シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

要約

シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) モデルのシナプスでサイクリングを駆動するためのすべての刺激方法を比較します。

要約

FM 染料は、シナプス小胞 (SV) サイクルの研究に使用されます。これらの両親媒性プローブには、親水性の頭部と疎水性尾、水溶性膜脂質二重層を可逆的に出入りする能力を持つことがあります。これらのスチリル色素が比較的非水溶液中で蛍光性が細胞膜の外側のリーフレットに挿入、> 40 X 蛍光の増加します。神経シナプスにおける FM 染料は SV エンドサイトーシス、神経伝達のシナプス前の段階を可視化する強力なツールを提供する、内および SV プール間の人身売買とのリリースの SV エキソサイトーシスの中に内面化します。グルタミン酸作動性シナプスの開発と機能の主な遺伝モデルはショウジョウバエ変異条件の広い範囲で SV のダイナ ミックスを定量化する神経筋接合部 (NMJ) は、FM がイメージングを色素が広く使用されています。NMJ シナプス ターミナルは大きなシナプス ボタン イメージング アプリケーションに最適の美しい配列と、簡単にアクセスできます。ここで、我々 は比較対照ショウジョウバエ活動依存した FM1 43 色素取り込み/リリースを駆動する NMJ を刺激する 3 つの方法: 高 [K⁺] 神経筋組織を脱分極作用、2) 吸引電極運動神経の 1) お風呂のアプリケーションシナプス前の神経ターミナルと 3 を脱分極刺激) は、チャネルロドプシン亜種脱分極の光刺激、空間の制御のための遺伝子組換え発現を対象しました。これらの各メソッドは、利点と欠点 SV サイクルの遺伝の突然変異の効果に関する研究のショウジョウバエNMJ。これらの長所と短所それぞれの戦略に固有の方法論とともに、刺激アプローチの選択を支援するために説明します。蛍光イメージングに加え FM 染料は超微細構造レベルで SV 循環メカニズムを研究する透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いて可視化する電子密度の高い信号に photoconverted をすることができます。我々 は、共焦点の比較を提供および電子顕微鏡イメージングショウジョウバエNMJ 刺激、支援するためのさまざまな方法から将来の実験的パラダイムの選択。

概要

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (NMJ) グルタミン酸作動性シナプスの美しく特徴モデルは、シナプス形成と遺伝的摂動¹の広大なスペクトルを持つ関数の研究に使用されています。モーターニューロン ターミナルは複数の軸索分岐を多く拡大されたシナプス ボタンのそれぞれから成っています。これらの容量の大きい下肢 (最大 5 μ m) を含む制服グルタミン酸作動性シナプス小胞を含む神経伝達機械のすべて (SVs; 〜 40 nm の直径の) ゾル性細胞質の準備で容易に脱着可能なプール²。これらの小胞はシナプス前膜融合サイト アクティブ ・ ゾーン (AZs)、エキソサイトーシスがトランスのグルタミン酸神経伝達物質を仲介でドック-シナプス通信。その後、SVs は繰り返し exo/エンドサイトーシス サイクルのキス-実行のリサイクルやクラスリン依存性エンドサイトーシス (CME) を介して細胞膜から取得されます。ショウジョウバエNMJ は簡単にアクセス可能で、分離して SV サイクル変異体の特性の両方に適しています。前方遺伝スクリーンを使用した新規変異は SV サイクル³の重要な新しい遺伝子の同定につながっています。また、既に知られている遺伝子で始まる逆遺伝学的アプローチは、変異体の表現型⁴をサイクリングの注意説明を通じて新しい SV 循環メカニズムの解明につながっています。ショウジョウバエNMJ はほぼ光学トラック小胞神経伝達中にサイクリングするメソッドを介して SV エンドサイトーシス、エキソサイトーシスのメカニズムを解剖するための実験的シナプス準備として最適です。

蛍光マーカーの範囲ことが力学をサイクリング中に小胞の視覚追跡ですが最も汎用性の高い FM 色素類縁体を f.、真央らによって初めて合成されました。⁵. 構造上、FM 染料を含む水性頭とつながっている芳香環、中部のスペクトル特性を付与と脂溶性尾。これらのスチリル色素膜で可逆的にパーティションはない 'フリップフ ロップ' 膜リーフレットの間、ですから、無料、細胞質で、水⁵よりもはるかに多く蛍光膜です。脂質二分子膜へのリバーシブルの挿入は、蛍光⁶40 増加を引き起こします。神経シナプスで古典的な FM 色素標識実験 SV エンドサイトーシスを介して色素をロードする刺激を脱分極中に染付シナプス準備を入浴で構成されます。外部の色素は離れて洗浄し、SV サイクルは読み込まれたシナプス⁷をイメージさせるカルシウム無料リンゲル液で逮捕されました。色素フリー バースの刺激の第 2 ラウンドは、エキソサイトーシス、蛍光強度の減少を測定することによって続くことができるプロセスを介して FM リリースをトリガーします。小胞の数百を含むプールを単一の小胞から SV 集団は、定量的に監視対象^6,7をすることができます。FM 染料は、機能的に異なる SV プールの活動依存的動員を解剖して CME サイクリング^8,9対キス-実行を比較するために使用されています。メソッドは、アッセイ別の誘発、自発的なミニチュアのシナプス サイクル活動 (非常に小さい蛍光変化を検出し、退色を低減する高感度の機器) を¹⁰に変更されています。試金によって拡張できます微細構造のレベルに photoconverting 蛍光 FM 信号伝達電子顕微鏡^{11,12,13,14 の電子密度の高いラベルに}.

歴史的には、高濃度カリウム (以下「高 [K⁺]」という) の入浴シナプス準備サイクリング; SV を誘発する刺激を脱分極の選択の方法をされているカエル コリン作動性 NMJ⁵からまでは、げっ歯類脳海馬ニューロン¹⁵、ショウジョウバエグルタミン酸 NMJ モデル^16,17に培養。この高 [K⁺] アプローチは簡単です、特殊な装置を必要としないとほとんどのラボにアクセスできます制限がありますアプリケーションのデータの解釈。神経^4,5,12吸引電極電気刺激を使用する大いにもっと生理学的に適切な方法です。このアプローチはシナプス前神経直接刺激の活動電位伝搬をターミナル、ドライブおよび伝達関数^{13,14、電気生理学的アッセイに結果を直接比較すること 15}、しかし特殊な装置を必要として技術的にはるかに困難です。チャネルロドプシン神経刺激の使用は、光遺伝学の出現により、バイナリ Gal4/UAS システム²⁰を使用して、チャンネル式のタイトな時空間制御を含むその他の利点することができます。この方法は技術的に吸引電極刺激よりもはるかに簡単です、何も非常に安い LED 光源以上が必要です。ここでは、我々 は FM1 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) ピリジニウム臭化) をして両方比較してショウジョウバエNMJ でこれらの 3 つの異なる刺激の方法の画像を採用して: 単純な高 [K⁺]、電気と新しいチャネルロドプシンのアプローチに挑戦します。

プロトコル

1. 幼虫の接着剤剥離

1. 10 部 1 部硬化エラストマー キット (材料表) から剤シリコーン ・ エラストマーをベース シリコーン ・ エラストマーを徹底的に混ぜます。
2. (もはやべたべたする) まで数時間 22 x 22 mm ガラス coverslips エラストマーと 75 ° C のホット プレートに治療をコートします。
3. 幼虫の解剖のための準備にカスタムメイドのプレキシ ガラス解剖室 (図 1の一番下) に単一のエラストマー コーティング ガラス基盤を配置します。
4. 標準的な電極の引き手を使用して目的のテーパーを取得して先端サイズ ホウケイ酸ガラス毛管から接着剤ピペットを準備します。
5. 優しくマイクロ ピペット チップ、そしてもう一方の端に、柔軟なプラスチック製のチューブ (1/32"内部の直径、ID 3/32" 外径、OD; 1/32"の壁の 2 フィートを添付材料の表)口 (P2 ピペット チップ) をフィッティングします。
6. 幼虫の解剖に備えて接着 (材料表) の体積 (~ 20 μ L) が小さく、小さい容器 (0.6 mL エッペン チューブ キャップ) を入力します。
7. (MM) に生理食塩水でチャンバー: 128 NaCl、2 KCl, 4 MgCl₂、1 の CaCl₂、70 ショ糖および 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 酸 (HEPES) pH 7.2。
8. Alexa Fluor 647 に共役反わさびペルオキシダーゼ (HRP) 抗体を追加 (反-HRP:647; 希釈 1:10 1 mg/mL 在庫から) 略記をラベリングのため郭清^21,22におけるシナプス前ターミナル。
9. 細かい絵筆 (サイズ 2) を使用して、食品バイアルから放浪 3 齢を取り外し、エラストマー被覆カバーガラスの上に置きます。
10. 添付ファイル (手順 1.5) で口によって生成された負圧利用による接着剤の少量をガラス マイクロ ピペット チップを埋めます。
11. 位置幼虫背側を鉗子と糊小さなエラストマー コーティング coverslip の頭を口の中で肯定的な空気圧を使用して接着剤のドロップを使用。
12. 2 つの接着剤の添付ファイルのピンと張った動物が拡大されることを確かめて、幼虫の後端でこの手順を繰り返します。
13. はさみを使用して (刃 3 mm;材料表)、後部と背側の正中線に沿って垂直カットで水平カット (~ 1 mm) を作る。
14. 微細鉗子 (#5、材料表) を使用して優しく背気管、腸、脂肪体、その他の内臓の筋肉をカバーを取り外します。
15. 水平方向および垂直方向にゆっくり体壁を伸ばすようにして 4 つの体壁フラップ接着の手順を繰り返します。
16. 鉗子による腹側神経索 (VNC) を持ち上げて慎重に運動神経をはさみでカット VNC を完全に削除します。
17. 解剖生理食塩水に置き換えて Ca^{2 +}-無料 (CaCl₂上記解剖生理食塩水と同じ) に生理食塩水の SV を停止するサイクリングします。

2. オプション 1: 高 [K⁺] FM 色素読み込み

1. FM1 43 在庫ソリューション (4 mM) から 90 mM KCl ソリューション (高 [K⁺] 解剖生理食塩水で) 4 μ M の最終的な集中のための 1 mL に 1 μ L を追加します。
2. 交換、ピペットを使用して Ca^{2 +}のイメージング室 SV エンドサイトーシス染料の通風管を刺激するために高い [K⁺] FM 色素溶液における無料生理食塩水。
3. すぐに脱分極刺激周期高 [K⁺] の前もって決定された持続期間のためのデジタル タイマー (e.g。、5 分。図 2)。
4. 健康な幼虫の準備を確認するには、高度 [K⁺] 脱分極期の持続期間のための筋肉の強い収縮に注意してください。
5. タイマー期間が終了すると、すぐに高い [K⁺] FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca^{2 +}-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
6. Ca^{2 +}と立て続けに洗って-高 [K⁺] FM 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
7. 新鮮な Ca^{2 +}で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。

3. イメージング: 共焦点顕微鏡

1. 水浸対物レンズ (その他の顕微鏡を使用することができます) 画像 NMJ 色素蛍光 X 40 で直立した共焦点顕微鏡を使用します。
2. イメージ筋腹部セグメント 2-4 (他の NMJs をイメージすることができます) の 4 NMJ と適切なソフトウェア (資材表) を使用して画像を収集します。
3. (ロングパス ・ フィルター > 635 nm) と HRP:647 と (バンドパス フィルター 530-600 nm) で FM1 43 を励起するのにアルゴン 488 nm レーザーを励起するのに HeNe 633 nm レーザーを使用します。
4. 運用上最適な利得と両方のチャネルのオフセットを決定します。
   注: これらの設定は、実験の残りの部分全体で一定になります。
5. シナプス ターミナルの下に HRP マーク上から全体の選択した NMJ を共焦点 Z スタックを取る。
6. FM 染料のアンロード後に正確な同じ NMJ 過剰ように NMJ イメージ (セグメント、側筋) の注意を取る。

4. 高 [K⁺] 刺激: FM 色素をアンロード

1. Ca^{2 +}を交換-無料生食ドライブ脱分極に FM1 43 色素) を除いた高 [K⁺] 食塩を SV のエキソサイトーシスと染料のリリース。
2. すぐ高 [K⁺] 刺激周期の前もって決定された持続期間のためにデジタル タイマー (e.g、2 分;。図 2)。
3. タイマー期間が終了すると、すぐに高い [K⁺] 生理食塩水を削除し、置き換えます Ca^{2 +}-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
4. Ca^{2 +}と立て続けに洗って-無料生理食塩水 (1 分の 5 倍) の高 [K⁺] 生理食塩水が完全に削除されていることを確認します。
5. 新鮮な Ca^{2 +}で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
6. 必ず同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光をイメージしてください。

5. オプション 2: 電気刺激 FM 色素読み込み

1. 電極の引き手 (資材表) を使用して必要なテーパーを取得して先端サイズ吸引ピペットを準備します。
2. 火-ポーランド語マイクロ フォージで電極先端まで単一の運動神経は、タイトなフィットを吸い上げることができます。
3. マイクロマニピュレーターの電極ホルダーに吸引ピペットをスライドさせ、長く柔軟なプラスチック製のチューブと注射器を付けます。
4. 刺激パラメーターを設定 (例えば.、15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、時間 5 分 (図 2) または 1 分 (図 3))。
5. Ca^{2 +}を交換-無料生理食塩水生理リグに FM1 43 食塩水 (4 μ M; 1 mM CaCl₂) 上記と幼虫の準備に。
6. 顕微鏡ステージの準備を入れて幼虫および吸引ピペットがフォーカス (40 X 水浸対物レンズ) になるまでステージを上げます。
7. 負圧吸引電極に注射器によって生成されると選択した hemisegment を支配するカットの運動神経のループを吸います。
8. 選択した hemisegment の筋肉の収縮を視覚的に監視しながら刺激を短時間で吸引電極機能をテストします。
9. 選択したパラメーター (ステップ 5.4) SV エンドサイトーシスをドライブして FM1 43 染料の通風管 (図 2) を使用して運動神経を刺激します。
10. Ca^{2 +}と立て続けに洗って-FM1 43 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
11. 新鮮な Ca^{2 +}で幼虫の準備を維持-上から共焦点イメージング プロトコルを使用して即時画像無料生理食塩水。
12. NMJ イメージ (セグメント、側と筋肉) FM 色素をアンロードした後正確な同じ NMJ へのアクセスを確保するための注意を取る。

6. 電気刺激: FM 色素をアンロード

1. Ca^{2 +}を交換-無料の FM1 43 色素) を除いた正規の生理食塩水を生理食塩水と電気生理学リグ ステージに戻り準備を配置。
2. 荷を下すことのための刺激パラメーターを設定 (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間 20 ms、時 2 分 (図 2) または 20 s (図 3))。
3. 上記のように、同じ電極に同じ運動神経を吸うし、SV エキソサイトーシスと FM1 43 色素リリースをアクティブにし、刺激します。
4. Ca^{2 +}と立て続けに洗って-外部の色素を完全に除去できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
5. 新鮮な Ca^{2 +}で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
6. 同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光を画像を確認します。

7. オプション 3: チャネルロドプシン刺激 FM 色素読み込み

1. ChR2 を表現する幼虫 (100 μ M 最終濃度で溶解し、エタノール; ChR2 共同因子すべて trans 網膜を含む食品を上げます。
2. カメラ ポート装備されて解剖顕微鏡ステージにプレキシ ガラス室で幼虫の準備を配置します。
3. 青色 LED を添付 (470 nm;材料の表)プログラム可能な刺激に同軸ケーブルを使用して、カメラのポートに LED を配置します。
4. 顕微鏡ズーム機能を使用して切り裂かれた幼虫関数の上に青い LED 光線の焦点を合わせます。
5. Ca^{2 +}を交換-無料生理食塩水での準備作業は、幼虫の FM1 43 生理食塩水 (4 μ M; 1 mM CaCl₂) 上記光ステージ上に。
6. 刺激装置 (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、時間 5 分 (図 2)) を使用して LED のパラメーターを設定します。
7. 光刺激を開始し、(例えば、5 分の光遺伝学的刺激周期の前もって決定された持続期間のためのタイマーと追跡図 2)。
8. タイマーが止まったら、すぐに FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca^{2 +}-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
9. Ca^{2 +}と立て続けに洗って-FM 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
10. 新鮮な Ca^{2 +}で幼虫の準備を維持-共焦点顕微鏡上から撮像プロトコルを使用して即時イメージングのため無料生理食塩水。
11. NMJ イメージ (セグメント、側と筋肉) FM 色素をアンロードした後正確な同じ NMJ へのアクセスを確保するための注意を取る。

8. チャネルロドプシン刺激: アンロード FM 色素

1. Ca^{2 +}を交換-カメラのポート LED を解剖顕微鏡ステージ上 FM1 43 色素) を除いた通常生理食塩水で無料生理食塩水は、幼虫に焦点を当てた。
2. アンロード (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、2 分 (図 2) の時間) の刺激パラメーターを設定します。
3. 光刺激を開始し、光刺激周期の前もって決定された持続期間のためのタイマーと追跡 (例えば、 2 分;図 2)。
4. タイマー期間が終了すると、すぐに FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca^{2 +}-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
5. Ca^{2 +}と立て続けに洗って-外部の色素を完全に除去できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
6. 新鮮な Ca^{2 +}で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
7. 同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光を画像を確認します。

9. 蛍光定量

1. 画像 J (NIH オープン ソース) で画像を読み込み、画像をクリックして最大強度投影を作成 |スタック |Z プロジェクト。
2. 反を使用して-HRP:647 チャネル、イメージを行く |調整 |しきい値とスライド上部のツールバー NMJ だけがハイライトされるまで。
3. 選択ツールを使用して、略記をクリックします。略記が不連続で、Shift ボタンを押したまま、すべての部品を選択します。
4. FM1 43 色素チャンネルに画像を変更し、分析に行く |蛍光測定値を取得するための対策。
5. 「無負荷」イメージの同じ略記 (識別セグメント、側筋) から、9.1 9.4 手順を繰り返します。
6. 読み込まれた染料の割合を得るためには、アンロードとロードの蛍光強度の比を取る。
   注: この手順は、「フリーハンド」、「楕円形」または選択ツールを使用してブートンあたりブートンに蛍光を分析する変更できます。背景の蛍光性は筋肉蛍光をサンプリングすることによって減算することができます。このような背景を減らすために、エージェントを追加もできます。

結果

図 1は、活動依存した FM 染料のプロトコルをイメージングのための作業フローを示します。実験は、その後使用される刺激方法に関係なく、同じ幼虫接着剤郭常に始まります。図 1 aは、神経と繰り返し hemisegmental 筋パターンを放射腹側神経索 (VNC) を示す切り裂かれた幼虫の模式図です。VNC は削除され準備を浴びて FM1 43 (<...

ディスカッション

高 [K⁺] 生理食塩水脱分極刺激は、サイクリング、活動依存した FM 色素が可能性が高い少なくとも生理的²⁹の 3 つのオプション、はるかに簡単です。この簡単な方法は、全体の動物のすべてのアクセス可能なセルを脱分極し、監督の研究を許可しませんので。ローカル高 [K⁺] 生食、マイクロ ピペットに適用することがありますが、これはまだ前/後シナプス細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity