アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

要約

ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.

要約

伝統的な細菌の病原性アッセイは、宿主細胞に数時間にわたって細菌の長期暴露を含みます。この時、細菌はホスト生育環境への暴露と宿主細胞の存在のための生理学の変更を受けることができます。細菌が宿主細胞の存在下で成長する範囲を最小限にする細菌の病原性の状態を迅速に測定するアッセイを開発しました。細菌やアメーバ一緒に、寒天のパッドを使用して単一画像平面に固定化しました。手順は、ホスト細胞の健康の指標としてカルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン エステル (カルセイン AM) と単一細胞の蛍光イメージングを使用します。宿主細胞の蛍光は、落射蛍光顕微鏡による細菌の宿主細胞の露出の 1 時間後に分析されます。画像解析ソフトを使用して、ホスト殺害のインデックスを計算します。このメソッドは、浮遊性と表面に接続された緑膿菌の病原性を測定するために使用されていますバイオ フィルム形成の初期段階でのサブ集団と他の細菌とバイオ フィルムの成長の他のステージに適応があります。このプロトコル病原性を測定する迅速で堅牢な方法を提供し、成長と哺乳類セルラインの維持に関連する複雑さの多くを回避できます。病原性表現型を用いてここでアメーバもマウスのマクロファージを使用して検証されています。特に、このアッセイは、膿が付着 upregulates 病原性を確立する使用されました。

概要

細菌感染は、人間と動物の^1,2の死亡率の主要な原因のひとつです。文化やバイオ フィルム中の細菌の毒性を測定する能力は、医療と研究の設定で重要です。ここでは、細菌の病原性を定量化する汎用性の高い、迅速かつ比較的簡単な方法をについて説明します。真核生物キイロタマホコリカビ(アメーバ) は、ホストのモデル有機体として使用されます。D. キイロタマホコリカビは、緑膿菌(P. aeruginosa)^3,4,5その他細菌^{6,7 病原性因子を同定するホストとして使用されています ,8}タイプ III 分泌^9,10を含む哺乳類の細胞を殺す病原因子が同じ主に影響を受けやすい。D. キイロタマホコリカビを使用して前の病原性アッセイは、時間^3,4、5のコース上D. キイロタマホコリカビの細胞と細菌の長期暴露を関与しています。ここでは、プロトコルこのアメーバを使用して病原性を決定する急速な手法を提案します。(図 1) このプロトコルを記述する方法: (1) axenically (細菌の不在) のアメーバを成長、(2) 試金のための細菌の成長, (3) 細菌の準備、顕微鏡、(4) のホスト細胞を落射蛍光顕微鏡を実行および (5) アメーバの分析蛍光。

アメーバ最初凍結する在庫からを縞になる、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の芝生上に成長した、アメーバが胞子を作り出します。これらの胞子が選ばれ、無菌成長用濃縮培地に接種します。細菌の病原性の評価のための細菌と混合する準備ができるまで、栄養豊富な条件で無菌の成長を通じて、アメーバが維持されます。生存率や、アメーバの死は、カルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン (カルセイン AM) で、細胞内エステラーゼによって切断され、蛍光^11,12の活性化により、蛍光を測定することによって定量化されます。強調したに対し、ライブ アメーバがほとんど、あるいはまったく蛍光を展示し、死細胞蛍光激しくないです。この結果は、ほとんどあるいは全く健全なアメーバと定款にカルセイン AM 定款と胸の谷間強調したアメーバ¹³で基板の原因です。この現象は、特に哺乳類セル^11,14,,1516カルセイン AM 蛍光から区別されます。

細菌の病原性を評価することは、別に栽培しています。ここでは、膿の日和見病原体の病原性を測定し、浮遊性 (水泳) および表面接続型のサブ集団の病原性を定量化する方法について詳しく説明する方法をについて説明します。このプロトコルは、他の細菌の病原性をテストに適応させること。病原性表面接続型セルでアクティブにされ浮遊性細胞では低いことを示す代表結果セクションで以前¹³に報告しました。表面接続型の病原性活性化膿は、非病原性の浮遊性細胞が、アメーバによって消費されている間にアメーバを殺します。浮遊性細菌の病原性は試金されるだけ、細菌がプロトコルで説明されているようにペトリ皿を使用するのではなく、普通の培養管で培養することができます。

アメーバや膿文化の成長は、膿の文化、アメーバは定常状態の栄養豊富な条件で育っている間目的の成長フェーズに到達するように調整しなければなりません。この状態は通常、細菌と混合されるとき、少なくとも 1 日前に希釈するアメーバ文化を必要です。アメーバや細菌寒天パッドを使用して固定、1 h の共同培養、低解像度 (10 X 開口数 0.3) 客観的、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をフィルターして撮像カメラを使用してイメージを作成します。分析は、ImageJ の自由に利用できるソフトウェアを使用して実行することができます。 または、画像解析ソフトをカスタマイズします。我々 の分析は、科学的な分析パッケージ¹³を使用して作成された独自のソフトウェアを使用して行った。ソフトウェア位相コントラストを使用してマスクを作成し、蛍光画像のマスクされた領域から蛍光値を抽出.蛍光値の少なくとも 100 の細胞、数値ホスト殺害のインデックスの結果を平均値します。

プロトコル

すべての実験手順は、カリフォルニア大学アーバイン校で行われました。

1. バッファーとソリューション

1. ホストゲノム スープ (LB) 1 L のガラス瓶を準備するには、1 l 二重蒸留水 (ddH₂O) の LB ミラー ミックス 25 g を追加します。ペトリ皿、寒天の追加 20 グラムを追加します。オートクレーブ滅菌します。10 cm 径シャーレに溶融寒天培地を 25 mL を注ぎ、室温で固化することができます。室温で液体のメディアと寒天 4 ° C で保存します。
2. D-グルコースの 1 g を混合することによってグルコース酵母ペプトン (激痛) プレート 1 L のガラス瓶を準備、2 g ペプトン、酵母の 0.25 g のエキス、KH₂PO₄の 4.2 g、ナ₂HPO₄7 H₂O の 5.1 g、1 l の ddH₂寒天 25 gO をオートクレーブ滅菌します。10 cm 径シャーレに溶融寒天の 25 mL を注ぎ、室温で固化することができます。4 ° C でのストア
3. ペプトン 10 g を混合して 1 L のガラス瓶にペプトン S (PS) メディアの準備、7 グラム酵母エキス、D-グルコース、0.12 g の Na₂HPO₄7 H₂O、KH₂PO₄1.4 g、40 μ g ビタミン B₁₂の 15 g、80 μ g 葉酸 ddH₂o. の 800 の mL での校正日以内 pH メーターが使用されていない場合、pH 4 と 7 の pH の基準を使用して電子 pH メーターと。
   1. PH メーターを使用して PS の培地の pH を測定します。5 M 島または 5 M H₃PO₄ 6.5 に pH を調整する追加します。1 L に最終的な音量を調整する ddH₂o. フィルターを使用して滅菌 0.22 μ m の真空フィルター、4 ° C で保存
      注: は、pH 調整など手袋、防護服、眼の保護具保護具を着用して慎重に進めるし、保護に直面します。
4. 開発バッファー総理 × 10 を準備 (DB') KH₂PO₄Na₂HPO₄ 7 H₂O と ddH₂O の 13.4 g 3.4 g を 800 mL の容量に追加することで 1 リットルのガラス瓶内のバッファー。日以内 pH メーターが使用されていない場合、pH 4 と 7 の pH の基準を使用して電子 pH メーターを調整します。
   1. 電子 pH メーターを使用してバッファーの pH を測定します。優しく、5 M 島または必要に応じて 5 M H、₃PO₄を追加して 6.5 に pH を調整します。1 l ddH₂O を使用して最終的な音量を調整し、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。常温で保存します。
      注: は、pH 調整など手袋、防護服、眼の保護具保護具を着用して慎重に進めるし、保護に直面します。
5. 10 の 100 mL を混合することによって開発のバッファー (DB) x 1 を作る DB x' バッファーの 1 mL を滅菌 2 M MgCl₂1 mL の滅菌 1 M CaCl₂。室温でオートクレーブ滅菌 ddH₂o ・ ストアを使用して 1 L 瓶で 1 L に最終的な音量を調整します。
6. 滅菌 PS 媒体の 100 mL を混合することによって 1 リットルのガラス瓶の中の PS:DB メディアの準備、100 mL の滅菌 10 DB x' バッファー、および滅菌 ddH₂O の 1 mL と 1 l. サプリメントの合計ボリュームに滅菌 2 M MgCl₂ 1 mL の滅菌 1 M CaCl₂. 4 ° C でのストア
7. カルセイン AM 原液を準備するには、製造元によって提供されたプラスチック コンテナーのカルセイン AM の 50 μ g に DMSO の 50 μ L を追加します。-20 ° C にてストア

2. 成長とアメーバの維持

1. 初期生育期間中にアメーバの食料源として大腸菌株 B/r¹⁷を成長します。連勝エシェリヒア属大腸菌の凍結ストックからバックアップ/リストア LB 寒天培地プレート-80 ° C で保存し、シングル コロニーを取得する 37 ° C は一晩で孵化させなさい。
2. LB 培地 2 mL にエシェリヒア属大腸菌のバックアップ/リカバリの単一コロニーを接種してローラー ドラムまたは 37 ° C でシェーカーで一晩インキュベートします。
3. 部屋の温度に一晩大腸菌文化をもたらします。木の棒を使用して、-80 ° C で一晩かけて培養の 750 μ L に冷凍在庫からアメーバを接種します。
   無菌成長¹⁸のことができる注: 使用D. キイロタマホコリカビひずみ AX3。この手順は、無菌の成長を必要はありませんが、以降のステップは彼の要件を持っています。
4. すぐにブドウ糖酵母ペプトン (激痛) プレート大腸菌アメーバ-混合物の 700 μ L を追加します。行ったり来たり、サイドにサイド必要に応じてそれを傾けることによってプレートの表面に均等に文化を広めます。拡散機の使用を避けます。
5. 高湿度を保持するボックスの上向き寒天と石膏板を配置します。2 つの使い捨て可能なプラスチック容器を使用 (183 cm × 183 cm × 91 cm) 互いの上にスタックします。約 25 mL の水で、下のコンテナーを埋める、水貯留層から最上位のコンテナーに移動する水分が許可されるようにコンテナーの床に開けられたいくつかの 0.5 cm 直径穴を持つ最上位のコンテナーを配置します。
6. アメーバの胞子が観察された (図 2) プレートの表面近く成長するまで 4-5 日、石膏板、22 ° C でボックスを孵化させなさい。冷蔵インキュベータを使用すると、室温で放置ではなく、プレートを孵化させなさい。
   注: 胞子が成長して後、彼ら実行可能なまま数週間プレートに 4 ° C で保存する場合寒天面を上向きにプレートを格納します。インキュベーションの 3-4 日後、アメーバの胞子形成の発症を示すが、細菌の芝生内のクリアのゾーンを観察できます。
   1. インキュベーション (図 2) の 4-5 日後、小さなアメーバ版面の上の胞子を観察します。
      注: はにつれて胞子の質の低下はこの期間を超えても、一週間以上のアメーバがないです。
7. 1 mL の滅菌ピペット チップの板の表面に平行をスイープすることにより、アメーバの無菌の成長に備えてアメーバ胞子を収集します。10 cm シャーレの半分から胞子を収集します。
   注: は、このモーションエシェリヒア属大腸菌の多数を収集として寒天プレートの表面に先端は触れないでください。
8. PS 培地 1 mL に先端を浸すと、上下に軽くピペッティングによるピペットの先端に、アメーバを再懸濁します。
9. 0.25 倍の濃度で抗生物質抗真菌薬ソリューションと PS 培の 25 mL を含む 250 mL フラスコに接種の混合物を転送します。
   注: は、-20 ° C で 250 μ 因数として抗生物質抗真菌薬ソリューションを格納します。融解とこれはその有効性を減らすかもしれない、このソリューションの凍結の繰り返しは避けてください。
10. 100 rpm で回転シェーカーの 22 ° C で axenically アメーバを成長します。600 で測定光学密度に細胞を成長ステップ 5 で病原性試金のための 0.2 〜 0.5 nm (外径₆₀₀)。
    注: この手順 (手順 2.7) 接種の時から成長の 3-4 日が必要です。細胞より高い密度に成長している場合、外径₆₀₀ 0.05 以下 PS 媒体に戻って文化を希釈し、0.2 〜 0.5 の OD₆₀₀に戻る。

3.緑膿菌の成長

1. LB プレートから膿のシングル コロニーをピックアップ、2 mL の PS:DB 文化に接種し、飽和する 37 ° C で一晩成長します。
   注: は、PS:DB メディアに抗生物質抗真菌薬ソリューションを追加しないでください。
2. PS:DB を使用して 6 cm 径シャーレに一晩文化 1: 100 または縮尺を希釈します。浮遊性細胞の病原性は試金されるだけ場合、は、代わりに従来の培養管を使用して文化を育てます。37 ° C で 100 rpm に設定ベンチトップ回転子の文化を振る
3. 再現性を確保するための特定の時間ポイントで文化を収穫します。病原性を評価する前に 1 時間 30 分は、セクション 4 で説明した寒天パッドを準備します。
   注: P. 緑膿菌の病原性は表面に成長の約 8 h によって誘導されます。
4. 表面接続型細胞を分離するには、液体培地をシャーレから削除、浮遊性細胞を除去する DB バッファーの 1 つの mL で十分に洗い流して、すぐに 5.1 の手順に進みます。
   注意: 30 以上洗っていない同志として s を混乱させる細胞の表面接続をデタッチし、病原性測定に影響を与える可能性があります。
5. 浮遊性細胞を分離するには、きれいなシャーレにシャーレから文化の 10 μ L を転送し、5.1 のステップに進んでください。

4. 顕微鏡 - 寒天パッドの準備

1. アメーバは膿と混合する準備ができている前に、寒天パッド 1 時間に約 30 分を準備します。
2. 250 mL フラスコにバッファーが DB の 1% (w/v) 寒天の 50 mL を電子レンジします。寒天の塊までミックスすべての 20 s が消えます。
3. 15 分間予熱した 55 ° C の水浴にそれを置くことによって溶融寒天をクールします。
4. 円錐管に溶融寒天培地 15 mL にカルセイン AM 原液の 15 μ L を追加します。ミックスを軽く反転管 4-5 回、次のステップに進んでください。
   注: は、ポリプロピレン 15 mL 遠心管でこの手順を実行します。これは余りにすぐに固めるため寒天になります厚いガラス製の容器は使用しないでください。
5. 12 cm × 10 cm のガラス板の上に溶融寒天混合物を注ぎ、室温で 10 分間を固めるに寒天を許可します。1.5 cm × 1.5 cm に小さいセクションに印刷されたグリッド上にガラス板を置くと金属製の定規を使用してグリッドに沿って切断によって凝固寒天パッドをカットします。
6. 使用する準備ができるまで、湿気のあるボックスで水和ゲルを維持します。

5. 顕微鏡イメージング用細菌アメーバ サンプルの調製

1. 細菌細胞の表面接続型の病原性を試金するには、ステップ 3.4 からの細菌の表面接続型にステップ 2.10 からアメーバ細胞の 10 μ L を追加します。
   注: この手順では、バクテリアとアメーバの混合について説明します。
2. 浮遊性細胞毒性アッセイ、ステップ 3.5 から浮遊性細菌の 10 μ L でステップ 2.10 からアメーバ細胞の 10 μ L を混ぜます。
   注: は、細菌と混合する前に (0.2 〜 0.5 の₆₀₀を OD) で axenically 栽培アメーバ細胞を洗浄しないでください。抗生物質・抗真菌薬のソリューションを使用するためアメーバ文化では、大腸菌の成長は観察されなかった.
3. すぐにペトリ皿表面の細菌アメーバ混合物の上にステップ 4.5 から 1.5 cm × 1.5 cm カルセイン AM 寒天パッドを配置します。
   注: は、クイック滑らかな動きを使用して混合物の上に寒天パッドを配置します。この動きはパッドの下側から外周に向かって細胞をプッシュする傾向があるのでゆっくりと混合物の上にパッドを低くしてはいけない。この手順により、細菌やアメーバに均等に混合、固定化、両方の細胞の種類と同じ平面に限られています。
4. 優しく周囲の寒天パッド残りの液体をピペットで余分な液体を削除します。室温で 20 分間乾燥にペトリ皿を許可します。
5. フタ付きシャーレでカバーし、室温 6.1 の手順に追加 40 分続行で固定化したアメーバ細菌混合物を孵化させなさい。
   注: 時間の経過とともにバック グラウンド蛍光が増加するにつれて、時間の同じ量のすべてのサンプルをインキュベートすることが重要です。1 h のインキュベーション時間をお勧めします。1 h 以上孵化、バーストし始めるかもしれないアメーバ細胞、以下再現。

6. 顕微鏡画像の取得

1. 明視野観察と緑の蛍光画像を取得できる蛍光顕微鏡を用いたイメージ アメーバ。蛍光グリーンの 474/27 緑色蛍光タンパク質 (GFP) フィルターを使用して、nm、525/45 nm 励起と放射、それぞれ。(開口数 ≥0.3) の対物レンズが 10 倍を使用して、アメーバをイメージします。
   注: 寒天のカルセイン AM 蛍光グリーン チャンネルで蛍光死んでアメーバが発生します。健康なアメーバは蛍光以外の場合です。
2. 集録時間位相コントラストの光毒性を制限し、像の強度のダイナミック レンジを最適化する GFP チャンネルを調整します。必要に応じて差動干渉の対照 (DIC) の位相コントラストに置き換えて。
   注: は、可能であれば位相差顕微鏡および GFP 蛍光の 100-200 ms のエクスポー ジャーを使用します。実験全体を通じてそのまま露出と計測器の設定をしてください。これはホスト殺害のインデックスを計算するために重要です。
3. 殺害インデックス計算ホスト良いの統計情報を取得するために、少なくとも 100 のアメーバ細胞のイメージを取得します。

7. 画像解析とホスト殺害インデックス

1. ImageJ を用いた画像解析を実行します。
2. ファイルをクリックして ImageJ で位相コントラストの画像ファイルを開く |オープンイメージを選択するとします。画像をクリックすると、しきい値を調整 |分析 |しきい値。強度ピーク (図 3A) のみを選択する上限と下限のしきい値を調整します。
3. プロセスをクリックして、画像をバイナリに変換 |バイナリ |バイナリを作る。プロセスを選択することで穴を埋める |バイナリ |穴を埋める。
   注: は、ソースとして、図 1のイメージを使用して、手順 7.1 7.2 暗い領域 (図 3B) としてアメーバや細菌の表面接続が表示されます、画像が生成されます。
4. 分析で面積と平均グレー値のボックスを確認 |測定の設定。メイン ツールバーの [楕円] ツールを選択することで、アメーバのおおよそのサイズを測定します。[分析 |測定と代表的なアメーバの領域に注意してください。
5. 分析をクリックして、アメーバのマスクを作成 |粒子の分析。[サイズ] ボックス、アメーバが含まれますが、細菌を除外する領域を入力します。オプションを表示ドロップ ダウン メニュー バーでマスクを選択します。マネージャーに追加] ボックスがチェックされていることを確認します。
6. [Ok]と表示だけアメーバと ROI マネージャー] ダイアログが表示されます (図 3C) イメージをクリックします。
7. ファイルを使用して蛍光画像を開く |オープンし適切なファイルを選択します。Shift キーを押し、リスト (図 3D) の各地域をクリックするROI マネージャーですべての地域を選択します。
8. ROI マネージャーでメジャーボタンをクリックします。これは、各アメーバの平均強度の値を表示する結果ウィンドウが開きます。
9. 各アメーバの蛍光値を表計算プログラムにコピーし、蛍光のすべての値の平均を取ることによってインデックスを殺害ホストを計算します。

結果

育った野生型膿ひずみ PA14¹⁹または ΔlasR 6 cm 径シャーレで同じ PA14 背景に²⁰をひずみし、浮遊性および表面接続型細胞の病原性を検定します。文化は、PS:DB 文化、彩度を 37 ° C でローラー ドラムの培養管で一晩栽培にシングル コロニーから接種、PS:DB、100 rpm で揺れ 6 cm 径シャーレで 8 h の成長と浮遊性表面接続に 1: 100...

ディスカッション

このプロトコルでは、膿で病原性を試金する迅速・定量法について説明します。このプロトコルは、他の細菌テスト可能性があります。ただし、成長媒体がアメーバの成長条件と互換性があることを留意することが重要です。特に、我々 は細菌の成長媒体として PS:DB を使用してプロトコルを最適化してきました。その他のメディアを使用している場合、細菌細胞培地が、アメーバと?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	For filter sterilization
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Square 3-cup containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscope setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscope setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscope setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software for image analysis
MATLAB	Mathworks	R2013	Software for image analysis
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	For cooling media to 55 °C