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要約

このプロトコルの目標はオンカラム細胞外の電子受容体を用いたトランス プラズマ膜電子輸送を監視し、これらの細胞外の電子アクセプターに発生する酵素の相互作用を解析します。

要約

トランス プラズマ膜電子輸送 (tPMET) は、細胞の酸化剤によって損傷からの保護と同様に、細胞内還元ストレスからの細胞の保護の役割を果たします。細胞の酸化細胞内還元剤から電子を輸送のこのプロセスはよく定義されません。細胞外の電子受容体を用いた tPMET を監視する C2C12 細胞によって吸光光度アッセイを紹介: 水溶性テトラゾリウム塩 1 (WST-1) と 2, 6 ‐ ジクロルフェノールインドフェノール (プラズマまたはなった)。これらの電子アクセプターの削減、リアルタイム解析で、このプロセスを監視することがおります。アスコルビン酸オキシダーゼ (AO) やスーパーオキシドディスムターゼ (SOD) アッセイなどの酵素のほか、tPMET のどの部分がアスコルビン酸のエクスポートまたはスーパーオキシド生産、それぞれを判断できます。WST 1 は、低バック グラウンドで安定した結果を生成する示されていたプラズマ AO と吸光光度分析と実証された SOD の付加の後で再酸化することができた。このメソッドは、吸光光度法がリアルタイム、マルチも、クイック フェリシアン (FeCN) フェリチト クロム c 削減などの tPMET を監視するために使用他の方法上の利点を示します。

概要

精製膜の電子受容体を減らす機能は、ビュー固有の酸化還元能力1は、細胞膜につながっています。動物、植物、菌類に見られる以前、tPMET、複数生物2,3,4,5一般的なプロセスです。具体的には、このプロセスは、酵母、ニンジン培養細胞、赤血球、リンパ球、骨肉腫、悪性黒色腫、大食細胞、骨格筋、好中球2,3、で実証されています。4,5,6,7. 細胞酸化を減らすために原形質膜の間で電子を輸送するプロセスで tPMET を含む多くの細胞機能に関与している: セル成長5,8, 細胞生存率9, 鉄代謝10、セルシグナ リング11,12,13、および活性酸素種12,14,15からの保護。TPMET の不均衡ががん16, 心血管疾患17を含むいくつかの深刻な健康状態の発展に貢献するという仮説が tPMET のおかげで多くの細胞機能と代謝症候群18。

血しょう膜の間で電子の移動を監視する複数の方法がありますが、最も広く使用されている手法は、比色試金を介して細胞外の電子アクセプターの削減を評価します。一般的に使用される細胞外電子アクセプターはテトラゾリウム塩、プラズマ、FeCN、フェリチト クロム c19,20。最も一般的に使用されるテトラゾリウム塩は、WST 119の第二世代塩知られています。この化合物は 2 つスルホン酸のグループがあり、その水への溶解度21になるため最初の世代テトラゾリウム塩と比較して比色試金で使用する簡単です。WST-1 中間電子アクセプター 1-メトキシ-フェナチン methosulfate (Mpm) と組み合わせて、2 つの単電子転送イベントに削減されます。この減少は、WST 一色弱酸化型をより強烈な黄色の塩20,22に変更します。WST 1 が 37 × 103 M-1cm-1、高モル吸光係数高い測定感度21,22に 。プラズマはまた tPMET を監視するため細胞外の電子受容体として利用されています。これは、プラズマが tPMET 中間電子アクセプター23,24の援助なしで細胞外に減らすことが示されています。中間電子アクセプターの不足、プラズマは直接ピックアップ WST 124とは異なり、細胞膜から電子ことができます。プラズマと同様に、FeCN は細胞外 tPMET 中間電子アクセプター19,24の助けを借りずにフェロシアン化する縮小する示されています。WST 1 やプラズマと違って FeCN が低いアッセイ感度9につながる低分子吸光係数です。TPMET を監視するもう一つの一般的に使用される細胞外電子アクセプターは、フェリチト クロム c 中間電子アクセプター、Mpm22使ってフェリチト クロム c 削減増加、WST 1 と同様です。WST 1 とは異なり、フェリチト クロム科学的方法は高いバック グラウンド化低分子吸光係数22敏感。

吸光光度法による tPMET のリアルタイム解析法をご紹介します。メソッドは、使用されますが一般的、他と比較されて安価フェリチト クロム c など細胞外の電子アクセプター、両者は高分子吸光係数を持っている WST 1、プラズマ、細胞外の電子受容体を利用しました。フェナジン methosulfate (PMS) 利用 Mpm の代わりに類似した化学構造、PMS ははるかに高価です。Mpm は光化学安定した長い貯蔵寿命を必要があります市販キットの重要な特徴であります。しかし、我々 PMS 新鮮なを確認各試金のための安定性の問題をすべきではないです。酵素間の相互作用 (図 1を参照) さらに tPMET のプロセスを特徴付けるために利用されるかもしれない酵素と細胞外の電子受容体を評価する方法を提案する.具体的には、AO と SOD を使用ことができます酵素アスコルビン酸輸送や細胞のスーパーオキシド リリースでは、膜の間で運ばれる電子の 2 つの一般的な方法は、tPMET のどの部分を決定します。

プロトコル

注: は、主な手順の概要を図 1を参照してください。

1. WST 1 還元能の測定

  1. 成長し、C2C12 行 A ~ F を利用した 96 ウェル プレートで標準的な細胞培養手順7を使用して付着性のセルを区別します。
    1. 構成のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 2% 馬血清、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 mg/mL と分化培地を使用します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
    2. アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、100 μ M アスコルビン酸による分化メディアを補足します。24 ~ 48 の分化メディアでインキュベートする h。
  2. WST 1 と PMS の貯蔵液を準備します。
    1. WST 1 の 10 の mM の在庫をするためには、WST 1 の 0.033 g を溶解 (式重量 (FW): 651.34 g/mol) を 5 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。4 ° C でのストア
    2. PMS の 5 mM の在庫をするためには、PMS の 0.0023 g を溶解 (FW: 306.34 g/mol) 1.5 ml の脱イオン H2O (式行先方向2O)。-20 ° C で保存し、光から保護します。
  3. 11.4 mL の PBS か HEPES に 5 mM の最終濃度緩衝生理食塩水 0.0108 g のブドウ糖を追加 (HBS; 20 mM HEPES ナトリウム塩、140 mM の NaCl、KCl、2.5 mM MgSO4、5 mM 1 mM CaCl2)。5 mM 20 μ M の最終的な集中のための PMS の 48 μ L ・ 400 μ M の最終濃度 10 mm WST 1 480 μ L を追加します。
  4. アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数に式行先方向2O の 6 μ L を追加し、他の因数 2 区/mL AO 2 U/mL の最終的な集中のための 6 μ L を追加します。
  5. TPMET 活性酸素関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数を 0.1 M KPO4バッファーの 55 μ l 添加し他の因数に 6.5 区/mL SOD 60 U/mL の最終的な集中のための 55 μ L を追加します。
  6. PBS のセルを洗浄します。メディアを吸引し、150 μ L の PBS を追加します。その後、PBS を吸い出しなさい。
    注: アッセイは、メッキ、添付の細胞で行われます。したがって、遠心分離または洗浄工程におけるトリプシンの使用はありません。
  7. WST 1 ソリューション (-) を 100 μ l 添加 SOD または (-) AO 列 1-6 にし 100 μ L WST 1 ソリューション (+) SOD のや (+) AO 96 ウェル プレートの 7-12 列に追加します。G と H の行を使用して、バック グラウンド コントロールとして (すなわち変化を監視するセルのない井戸で試薬のみで吸光度の)。
  8. 438 で 1 時間 10 分毎の分光光度計を使用して吸光度を測定 nm。
  9. 読んだ後、メディアを吸引し、それぞれを洗って、150 μ L の PBS。その後、PBS を吸い出しなさい。
  10. ためにも、その任意の時点での吸光度からも初期の吸光度を差し引くことによって各ウェルの吸光度の変化を計算します。吸光度 (もしあれば) バック グラウンド井戸 (すなわち、分析ソリューションと井戸がない細胞) にみられる変化のこの変更を修正します。
  11. 分析のため 60 分制御測定吸光度データを正規化または PBS または HBS と井戸を洗浄し、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイを行います。
  12. 2 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) 標準を追加 (0.5 ~ 2 範囲セルの合流点の程度に応じて、標準曲線の μ L) 空井戸 (G と H の行) に、すべての井戸に BCA 試薬を追加。
  13. WST 1 排出削減量 μ g 蛋白の nmol を介してデータを定量化します。438 で減らされた WST 1 の消散係数として 37 mM-1 cm-1 22を使用 nm。

2. プラズマ還元能の測定

  1. 成長し、1.1 の手順と同じ手順で C2C12 付着性のセルを区別するため。
  2. とおり株式 10 mM プラズマ ソリューションを準備します。プラズマの 0.029 g を溶解 (FW: 290.08 g/mol) 式行先方向2O. 確認 600 で吸光度を測定することによってプラズマの濃度の 10 mL の分光光度計との nm。600 で減らされたプラズマの消散係数として 1 mM-1 cm-1 23を使用 nm。4 ° C でのストア
  3. 0.0108 g のグルコースを最終濃度 5 mM の 11.880 mL の PBS に追加します。10 mm プラズマ最終濃度 100 μ M 120 μ L を追加します。
  4. アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数に式行先方向2O の 6 μ L を追加し、他の因数 2 区/mL AO 2 U/mL の最終的な集中のための 6 μ L を追加します。
  5. TPMET 活性酸素関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数を 0.1 M KPO4バッファーの 55 μ l 添加し他の因数に 6.5 区/mL SOD 60 U/mL の最終的な集中のための 55 μ L を追加します。
  6. メディアを吸引し、150 μ L の PBS のセルを洗ってください。PBS を吸引し、プラズマ ソリューション (-) を 100 μ l 添加 SOD または (-) AO 列 1-6 に 100 μ L プラズマ ソリューション (+) SOD のまたは 96 ウェル プレートの 7-12 列に (+) AO を追加。行 G と H はバック グラウンド コントロールとして使用 (つまり変化を監視するセルのない井戸で試薬のみで吸光度の)。
  7. 600 nm を使用して吸光度を測定分光光度計 10 分毎 1 時間の 60 分 1.9 1.13 の手順と同様にコントロールに対する相対吸光度の変化を定量化します。

3. 削減電子アクセプターが AO や SOD 用基板であるかどうかの決定

  1. 5.436 mL の PBS か HBS、400 μ M の最終的な集中と 5 mM 20 μ M の最終的な集中のための PMS の 24 μ L の 10 mm WST 1 240 μ L を追加します。
    1. プラズマ、PBS または HBS 5.940 mL に 10 mM プラズマ、最終濃度 100 μ M の 60 μ L を追加します。
  2. 細胞の不在中のフラット底 96 ウェル プレートによく各 438 で分光光度計で吸光度を測定しソリューションを 100 μ l 添加プラズマの WST-1、または 600 nm の nm。
  3. 最終濃度 100 μ M の井戸の半分に 10 mM のアスコルビン酸の 1 μ L を追加します。それが安定するまでは、吸光度を監視します。
  4. 安定化時に各ウェルに 2 U/mL の最終濃度 200 U/mL AO の 1 μ L を追加または各 60 U/mL の最終濃度も、1 h の吸光度を監視、6 区/mL SOD の 1 μ L を追加します。

結果

統計は、RStudio 統計ソフトウェア25を使用して反復測定分散分析で行った。サンプル サイズは、図の凡例に示されます。

TPMET を監視するには、C2C12 細胞が細胞外の電子アクセプター、WST 1 とプラズマと共に利用されます。AO は WST 1 のどの部分を決定するために使用されたプラズマ還元されたアスコルビ?...

ディスカッション

我々 は、C2C12 細胞に tPMET を監視する吸光光度アッセイでの細胞外の電子アクセプター、WST 1、プラズマを利用するための 2 つの方法を提示しています。標準培養プロシージャのセルラインの成長と分光光度計プレート リーダー、単純なマイクロ プレート法でこれらの電子アクセプターと tPMET を監視することが可能です。WST 1 削減は、アッセイ内の井戸-井戸から再現が、日々 変動がありま?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

彼らのテクニカル サポートのトーマス ・ ベル、リン Mattathil、マーク Mannino、Neej patel さんに感謝したいと思います。この作品は、米国公衆衛生サービス賞 R15DK102122 国立糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) からジョナサンフィッシャーによって支えられました。原稿内容は著者の責任し、もの、NIDDK または健康の国民の協会の公式見解ではありません。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

参考文献

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