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要約

複数の世代の発達段階別に表現型の出力の範囲で露出の影響を勉強の目的と汚染物質にショウジョウバエ属の種を公開するため本稿では、詳細なプロトコルを提供します。

要約

創発特性と外部要因 (人口レベルおよび生態系レベルの相互作用、特に) 毒性学的研究のほとんどと見なされますが、生態学的重要なエンドポイントを調停する際に重要な役割を再生します。キイロショウジョウバエ毒性、少数を示すための行動、神経学的、および遺伝的影響のため毒性モデルとして浮上しています。もっと重大に、ショウジョウバエ属の種は、統合フレームワークのアプローチ創発性を組み込むし、毒性研究に生態学上関連した質問に答えるのためのモデル システムとして利用できます。本稿の目的は、表現型の出力や生態学的に関連した質問の範囲にモデル システムとして使用する汚染物質にショウジョウバエ属の種を公開するためのプロトコルを提供することです。具体的には、1 にこのプロトコルを使用することができる) 複数の生物学的レベルの組織をリンクし、両方の個人および集団レベルのフィットネス; の毒性の影響を理解2) 発達暴露; のさまざまな段階で有害物質の影響をテストします。汚染物質; 3) テスト多世代と進化への影響・ 4) 同時に複数の汚染物質およびストレスをテストします。

概要

毎年、約 1,000 の新しい化学物質化学工業1,2; によって導入されます。しかし、これらの化学物質の数が少ないと環境への影響は、分布2,3の前にテストされます。大規模な災害が一般的な多種多様な汚染物質に致死と慢性的な暴露は人間と野生生物4、5の両方で広まっています。生態毒性および環境毒物学の歴史の焦点だった生存6,の汚染物質の影響を測定するための手段として致死、単一の化学物質の暴露、急性暴露、暴露、生理学的効果をテストするのには7,8,9,10. 開発、創発性、外部要因、動物実験に倫理的、非侵襲的なアプローチへの移行が、現在のアプローチを役割のため制限している (人口レベルなど、生態学的重要なエンドポイント8を媒介に生態系レベルの相互作用) を果たします。したがって、野生動物や実験室での脊椎動物を犠牲にしないでより包括的なアプローチを組み込む方法の必要性があります。

ショウジョウバエなどの無脊椎動物モデル システムは、毒性試験により包括的なアプローチの必要性に対処するための魅力的な代替手段です。キイロショウジョウバエ、元々 約世紀前の人間関係の遺伝的研究無脊椎動物モデル システムとして開発されました11。キイロショウジョウバエは目立つようにいくつかの理由のため使用脊椎動物モデルの代替として今: 1) 遺伝子とキイロショウジョウバエと人間間の経路の保護2) 短い世代時間の脊椎動物モデルと比較して3) 安価なコストでメンテナンス。4) 大規模なサンプル サイズを生成する際に緩和します。・ 5) 表現型- および生態学上-関連するエンドポイント11,12,13,14,15,16,17 をテストできるの茄多.

いくつか研究所11,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25今使用しているキイロショウジョウバエ脊椎動物モデルの代替として毒性試験のため人間の汚染の影響を理解します。地元の野生しょうじょうばえのことが出来、同様、生態学的に答えるため野生動物 (と人間) の毒性モデルとして-、行動-、および組織の複数の生物学的レベルでの進化的関連の質問。モデルとしてのショウジョウバエ属内の種を使用して、いくつかの測定可能なエンドポイントが可能な11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25。毒物ショウジョウバエモデルを使用して、in addition、ことができます: 1) 倫理的組織の複数の生物学的レベルでの効果のリンク2) 創発的要因との開発の役割を組み込む3) 研究 (医学的に重要なエンドポイント) だけでなく生態学的重要なエンドポイント4) 同時に複数のストレスをテストします。5) および長期テスト世代 (例:進化および継代) ストレッサーの影響。したがって、モデル システムとしてショウジョウバエを使用すると、多数のアプローチ、研究室で、キイロショウジョウバエの近交系と機械的なアプローチを勉強に限定されないができます。

飼育、ショウジョウバエ毒性の様々 な質問に答えるための収集法を提案します。具体的には、1 の方法論について述べる) 媒体の 1 つ以上の汚染物質混入のショウジョウバエの飼育2) 開発 (例えば3 齢幼虫、蛹の場合、新しくこの大人と成熟した大人を徘徊); 全体ショウジョウバエを収集・ 3) テスト世代次世代伝送と毒性物質の長期吸入暴露の進化的意義に汚染された培地でショウジョウバエを飼育します。このプロトコルは、以前著者18,19,20,21,22,23,24を使用して,25を報告しています。発達の生理学、遺伝子および行動効果の違いは鉛 (Pb2 +) 露出です。このプロトコルは、どのように汚染物質が人間およびますます汚染環境で野生動物のための危険因子を理解するために不可欠であるより全体的な毒性学的アプローチを使用する毒物をできます。

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プロトコル

次のプロトコルは、毒素の経口摂取が適切なときに汚染されたメディアにショウジョウバエ属の種をリアに使用される実験的プロトコル露出の他の形態は、ショウジョウバエモデル11,15,16,26を使用可能です。このプロトコルで説明する方法は、以前ハーシュらによって記述されています。19とピーターソンら23,24,25。

1. 研究室でショウジョウバエのストック個体数を設定します。

  1. 一定の温度、光: 暗いサイクル テスト種の好みに応じて湿度にインキュベーターを設定することによってショウジョウバエの個体数をストック家にインキュベーターの環境制御 (または小さな部屋) を設定します。
    注: 最寄りの環境条件によって異なります研究選択種の本来のエコロジー。たとえば、キイロショウジョウバエはサハラ以南のアフリカ27にネイティブとは通常、25 ° C、12:12: 明暗サイクル、および約 60% 湿度16,18,19,20で管理,21,22,23,24,25,28,29,30します一方、 D. montana範囲は広がるカナダおよび米国中西部、、くらいの寒い地域のほとんど。したがって、 D. montanaは通常 19-20 ° C と時々 24 h 光政権の交尾シーズン31中条件をシミュレートするために維持されます。ショウジョウバエの様々 な種の地理的な範囲の詳細な説明、ショウジョウバエ種分化パターンのウェブサイト32を参照してください。
  2. どちらか在庫センターから最寄りのショウジョウバエ種や近交系ラインを入手 (材料の表を参照)、フィールドから要求、または収集野生遺伝子変数集団に別の研究所。
    注: 次の手順は、研究所を維持するショウジョウバエの野生では、遺伝的変数集団を収集する方法を説明します。これらのメソッドは、1 つの餌のソースとターゲットの特定の種ではなく種の広い多様性を一度に収集する Markow ・ オグレディ33ヴェルナー ・ Jaenike34から変更されています。
    1. 一晩冷凍庫で半ダース熟したバナナを凍結し、餌トラップを設定する前に解凍します。
    2. 餌ボトルとエスケープではありませんでキャプチャするハエを許可するようにボトルの前の u 字状のスリットを切断することによって複数の 1-2 L のペットボトルを準備します。ハエが蓋を介してエスケープしないので、ボトルのキャップ、ペットボトルをキャップします。
    3. ボトルの底にはバナナの約 1 インチが含まれていますように、ボトルの底に吉濱バナナを追加します。瓶の中には、完熟トマトのスライスを配置します。酵母液に浸して、バナナを取得しますので、ボトルの底にバナナ酵母スラリー (ビール製造プロセスから残りの酵母) を追加します。
    4. ハエを酵母やバナナから離れて歩くきれいな基板を持っているので、ボトルに (直立した垂直方向の位置) に木の棒を追加します。
      図 1は、これらのメソッドの最終的な製品を示しています。
    5. 餌木でボトル一夜にしてすべて 24 時間口吸引瓶の外に飛ぶハングし、個別に iso 女性行を作成する中で女性を配置します。
      注: 複数の女性のライン作成できます、ただし、それぞれの種の女性は明確に識別することができる場合にのみ。さらに、ショウジョウバエ属内でハエの生態的ニッチを占めるやそれらのニッチ (ヴェルナー ・ Jaenike34); に応じて栄養要件が異なりますヴェルナー ・ Jaenike34ダイエットの推奨事項と料理のレシピを参照してください。
    6. 収集したショウジョウバエの種を識別するために解剖顕微鏡の下で成人の F1の子孫を調べる (Markow ・ オグレディ33と様々 な種を識別するに援助をヴェルナー ・ Jaenike の34を参照してください。).

figure-protocol-2873
図 1: トラップとフィールドにおけるショウジョウバエの野生の人口を集めるための餌の絵画表現。(A)フライ トラップ セットがコロラド州のローカル フィールドのサイトです。(B)ハエの緊密なビューは、この現場でセットをトラップします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. Iso 女性やインキュベーターの環境制御や部屋の一定の温度と湿度、: 明暗サイクルで複数女性のラインを維持します。これを行うには、家は、バイアルに飛ぶまたはボトルで媒体を優先、培地で卵を産む妊娠女性を許可します。幼虫と蛹の存在のバイアルを監視します。
    注:ショウジョウバエ属内のハエ生態的ニッチを占めるし、異なる食事の要件とそれらのニッチ33,34によって環境の非生物的環境設定があります。環境設定と食事に関する勧告 (とさらに飛ぶ飼育上の命令) は、エルジン アンド ミラー28で見つけることができます・ シェイファーら。29ストッカーと勇敢な30Markow ・ オグレディ33ヴェルナー ・ Jaenike34野生で捕獲された種を使用して、種を識別できるまで、ローカルの環境条件は、インキュベーターでシミュレートできます。
  2. 新鮮な媒体に頻繁に株式を譲渡、健康的なラインを維持する古い瓶を破棄し、ダニから感染を避けるためです。
    注: 転送の周波数は、種のライフ サイクルによって異なります。たとえば、新鮮な媒体には、キイロショウジョウバエは 2 週間ごと転送します。研究室では、ラインを維持するの詳細については、ランドらを参照してください。16、エルジン アンド ミラー28、シェーファーら。科学教育、グリーン スパン35ストッカーと勇敢な30 29データベース36。

2. リアショウジョウバエ汚染中

注: 新しい contaminant(s)、初めての研究室でショウジョウバエをテストした場合識別する致命的な線量 (カスタネダらを参照してください。37と Massieら38メソッド) と LD50 (カスタネダらを参照してください。37 ・ エイキンスら。39メソッドの) 最初。その後、目的の表現型出力; 生物学的関連性の高い濃度を識別するために用量反応曲線を実行します。ハーシュらを参照してください。19と周ら。40のメソッド。

  1. 汚染物質の化学的性質によって、目的の concentration(s) にある汚染された媒体の貯蔵液を準備します。
    注: たとえば、PbAc の貯蔵液の準備: 汚染水に達すると必要な濃度で作られた媒体まで蒸留水 (dH20) に汚染物質を追加することによって酢酸鉛 (PbAc) 媒体の貯蔵液の準備します。たとえば、1,000 μ M の原液 PbAc、できることにより調製 PbAc dH20 1,000 μ M に達するまで PbAc。さらに、原液 (例えば1,000 μ M PbAc ソリューション) を必要な濃度に希釈 (500 μ M など PbAc) と同様に在庫としてこれらのソリューションを維持します。
  2. メディア コントロール メディアとして機能する製造元のガイドラインの準備します。次の製造元のガイドライン追加メディアを準備します。ただし、サプリメントは、dH20 汚染ソリューションを準備しました。
    注: たとえば、インスタントショウジョウバエ媒体を使用している場合約小さじ 1 インスタント培地に追加プラスチック バイアル。培地に約 5 から 5.5 mL dH20 を追加します。ライブ コントロール メディアの準備の酵母の数粒を振りかけます。実験的メディアの準備、在庫ソリューションを補完 (500 μ M など PbAc) dH20。
  3. コントロールと実験中にストック個体から繁殖可能な成熟した男性と女性を転送します。
    注: 生殖成熟に時間後羽化ショウジョウバエ種41間が違います。
    1. やさしく利き手でダウン在庫ハエのバイアルをタップします。バイアルの下部に自動的に、ハエの移動を確認します。他の手では、バイアルをタップしながらバイアルのキャップを取り外し、ハエとバイアルの上にコントロールまたは汚染された培地の新鮮なバイアル。一緒にバイアルを保持し、それらを裏返して、やさしくタッピング、ハエはコントロールまたは汚染された培地の新鮮なバイアルに自動的に転送されます。まだハエのバイアルをタップ、バイアルをキャップします。
    2. 各バイアルにハエの数を標準化することを確かめる複数のバイアルを繰り返します。
      注: 大人数の合計転送経由でシングル転送または麻酔、混雑を避けるため使用バイアルのサイズによって異なります。
    3. 24-96 h の中に産卵する相手に大人ができ、標準的な環境条件 (すなわちインキュベーター) で大人を孵化させなさい。
    4. 24-96 時間後破棄遺体安置所 (鉱物油を充填し、タイトなフィッティング漏斗でキャップ フラスコ) で大人を残して受精テストの成熟する卵 (これは後で実験の被験者になる)。開発する卵を許可するインキュベーターでバイアルを配置します。
    5. メディアから浮上している幼虫を探してさまよう幼虫の瓶を監視します。

3. さまざまな発達段階で被験者を収集します。

注: 実験科目は、あらゆる発達段階、ブラインド コード化された 15 mL コニカル チューブに配置され、蓄積のためにテストで収集することができます。汚染物質の蓄積をテスト用のメソッドは、研究されている汚染物質によって異なります。たとえば、PbAc の蓄積は、Inductively-Coupled プラズマ質量分析法 (ICP-MS)42を使用してテストできます。さらに、実験科目は様々 な汚染物質の表現型効果をテストするすべての発達段階で収集することができます。図 2は、43ショウジョウバエのライフ サイクルを示しています。図 3は、露出のための実験プロトコルとコレクションの異なる発達段階を示しています。

figure-protocol-6782
図 2:キイロショウジョウバエ(最も一般的に使用されるショウジョウバエモデル システム) のライフ サイクルの概念の概要します。ショウジョウバエのライフ サイクルの段階である: 卵 1)、2) 初令の幼虫、3) 第二齢幼虫、5) 放浪 3 齢幼虫 4) 3 齢幼虫 6) メジロ蛹, 7) 赤目さなぎ、8) 新しくこの大人、および 9) 成熟した大人です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-protocol-7282
図 3: 経口両方の親 (F0) とその後の世代に汚染されたメディアにショウジョウバエを公開するための方法の概要 (F1以降).(A)公開された世代で開発中の経口暴露法(B)子孫 (希望の世代に1 F) に汚染物質の転送をテストする方法。この図は、ピーターソンらから変更されています。24この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. 徘徊 3 齢幼虫を収集します。
    1. ライト オン、インキュベーター内に幼虫が中から出てくる、インキュベーターでライトをオンにした後、h 内瓶の側面に上方に移動するとき、バイアルを監視を開始します。この時間以内には、慎重に木の棒やピンセットを使用バイアルの側面から放浪 3 齢幼虫を削除します。
      注: 幼虫のコレクションの使用可能数が「2.3.4」中に産んだ卵の数によって異なります。
    2. 幼虫から余分な培地を取り除き、dH2O を注ぐ dH2O ビーカーから小さなビーカーに幼虫を配置し、繊細なタスク ワイパーに幼虫を配置します。幼虫から余分な dH2O を削除優しく繊細なタスク ワイパーを使用すると、します。
    3. 環境制御のインキュベーターで実験的集団を維持します。
  2. 新しくこの大人が収集します。
    1. バイアルの両側に沿って蛹の呈色反応を観察することで羽化のバイアルを監視します。
      注意: 開発時に蛹が暗くなります。発生時間、特に前羽化は、試験動物種によって異なります。
    2. 最初の大人は eclose を開始するときは、ダンプし、鉱物油を含む遺体安置所にこれらの大人を破棄します。
    3. ライトは、次の朝、インキュベーターでオン、ダンプし、可能性がありますは、この一晩または morningbefore ライト中に年齢不詳 (または処女) の大人を破棄します。
    4. 約 4 時間後、バイアルに CO2銃で新しくこの大人として浮上している成人を麻酔します。解剖顕微鏡の下で CO2プレートに大人を配置します。男性と女性の ovipositors の前肢に櫛を探して大人をセックスします。
      注:キイロショウジョウバエは、交配を避けるために羽化の 6 時間以内に収集する必要があるかもしれない他の種もはや発達回 (およびそのため、この時間枠の内で収集する必要はありません)。
    5. 木の棒を使用して CO2皿の上別の大人。優しくセックス固有のグループの中の一致する既存の歴史に木の棒を使用して大人を転送します。
  3. 成熟した大人の後羽化を収集します。
    1. 環境制御のインキュベーターで希望年齢後羽化に卵の段階から中の一致する前羽化露出のままに大人を許可します。
    2. 単独で大人を自分の体を過剰な汚染された媒体を新郎に大人を許可するようにテストの前に 24 時間制御媒体に転送します。

4. リアの多世代の影響や継代露出をテストする実験科目。

  1. 親の世代 (別名 P0または F0世代) をリアに「2.3」と「3.3」に「3.1」コントロールと「2.1」の手順に従って実験中にストックの集団から大人を転送します。
  2. 大人が生殖成熟 (Pitnickらを参照してください。41)、単独でのコントロールや実験中の新鮮なバイアルに男性の転送 (前述の 2.3.1) バイアル。単独男性を含む新鮮なバイアルに女性の 1 つのバイアルを転送します。24 96 h. ダンプの中でチームメイトと卵を産む大人を許可し鉱物油を含む遺体安置所に大人を破棄し、再開発する子孫を許可するバイアルをインキュベートします。
  3. 4.1 4.2 世代数の目的に応じてからの手順を繰り返します。

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結果

口頭でショウジョウバエを公開すると開発中の contaminant(s) に、生物学的組織のさまざまなレベルでショウジョウバエを公開することによって様々 な毒性学的質問をテストできます。このセクションは、以前に発行された論文23,24にこのプロトコルを使用して得られた代表的な結果を示します。特に、このプロ?...

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ディスカッション

キイロショウジョウバエは、遺伝子とキイロショウジョウバエと人間の13,14間の経路の広範な保全のための生物学的プロセスの範囲の強力なモデルとして確立しています。同じ理由で医学、強力なモデルである、ショウジョウバエは、毒性のエンドポイントの範囲で人為汚染の影響を研究する適切なモデル システムとして浮上?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この出版物は教育省からの助成金によって支えられた (広報賞 #P031C160025-17, プロジェクトのタイトル: 84.031 C) アクティブな幹のビルド婚約 (C ベース) のコロラド州立大学プエブロ (CSU-プエブロ) コミュニティに。我々 は現在動物に感謝、エルゼビア代表の結果を使用する権利を提供するためは、このプロトコルを公開する機会をご提供するゼウスのエディターと同様、以前の論文で出版します。クレア Varian ラモス博士、博士バーナード ・ Possidente (生物学科、スキッドモア カレッジ)、トーマス ・ グラジアーノ C 基本プログラム、博士ブライアン ・ ヴァンデン ・用いた (C ベース、生物学科、CSU プエブロ)、CSU プエブロ生物学部に感謝したいと思います(生物学科、コロラド州立大学プエブロ) の支援と援助です。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24Carolina Biological173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unitGenessee Scientific32-116SBUsed to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vialsGenessee Scientific49-102Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrowGenessee Scientific32-124Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrowGenessee Scientific32-126Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with ClosureFischer Scientific03-312DUseful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash BottlesFischer Scientific03-409-17CUseful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette DispenserFischer Scientific14-287-150Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality TipsFischer Scientific13-683-708Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)Genessee Scientific59-114Used to anesthetize flies
Flystuff foot valveGenessee Scientific59-121Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit)Genessee Scientific59-124GUsed to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE BottleVWR97064-130Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2WalmartNot applicableUsed to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5Walmart
Inbred or wildtype line of DrosophilaBloomington Drosophila Stock Center at Indiana Universityhttps://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of DrosophilaUC San Diego Drosophila Stock Centerhttps://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php

参考文献

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