーズが互いに比較されるので各フェーズと各日のパーセントの睡眠の持続期間を分析します。

結果

睡眠と動物が注射に慣らすかどうかで毎日の注射の効果を決定する 9:00 (6:00 で始まったライト サイクル) で 14 日連続毎日 IP 注射を実行 12 Fmr1 KO c57bl/6 j マウスの睡眠時間を記録しました。用いて、被験者のデザインの中で通常の生理食塩水で連続 4 日間のそれぞれの動物を注入する. (1-4 日) と次の 30% シクロデキストリン、連続 10 日間 (5-14 日間)。シクロデキ?...

ディスカッション

非侵襲、高スループットの家-檻の中の活動の監視に基づく睡眠時間の測定法を紹介します。総睡眠時間の評価のこの方法は、脳波研究³に対して検証されています。アクティビティ ベースの家ケージの監視は単純な非侵襲的、および多数の動物の人口調査に適用されます。それは限られた睡眠 (睡眠発作持続時間と睡眠段階) などについて詳細な情報を与えることはできませ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Equipment and software to analyze sleep duration
Captisol Research Grade	Captisol	RC-0C7-100	Captisol for dissolving hydrophobic compounds
30 G BD Needle 1/2 inch	BD	305106	Needle for injections
BD Disposable Syringes	Fisher	14-823-30	Syringes for injections
B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Labs	3025	Fmr1 KO mice
Super Mouse 750 Mouse Cage	Lab Products, Inc.		Homecages for the mice
SANI-Chips Bedding	PJ Murphys		Bedding for the mice