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要約

細菌細胞は空間的非常に組織されます。遅い成長Myxococcus ザンサスセルに時間をかけてこの組織に従う、数世代にわたって高時空間分解能を持つ蛍光住セルイメージ投射のためのセットアップが開発されました。このメソッドを使用して、染色体分配と細胞分裂に重要なタンパク質の時空間ダイナミクスを決定でした。

要約

細菌細胞の蛍光住セルイメージ投射は、タンパク質と中央細胞周期イベントの基になる染色体の時空間ダイナミクスの解析に重要なメソッドです。ただし、画像の取得中には、成長の遅い細菌のこれらの分子のフルオロおよび光毒性のフォトブリーチングによる挑戦をイメージング。ここでは、 Myxococcus クサントス(4-6 時間の世代時間のある) 場合にこれらの制限を回避するための単純なプロトコルについて述べる。このため、 M. ザンサスセル、厚い栄養素を含む寒天パッド温度制御の湿気の多い環境で育ちます。これらの条件の下で単一のセルの成長に従って個々 の細胞の倍加時間を決定します。また、キー携帯処理で ParB YFP、FtsZ GFP、mCherry PomX など関連するマーカーの蛍光に分類された蛋白質を含んでいる細胞の蛍光住セルイメージ投射によって視覚化される染色体分配と細胞分裂など細胞周期。その後、取得したイメージは、モンタージュおよび/または映画を生成する処理されます。

概要

細菌細胞、空間的非常に多くの蛋白質の細胞コンパートメント1,2,3,4内で非対称的にローカライズする組織します。このローカリゼーションがしばしば非常に動的および細胞周期上の手掛かりまたは外部信号への応答に時間をかけて変更します。同様に、細菌の染色体は空間的高前に、と分離プロセス5中に細胞内の特定の場所に配置されている個々 の遺伝子座で構成されています。このダイナミックな空間組織は重要な成長、部門、細胞周期制御、分化、運動、シグナル伝達と同様、染色体組織と偏析;したがって、細菌の機能の本質的にすべての側面に影響します。

大腸菌枯草菌、コレラ菌、およびCaulobacter crescentus提供に重要な別の細菌種の様々 なこれらの細胞プロセスの時空間ダイナミクスを分析しています。モデル生物。ただし、これらの 4 種は、巨大な細菌の多様性の小さいスペクトルだけをカバーし、細胞組織と偏波のメカニズムはおそらくこれらの種の大規模な系統学的距離を考えると当然のことながら、これらが異なります細菌。これは、最終的に細菌細胞の時空間ダイナミクスの基礎となる原則を抽出できるようにする追加の細菌種の勉強の必要性を発生させます。

グラム陰性のデルタ proteobacterium M. ザンサスは社会的行動の研究のモデル生物、細菌6に協力。M. ザンサス厳密な好気性生物であり、栄養素の存在下で細胞が外側に非常に組織的で、群がってファッション、7他の微生物の餌に広がりのコロニーを形成します。栄養飢餓に応じて、セルを開始これは、内部細胞の何千もので構成される子実体の形成に結果発達プログラム棒状運動細胞分化に球形二倍体の胞子8。動作、すなわち、群がっておよび子実体形成の両方のタイプは、固体表面上に置かれた細胞によってのみ実行されます。さらに、両方の栄養条件下で細胞は、直接細胞間の接触運動を刺激する可能性がありますまたは受信者9,10 の毒素として機能する外膜リポ蛋白の交換を含むを含むプロセスに従事します。、12、細胞の LPS11、近隣のポリサッカライドによる運動の刺激の交換、細胞間シグナル伝達、細胞表面アンカー型蛋白質13,14をシグナリングします。

最近では、 ・ m ・ クサントス運動とその規制15、細胞分裂16,17,18, および染色体組織19 の基になるメカニズムを研究するためのモデル生物にもなっています。 ,20,21。重要なステップ、 ・ m ・ クサントス細胞周期は、関連の蛍光に分類された蛋白質16,を運ぶ緊張のスナップ ショット画像や短い時間経過の録音を使用して蛍光顕微鏡で詳細に分析されている17,18,19,20。理想的には、多くの細胞は蛍光ライブセル イメージング細胞周期パラメーターの堅牢な定量的データを取得する、少なくとも 1 つの完全細胞周期によって単一セルの解像度と従ってください。ただし、これは挑戦の場合M. ザンサス標準実験室の条件の下で 4-6 時間の比較的長い世代時間および fluorophores が付いて、画像集録中に光毒性の退色原因。

ここに従うプロトコルについて述べるM. ザンサス蛍光ライブ-細胞少なくとも 24 h の画像といくつかの細胞周期をカバーによって単一セルの解像度を持つセル。重要なは、プロトコル全体の中に細胞は寒天パッドに維持され、近くでの社会生活に欠かせない接触依存性活動を可能にするにお問い合わせくださいM. ザンサス。プロトコルは、高時間分解能と単一セルの解像度、モニターの形状、サイズ、部門、および蛍光プローブをユーザーができます、したがって、有効に細胞間変動の定量化と細胞周期イベントの相関関係。

プロトコル

1. 準備との成長M. ザンサス系統

注: は、表 1と表 2を参照してください。

  1. カナマイシン (50 μ g/mL) を添加した 10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 mM KH2PO4 pH 7.6, 8 mM MgSO422, 1 %casitone スープ (CTT) 成長中 1% (w/v) 膵臓のダイジェスト (例えば、バクト casitone)、カゼインを準備かオキシテトラサイクリン (10 μ G/ml)。それ以来他の細菌による汚染のリスクを減らすためにすべてのメディアにゲンタマイシン (10 μ G/ml) を追加M. ザンサス細胞が自然に耐性があります。
  2. 1 %5 mL を接種する CTT 関連を含む野生の 1 つ新たに育てられた植民地と抗生剤を参照」と入力 (WT) DK1622 23, SA4420 (ΔmglA)24SA4797 (ΔmglA、ΔpomX/PpomZ mCherry pomX)16, SA8241 (ΔmglA、 ftsZ+/PnatftsZ-gfp)、または SA4749 (ΔmglA、 parB+/PnatparB-yfp) で、1 日目の朝。
    1. シングルを再懸濁しますM. ザンサスCTT が生殖不能の管に抗生物質を添加した、全体の懸濁液を 50 mL の三角フラスコを 5 mL の 1% を含むに転送 1 %500 μ L の植民地 CTT。
      注: は十分な aeriation と最適な成長を保証するのに 10 回文化のボリュームと三角フラスコを使用します。
  3. 220 rpm、暗闇の中で揺れ、32 ° C で 8 世代 (4-6 時間の世代時間約 40-48 h) のセルを育てなさい。急激な成長の段階で細胞を維持 (外径550 < 1.2) 静止した段階に達することからそれらを防ぐためです。必要な場合は、新鮮な 1 %ctt 培 0.1 の OD550に関連する抗生剤を参照に細胞を希釈 - 0.2。
    注: 単一細胞顕微鏡用最適外径550は、0.5 - 0.7。この OD550で十分な細胞数により細胞パラメーターの統計的解析と同様に、定量化するイメージごとことがあります。

2. 顕微鏡用試料の調製

注: 顕微鏡で見られるようにセルを顕微鏡観察に配置して、栄養素を含む agarose パッドでカバーします。Coverslip がプラスチックに接着または機械的に提供するために金属製のフレームをサポートします。顕微鏡検査の準備で、1% の agarose/TPM/0.2% の大きいパッド CTT 準備されるべき事前 2.1 2.3 の手順で説明するように。ここで使用される特定の製品の材料の表も参照してください。

  1. TPM バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.6, 1 mM KH2PO4 pH 7.6, 8 mM MgSO4) の 500 mL を準備し、オートクレーブまたはフィルター滅菌ボトル上部フィルターを使用しています。
    注: 滅菌のバッファーは、室温で数ヶ月保存できます。
  2. 1% アガロースゲル顕微鏡 0.2% 溶液を準備 CTT (80 ml の TPM バッファーの 1 %ctt 培地 20 mL 寒天 1 g を混ぜて)。Agarose が溶融するまで電子レンジで加熱します。
    注: 0.2 %ctt はセル成長および飢餓を防ぐように十分です。顕微鏡の中で CTT の高濃度は、高いバック グラウンド蛍光になります。
  3. (11.5 cm × 11.5 cm 角シャーレ、溶融 agarose の約 60 mL が必要です) の 0.5 cm の厚さに溶融の agarose が付いてペトリ皿を記入し、室温まで冷ます。
    注: agarose のパッドは 4 ° c 湿度の高い環境で 2 日間保存できます。
    1. あらかじめ使用前に少なくとも 15 分の 32 ° C で 1% agarose/TPM/0.2% CTT パッドを温めます。
      注: 顕微鏡用細胞を準備するには、2.4 2.8 の手順に従います。
  4. 滅菌ガラス基板を配置 (60 mm × 22 mm、厚さ: 0.7 mm) 中間 (図 1A) に穴があるプラスチックや金属のフレームにこのフレームは薄い coverslip の機械サポートとして機能し、顕微鏡の中にドリフトを低減するのに役立ちます。フレームに coverslip をテープで固定します。
    1. フレームを準備するには、1 mm の厚さの金属板から 75 mm × 25 mm のフレームをカットし、真ん中に、適切なサイズの穴 (20 mm × 30 mm この実験で) をカットします。
  5. 指数関数的に成長の 10-20 μ L を追加M. ザンサス、coverslip のセル。
  6. マーカとして細胞またはコマ撮り録画で蛋白質の追跡を簡素化する細胞に蛍光の 0.5 μ m の微粒子を追加します。
    1. TPM バッファー内微小球 1: 100 を希釈し、数ヶ月まで 4 ° C で保存します。使用する前に徹底的に振る、希薄化後の微粒子の 5-10 μ L をセルに追加します。
      注: ここで微小蛍光にあるすべての一般的な青、緑、黄色と赤蛍光チャネルが使用されました。
  7. 大きな予め温めておいた 1% agarose/TPM/0.2% CTT パッドの coverslip のサイズは約小さなパッドをカット、細胞 (図 1B) の上に置きます。蒸発を防ぐために、湿度の高い環境で細胞を維持するために 1% agarose/TPM/0.2% CTT agarose パッド上に coverslip を配置します。
    注: coverslip を単独では少なくとも 2 時間の重要な蒸発を防ぐ。コマ撮り録画もう 1% agarose/TPM/0.2% CTT のパッドと coverslip のサンドイッチは、蒸発を防ぐためにパラフィン フィルムでシーリングをします。
  8. アガロース パッドの下部を付けるセルに 15 〜 20 分のための 32 ° C で顕微鏡サンプルをインキュベートします。微速度顕微鏡観察記録を開始します。

3. 顕微鏡のセットアップと時間経過の取得

注: ここで説明したプロトコル 100 X オート フォーカス機能付き広視野倒立顕微鏡用に開発された/1.30 NA 油 PH3 目的、X、Y 電動ステージ、sCMOS カメラ、光源、緑色蛍光用フィルター、赤い蛍光または黄色蛍光蛋白質および温度制御培養チャンバー。この室内は、一定温度、光から保護されているセルを保持します。

  1. 顕微鏡を開始する前に、インキュベーション室と 1 ~ 2 h の 32 ° C に顕微鏡を予熱します。
    注: 顕微鏡のセットアップによっては暖房が時間がかかります。予熱はドリフトの低減が不可欠ですし、オート フォーカス制御システムを安定します。
  2. 顕微鏡を切り替え、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。正しい目標を選択し、正しいミラーおよび取得フィルター相緑蛍光、蛍光、レッドまたは黄色蛍光タンパク質のイメージと同様にコントラストの画像。
    注: 顕微鏡は通常顕微鏡制御と画像の獲得のための好みのソフトウェアで提供されます。ここで市販のソフトウェアは、顕微鏡と画像集録を制御する使用された (材料の表を参照してください)。
  3. 目的の 32 ° C でプレインキュベートしたサンプルの下にレンズの上に高品質のイマージョン オイルの滴を追加します。サンプルは顕微鏡のステージに配置される場合、対物レンズの損傷を避けるために最も低い可能な Z 位置に目的を配置します。顕微鏡ステージ上にサンプル、目的に向かって「穴側」と金属フレームを配置します。ステージ ホルダーにサンプルを安全に固定します。
  4. 目標に近づく Z 方向にステージを移動することによって、細胞に焦点を当てます。オイルはサンプルの下側にしましたが、対物レンズを作る、遅い段階を移動接触。X でステージを移動/複数の単一セルまでの Y 方向は、ビューの領域で可視セルが焦点面で。取得した画像を後で調整するためにビューの領域は、その少なくとも 1 つの蛍光微粒子を確認します。
    注: 最適な条件でビュー (2,048 x 2,048 ピクセルまたは 133.1 x 133.1 μ m) の地域ごとの 15-30 セルの細胞密度を達成すべき。
  5. 顕微鏡に必要な場合に複数の波長とステージの位置の画像を取得することができる時間の経過実験を設定する顕微鏡制御ソフトウエアの多次元取得ウィザードを開きます。
    1. [メイン] タブでは、タイムラプス複数の波長を有効にします。ウィンドウの左側にある追加のタブが表示されます。
    2. タブの保存と取得した画像を保存するコンピューターのハード ドライブに空のフォルダーを選択するディレクトリの選択]をクリックします。連続データセットは、以前のものを上書きしないことを確認するファイルが存在する場合に基本名をインクリメントをアクティブにします。その後、実験日付と緊張の名前や実験のタイトルに名前を付けます。
    3. コマ撮りのパラメーターを調整するタイムラプスタブをクリックします。期間は 24 時間に設定し、時間間隔を 20 分に設定します。時間ポイントの数が自動的に変更されます。
      注: 最適な時間間隔は、実験と分析対象とする細胞の機能に依存します。頻繁に画像関連の買収は、退色を引き起こす可能性があります。したがって、時間分解能と退色のトレードオフを経験的に見つけられなければなりません。4-6 h の倍加時間で取り込みが可能簡単に 5 分 (またはさらに小さい間隔必要な場合) の間隔で位相差顕微鏡の。24 h の時間経過とともに蛍光顕微鏡の画像は約 15-30 分の間隔で記録する必要がありますが必要なかどうか。
    4. 各時点で各画像の数を変更することによって取得する波長の波長タブをクリックを選択します。
      注: 各波長の新しいタブの左側に表示されます、多次元買収"ウィザードと波長を上から下への順序で取得されます。各波長取得設定を個別に変更できます。
    5. 上から最初の波長のタブをクリックします。照明のドロップ ダウン リストで位相コントラストを選択します。露出の 100 ms を選択し、取得のドロップ ダウン リストに毎回ポイントを選択します。ドロップ ダウン リストにしないを選択することで自動公開を無効にします。
    6. ステップ 3.5.5 各時点で取得する必要があります各波長に対して繰り返します。実験のセットアップと蛍光に分類された蛋白質の説明ここでは、次のパラメーターを使用して露出: mCherry 融合蛋白質を 250 ms、YFP 融合蛋白質を 200 ms、GFP の融合蛋白質の 1,000 ms。
      注: ひずみおよび蛍光タンパク質ごとの最適な照明の設定は、ランプの強度と各波長の画像の取込時間を変更することによって事前に決定する必要があります。長すぎる画像集録時間は光毒性の効果を増加し、最終的に成長の逮捕や細胞の死に 。したがって、画像品質と細胞生存率のトレードオフを達成する必要があります。
    7. 同じ実験に記録されているセルの数を増やすの複数のステージ位置からの画像を取得します。
      1. 複数ステージ位置から画像を取得するには、[メイン] タブで複数ステージ位置をアクティブにします。[ステージ] タブをクリックし、ライブをクリックして、ビューのフィールドを見てください。
      2. 利益 (率 ROI) の領域は、ビューのフィールドまで、X ・ Y 方向のステージを移動します。保存、X 座標と Y 座標をクリックして、「+」ステージ] タブでステージを再度移動 X ・ Y 方向の新しい ROI が見つかるまで、座標保存もう一度「+」をクリックします。希望領域数が保存されるまで行きます。
        メモ: 蛍光画像の取得の場合、必ず関心 (ROIs) の領域ではないことに近すぎるお互いの光毒性を最小限に抑える。
  6. セルに保存されている X-、Y-位置の違いをクリックしては、フォーカスと実験の過程で保存された Z 位置を一定に保つAFC を保持するをクリックしてハードウェアのオート フォーカスを開始するもう一度チェックしてください。
  7. 顕微鏡制御ソフトウエアの多次元取得ウィザードを取得をクリックして時間経過の録音を開始します。
    注: 1 つのウィンドウ表示されます各波長を取得して取得した時点で、次の画像を取得するまでの時間数が表示されます追加のウィンドウが表示されます。
  8. 画像の品質を最大化し、必要な場合に焦点を当てる時間経過の録音で最初の数時間ポイント後セルがフォーカスでまだであるを確認します。

4. コマ撮りムービーや画像の配置の生成

注: いくつかの商業およびフリーソフトのパッケージ、画像取得と画像解析のために利用できます。我々 は市販のソフトウェアを使用して (材料の表を参照) と複数の事前インストールされているプラグインと追加のツール。

  1. 画像解析/処理ソフトウェアがインストールされているコンピューターで時間経過の録音から個々 の画像を保存します。
  2. ソフトウェアを起動し、スタックとしてレビュー多次元データをクリックして画像を開く |基本ファイルを選択 |ディレクトリを選択して。多次元データのフォルダーを開きます。データセットをチェックし、表示をクリックしてくださいデータセットは、時間から 1 つの画像が終了するまで 1 つをポイントとして表示されます。(スタックを作成する) の波長をアクティブに、ロードの画像をクリックしてスタックにするすべての画像を選択します。すべての波長にこの手順を繰り返し、完成したスタックを保存します。
  3. (省略可能)ファイルを使用して映画に必要なすべてのイメージを開く |オープン。
    注: お勧め画像を開く 1 つ買収した波長によって時に計算能力が制限されている場合、コンピューターを遅くしません。時間経過の録音、例えば開始、最後に、またはいくつかの時間ポイントの特定の部分をスキップする必要がある場合、これは完成した映画で調整できます。
  4. ドリフトを補正する必要があるイメージのスタックを有効にします。アプリで位置合わせツールを開く |. 配置を自動画像と参照平面として初めて平面のポイントのソースとしてチェックスタック。ソース スタック] ボタンでスタックを選択し、[適用] をクリックします。
    メモ: 自動配置されます、いくつかの時間や計算パワーですが顕微鏡のセットアップのドリフトのビッグ スタックを修正するための良い方法です。この自動アライメントは、微粒子が含まれますがそれらなしで動作可能性がありますも場合にも動作します。
  5. アライメントのスタックを保存します。
  6. ・ ロワを使用します。
    注: 蛍光タイムラプス顕微鏡は簡単に大きな計算能力の多くを取る、これらの映画の下流の処理が遅くなるデータ ファイルのセットを作成します。したがって強くお勧め・ ロワを識別し、小さいファイルで動作するようにセルを隔離します。
    1. 矩形ツールを選択します。位相コントラスト画像の ROI を手動で描画することによって興味のセルの周り ROI を作成します。興味のセルが表示されている、全体の時間経過映画を通してフォーカスであることを確認します。
    2. 同じデータセットの第 2 波長のコマ撮りムービーを開きます。位相コントラスト画像から蛍光に投資収益率を転送する第 2 波長の画像は、地域で転送領域ツールを使用して |領域を転送。ソース イメージとターゲット イメージとして第 2 波長データセットとして位相コントラスト データセットを選択します。すべての地域を選択し、 [ok]を押します。
    3. ステップ 4.6.2 同じデータセットの取得各波長に対して繰り返します。
    4. ROI を選択して編集でスタックとして複製 |重複 |スタック...か、 Shift + Ctrl + Dキーを押します。ファイルで重複したスタックを保存 |保存元のデータと同じフォルダーにします。
    5. 同じデータセットの取得すべての波長の各 ROI について手順 4.6.4
  7. Mov 形式または AVI 形式でムービーを生成するスタック経由でムービーの作成関数を開く |映画を作る。ソース スタック] ボタンと時間経過の録音を選択します。出力フォーマット、フレーム レート、フレームの数を選択し、[保存] をクリックします。

結果

M. ザンサス固体表面上に移動遅い成長している細菌です。我々 の実験の設定をテストするため運動性 DK1622 WT 細胞タイムラプス実験を行った。位相コントラスト画像に 24 h (図 2A、B) の 5 分の間隔で買収されました。セルの大半はグループに配置されます。予想通り、細胞運動を表示し、グループで主に移動します。さらに、細胞が時折運動の方向を逆転を観察しました。これらの所見は、テスト条件下で WT 細胞が細胞の運動性の面で正常に動作します。しかし場合でも、細胞は、5 分ごとに記録され、個々 の細胞の同定は難しいです。さらに、細胞は運動なので多くの細胞は脱出か長時間セルを従うこと困難にビューのフィールドを入力します。

同じを追跡するためにM. ザンサス細胞運動25のために不可欠であるmglA遺伝子の生細胞イメージングによる細胞周期のいくつかのラウンドの個々 の緊張を削除できます。これは細胞がイメージング プロトコル間の視野の外に移動することを防ぎます。フレームの削除は、市らで説明されているように生成されます。26

位相コントラスト住セルイメージ投射非運動性 ΔmglA細胞 (図 3) と、期待どおりにセルにアクティブな動きが表示されませんでした。コロニー形成の間に個々 の細胞の分裂や成長することができました。24 時間 5 分の間隔で得られた画像をコマ撮りの記録に基づいて、単一セルの解像度と interdivision 時間 (細胞分裂の 2 つのイベント間の時間) を定量化することが可能だった。ΔmglA変異体の細胞は 235 ± の間部門時間 50 分 (n = 97 細胞)。約 4 時間の interdivision 時間は WT 細胞懸濁培養における測定倍加時間と同様です。これは、証拠を提供しますM. ザンサス細胞成長これらの実験条件下で最適。

蛍光タイムラプス イメージングを行った私たちの設定が通常は長期間にわたって YFP 標識タンパク質を追跡しながら成長する細胞をできるかどうかを調べるには、 ・ m ・ クサントスYFP タグ付きタンパク質を発現する細胞。このため、レプリケーション (ori) の起源のためのマーカーとして ParB YFP を続きます。ParABSシステムのコンポーネントとしては、ParB M. ザンサス ori; に近位部サイトにバインドとしたがって、原点の複製と染色体の分離は、続いて19,20,21をすることができます。画像集録 (位相差顕微鏡および蛍光、YFP チャンネルで 200 ms のアクイジション時間) 20 分毎、細胞成長、分割、24 h (図 4A) でも成長を表示しました。録音開始時 ParB YFP は細胞 (図 4A) の大半の亜寒帯地域に 2 つのクラスターを形成しました。亜寒帯 ParB YFP クラスターの重複して古い細胞極に直前にまたは細胞分裂後。2 つのクラスターの 1 つは、2 番目のコピーは約 40-60 分 (図 4a, B) 後に最終的な亜寒帯位置に達し、新しい細胞極転しながら古い細胞極にとどまっています。これらの観察は、薄い寒天パッド19を使用して短い時間経過の録音から生成された前のデータと一致しています。この実験的 set-up 遅い成長にいくつかの細胞周期にわたって染色体分配を追跡する蛍光タイムラプス顕微鏡を終えてM. ザンサス摂動の細胞の成長や染色体分離機械なしのセル。

同様の実験では、タイムラプス蛍光顕微鏡による細胞分裂のためのマーカーに従うことを求めた。ほぼすべての他の細菌と同様M. ザンサス細胞分裂16,17,18の FtsZ の細菌のチューブリンのような gtp アーゼが必要です。FtsZ は、midcell、いわゆる Z リング、細胞分裂27,28に必要なすべての他の蛋白質を募集することでリング状の構造を形成します。M. ザンサス、Z リングと midcell でその位置の形成は 3 つの PomXYZ 蛋白質16,17によって刺激されます。これらの 3 つのタンパク質は、「母」細胞の細胞分裂サイトから 2 つの娘細胞核中に、核様体の間で転送する染色体関連の複合体を形成します。核様体の中央は PomXYZ 複雑な新兵 FtsZ 染色体分配とここでする前に、midcell と一致して Z リング形成を刺激します。

ここでは、我々 はまずftsZ gfpを発現する非運動性細胞を追った。弱い蛍光信号 ParB-YFP より露光時間を 5 倍増加我々 FtsZ GFP 全体ショー 1 GFP チャネルで s。予想通り、FtsZ GFP の強力な蓄積はのみ midcell で認め、この局在決定くびれ細胞分裂 (図 5A) の位置。FtsZ GFP は主に長いセルに midcell でクラスターを形成します。また、このクラスターが時間の経過とともに強度の増加は明らかだった。細胞分裂後、約 2 時間後 (図 5B) を 2 つの娘の midcell で再蓄積 FtsZ GFP に細胞を観察した.これはセル人口の約 50% が FtsZ ローカリゼーションを midcell スナップ ショット分析16,17に基づく表示見つけると一貫性が。

2 番目の実験では、 mCherry pomXを発現する 24 h の非運動性 ΔmglA細胞を追ったPomXYZ システムの一環として、PomX は、それによって midcell16で細胞分裂を刺激 Z リング形成と位置決めのガイドに役立ちます。MCherry PomX の蛍光信号が強いと 250 さんの蛍光チャネルの重要な露出時間をことができます、すべてのセルのサイズが増加したし、24 h (後 microcolonies を形成、実験の過程での細胞分裂のイベントを表示図 6A)。以前に報告された16としては、ほとんどすべての細胞は、mCherry PomX クラスターを含まれています。Midcell、midcell の実験の過程で midcell に転流からクラスターに局在したこれらの大半。細胞分裂中に mCherry PomX クラスターは、クラスターを受け取る各娘細胞に分割されました。FtsZ 遺伝子の発現ではなく mCherry PomX は細胞周期の midcell の 80-90% でローカライズし、細胞分裂 (図 6B) 後すぐにこの位置に達した。

figure-results-4240
図 1: この研究を通して使用実験のセットアップのスケマティック。(A) A 金属またはプラスチック フレームをサンプルのサポートとして提供しています。観察は、サンプルの動きを減らすためにテープで金属製のフレームに固定されます。(B) 側は実験サンプル セットアップの表示します。(A) に示す coverslip の上にマウントされています。栄養素と細胞に湿度を供給する agarose パッドは、セルの上に配置されます。アガロース パッドは、蒸発を減らす追加 coverslip で覆われています。高品質の画像、100 X オイル浸漬位相コントラスト目的が使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4873
図 2: 位相コントラスト WT のタイムラプス顕微鏡M. ザンサスセル。細胞が 24 時間続いていたし、画像は 5 分毎に (A) を取得した同じフィールド ビューの 5 分ごとの代表的な画像が表示されます。色付きの矢印は、個々 のセルの移動の方向性を示します。同じ色は、時間の経過とともに同じセルをマークします。数字は分単位の時間を示します。スケール バー: すべての時間後のビューの同じフィールドの 5 μ m. (B) 画像が表示されます。ビューの同じフィールドが表示されますが、セルは移動なので細胞が絶えず出入りするビューのフィールドに注意してください。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. PH: 位相コントラスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5537
図 3: 位相コントラスト非運動性の微速度顕微鏡観察M. ザンサスセル。ΔmglAセル後 24 時間の画像が 5 分ごとに取得し、時間ごとに代表的な画像が表示されます。選択した細胞分裂の狭窄部は、オレンジの矢印が付いています。数字は、時間の時間を示します。PH: 段階の対照。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5988
図 4: 非運動性で ParB YFP の蛍光タイムラプス顕微鏡M. ザンサス細胞。ΔmglA変異発現 parB yfpネイティブparB (SA4749; ΔmglA; 存在下での細胞parB+/PnatparB-yfp) 位相コントラストと蛍光顕微鏡が 24 時間続いていた。20 分毎に買収された (A) 画像と位相コントラストのオーバーレイと、YFP の信号と位相 (PH) で 24 時間の画像が表示されます後は、同じセルと共に、10 h が表示されますまでの代表画像 1 時間ごと。選択した細胞の分裂は、オレンジの矢印が付いています。白と緑の矢印は、通過のクラスターをマーク緑色の矢印と ParB YFP クラスターの重複イベントを示しています。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. (B) イメージは (A) のように買収されたが、高い時間分解能で表示されます。数字は分単位の時間を示します。矢印は、(A) のようにです。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-6890
図 5: 非運動性で FtsZ GFP の蛍光タイムラプス顕微鏡M. ザンサスセル。ネイティブftsZ (SA8241; ΔmglA; の存在でftsZ gfpを発現する ΔmglA変異体の細胞ftsZ+/PnatftsZ-gfp) 位相コントラストと蛍光顕微鏡が 24 時間続いていた。(A) の画像が 20 分毎に取得し代表的な画像 10 h まで 1 時間おきのとおり、位相コントラストと gfp のオーバーレイと位相 (PH) で 24 時間後の同じセルと共に画像が表示されます。選択した細胞の分裂は、オレンジの矢印が付いています。白い矢印は、midcell で FtsZ GFP クラスターを示しています。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. (B) イメージは (A) のように買収されたが、高い時間分解能で表示されます。数字は分単位の時間を示します。緑と白の矢印はそれぞれ左と右のセルの FtsZ GFP クラスターをマークします。オレンジ色の矢印は、細胞の分裂を示しています。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-7803
図 6: 非運動性で mCherry PomX の蛍光タイムラプス顕微鏡M. ザンサスセル。非運動性 ΔpomX細胞 mCherry PomX (SA4797; ΔmglA; ΔpomX/PpomZ mCherry pomX) を集積が位相コントラストと蛍光顕微鏡 (A) 20 分ごとに 24 時間続いていた代表的な10 時まで 1 時間ごとに表示されるイメージ、位相差顕微鏡および mCherry のオーバーレイと位相 (PH) で 24 時間後の同じセルと共に画像を示す信号。選択した細胞の分裂は、オレンジの矢印が付いています。白と緑の矢印は前に、と後のイベントをそれぞれ分割 mCherry PomX クラスターを示しています。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. (B) 画像 (A) のように買収され、高い時間分解能で表示されます。矢印は、(A) のようにです。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

菌株関連する遺伝子型1参照
DK1622野生型23
SA4420ΔmglA 24
SA4749ΔmglA; parB+/attB:: PnatparB yfp (pAH7)この研究
SA4797ΔmglA;ΔpomX/attB::PpomZ mCherry pomX (pAH53)16
SA8241ΔmglA; ftsZ+/mxan18 19::PnatftsZ gfp (pDS150)この研究
プラスミドかっこで示された遺伝子の融合を含むとゲノムで示されているサイトの [附属されました。
AttBサイトにおける総合的なプラスミッドまたはmxan18 19遺伝子間領域から表現されました。
ネイティブ プロモーター (Pnat) または pomZ (PpomZ) のネイティブのプロモーター。

表 1: この研究で使用される細菌のリスト。

プラスミド関連する特性参照
pAH7PnatparB yfp;Mx8 attP;テトR 19
pAH53PpomZ mCherry pomX;Mx8 attP ;KmR 16
pDS150 1 PnatftsZ gfp 。mxan18-19 ;テトR この研究
pMR3691バニリン酸誘導性遺伝子の発現プラスミド18
pKA51PnatftsZ gfp 。Mx8 attP;テトR 17
1 pDS150: pDS150 mxan18 19遺伝子間領域に置き換えられましたMx8 attPサイトの pKA51 の誘導体であります。
このためmxan18 19遺伝子間領域 Mxan18 19 fwd BsdRI プライマーと pMR3691 から増幅されました。
(GCGATCATTGCGCGCCAGACGATAACAGGC) および Mxan18 19 rev BlpI
(GCGGCTGAGCCCGCGCCGACAACCGCAACC) と pKA51 に複製されました。

表 2: この研究に供するプラスミドのリスト。

ディスカッション

蛍光住セルイメージ投射細菌細胞の時空間ダイナミクスを研究するための強力なツールとなっています。運動と遅い成長する細菌などのタイムラプス蛍光顕微鏡M. ザンサス、しかし、挑戦されている、短時間に行っただけ。今回の生きているセルイメージ投射のための簡単に使用できる、堅牢なメソッドM. ザンサスタイムラプス蛍光顕微鏡による。このメソッドでは、セルおよび単一セルの解像度による細胞周期のいくつかのラウンドの蛍光に分類された蛋白質に従うことができます。

成長が遅いの住セルイメージ投射の成功に影響を与えるいくつかの前提条件があるM. ザンサスを含む細胞: 1) 細胞接着のための固体表面2) 栄養素や酸素の空室状況3) 一定の湿度と温度;・ 4) 露出時間と画像の取得頻度などの実験条件の最適化。

私たちの実験設定栄養素を添加した agarose の厚いパッドを使用します。単一のセルに従う厚いアガロース マイクロ流体デバイスではなくパッドを使用するいくつかの基本的な利点がいくつかの欠点もあります。まず、アガロース パッドの表面だけでなくM. ザンサス添付ファイルや運動だけでなく、少なくとも 24 時間の成長のための十分な栄養素を細胞します。第二に、スナップ ショット分析一般的蛍光に分類された蛋白質の細胞内局在性を研究するために使用以前同じタイプのアガロース パッド16,17,29に行われていた。したがって、ここで説明した方法で得られるデータをスナップ ショット分析からデータを直接比較できます。第三に、アガロース パッドを簡単に変更および抗生物質や CuSO4などの他のサプリメントを補充することができます、バニリン酸一般的に使用される遺伝子発現誘導18,30。最後に、細胞は実験の過程でフォーム microcolonies を許可するためこの設定できますを分析して特定のパラメーターに直接細胞間相互作用の効果を勉強します。この側面の場合特に重要ですM. ザンサスこの細菌はいくつかの接触依存性相互作用を表示するため。このメソッドの主な欠点は、実験期間中に実験条件を事前設定です。対照的に、マイクロ流体デバイスは一般に実験の過程で例えば抗生物質31を追加して実験条件を変更できます。

フリー ソフトウェア パッケージ (例えばMicrobeJ、Oufti) が自動的に単一細胞および細胞内蛋白質のローカリゼーションの拡張の分析に使用できます。ただし、これらのソフトウェアは、のみ単一のセルまたはセルの小さいグループの分析に適しています。したがって、ここで説明した 24 h 録画用に生成されたデータを自動的に分析する課題が残った。

要約すると、成長が遅いと住セルイメージ投射を実行する簡単に使用できる、再現可能なプロトコルについて述べるM. ザンサス細菌。単純な栄養添加 agarose パッドが少なくとも 24 時間成長を維持し、観察し、蛋白質のローカリゼーション、数世代にわたって単一セルの解像度と成長の分析を可能にするための十分なことを示します。

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は Transregio 174 "時空間ダイナミクスの細菌のセルの枠組みの中でドイツ語研究評議会 (DFG) によってサポートされていた"とマックス ・ プランク協会。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMI6000B with AFCLeica microsystems11888945Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control
Universal mounting frameLeica microsystems11532338Stage holder for different sample sizes 
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3Leica microsystems11506197Phase contrast objective
Orca Flash 4.0 cameraHamamatsu115329524.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition
Filter set TXR ET, kLeica microsystems11504170Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75
Filter set L5 ET, kLeica microsystems11504166Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30
Filter set YFP ET, kLeica microsystems11504165Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III PriorH117N1, V31XYZEF, PS3J100Microscope automation controller with interactive control center
EL 6000 light sourceLeica microsystems11504115External fluorescence light source
Incubator BLX BlackPecon11532830Black incubation chamber surrounding the microscope
Tempcontrol 37-2 digitalLeica microsystems11521719Automated temperature control for incubation chamber
Gentmycin sulphateCarl Roth0233.4Gentamycin
Oxytetracylin dihydrateSigma Aldrich201-212-8Oxytetracyclin
Kanamycin sulphateCarl RothT832.3Kanamycin
Filtropur BT25 0.2 bottle top filterSarstedt831,822,101Bottle top filter for sterilization of buffers
DeckgläserVWR630-1592Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm)
Seakem LE agaroseLonza50004Agarose for microscopy slides
Leica Metamorph AFLeica microsystems11640901Microscope control software and software for picture analysis
Tetraspeck Microsperes, 0.5 µmThermoFisherT7281Fluorescent microspheres
petri dishGreiner Bio-one688102120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads
BD Bacto CasitoneBecton Dickinson225930Casitone
Parafilm MVWR291-1213Parafilm
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaneCarl RothAE15.2Tris
Magnesium sulphate heptahydrateCarl RothP027.2Magnesium sulphate
Potassium dihydrogen phosphate p.a.Carl Roth3904.1Potassium dihydrogen phosphate
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4Cultivation medium for M.xanthus
TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus

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