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要約

開花植物の殺菌剤散布が孤独な蜂花粉媒介殺菌剤残留物の高濃度にあります。生体外で実験室の実験を使用して-飼育ハチの幼虫、この研究調査ホストと非ホストの植物由来殺菌剤処理した花粉を消費のインタラクティブな効果。

要約

孤独な蜂は、野生とマネージ作物の重要な受粉サービスを提供する、この種豊富なグループは、主として農薬規制研究に見過ごされています。殺菌剤残留物への暴露のリスクがスプレー蜂が巣を提供する花粉を収集しているときや、ホスト植物の近くが発生した場合に特に高する可能性があります。植物 (oligolecty) の選択グループから花粉を消費するツツハナバチの種、非ホストの植物からの花粉を使用することができないことは殺菌剤関連毒性の危険因子を増やすことができます。本稿では、正常に oligolectic オーチャードメイソン蜂、標準化された実験室条件下での細胞培養皿の中で前のステージに卵からのツツハナバチ ribifloris sensu lato をリアに使用されるプロトコルについて説明します。体外の飼育ミツバチ蜂フィットネスに及ぼす殺菌剤の露出と花粉のソースを調べるに使用されます。実験 2 × 2 完全に交差因子設計に基づき、前バイオマス、幼虫の発生時間生存し、定量化、幼虫のフィットネスに殺菌剤の露出と花粉の源のメインと対話型効果を調べます。この手法の主な利点は、体外を使用して-飼育ミツバチ自然背景変動を削減し、複数の実験的パラメーターの同時操作。記述されていたプロトコルは、ミツバチの健康に影響を与える要因のスイートを含むテストの仮説のための多目的なツールを示します。保全努力の重要な不変の成功で満たされる、生理学的および環境の蜂の減少要因の複雑な相互作用にこのような洞察力が重要なことを証明します。

概要

訪花昆虫群集の1の支配的なグループとしての役割を与え、ミツバチの人口世界的な損失は、食料安全保障と生態系の安定性2,3,4,5,6 に脅威を与える ,7。両方の管理と野生のミツバチの人口の減少傾向は、生息地の断片化、新興寄生虫および病原体、遺伝的多様性の損失、外来種3 の導入を含むいくつかの共有リスク要因に起因しています。 ,4,7,8,9,10、11,12。特に、殺虫剤、(例えば、ネオニコチノイド) の使用の劇的な増加は、蜂13,14,15間の有害な影響に直接リンクされています。いくつかの研究は、ネオニコチノイドとエルゴステ ロール生合成阻害 (EBI) 殺菌剤との相乗効果が複数の蜂種16,17,18の間で高い死亡率につながることを示しています。,19,20,21,22. それにもかかわらず、防かび剤、長い ' 蜂-、安全であると考え続ける多くの精査23なしブルームの作物に噴霧します。採餌蜂は、定期的に殺菌剤の残留24,25,26で汚染された花粉荷を戻すために記載されています。このような殺菌剤 ladenpollen の消費が幼虫蜂27,28,29,30と大人の蜂16間で致死性効果のスイートの中で高い死亡率を引き起こす可能性,31,32,33,34. 最近の研究提案する殺菌剤が蜂と花粉媒介微生物35間重要な共生をそれにより中断ハイブに格納されている花粉内の微生物群集を変えることによってミツバチの損失を引き起こす可能性があります。

孤独な蜂はいくつか野生および農業植物36,37,の受粉のために不可欠ですが38、花粉媒介者のこの多様なグループは農薬モニタリング調査であまり注目を受けています。大人の孤独な女性の巣 5 10 密閉育児室、母性収集した花粉や蜜、単一卵39の有限質量とそれぞれ貯蔵します。孵化後、幼虫は割り当てられた花粉提供と十分な栄養40,41を取得する関連付けられている花粉媒介微生物叢に依存します。社会のライフ スタイルの利点がない、ために、孤独な蜂は農薬暴露42より傷つきやすいかもしれません。社会蜂スプレー、次に赤字中が補償する例えば、いくつかの労働者によって拡張し、新興国ひな、単一の大人の孤独な女性の死終了すべての繁殖活動43。感受性のような差異は、マネージ コードと野生の蜂同様の十分な保護を確保するための生態毒物学的研究の多様な蜂イチイを組み込む必要のあるを強調表示します。ただし、研究の一握り、脇から殺菌剤曝露の影響の調査主に当てている社会蜂18,23,32,44,45 ,46,47,48,49。

孤独な蜂属ツツハナバチ(図 1) はいくつかの重要な果物とナット作物39,50,51,53,の効率的な花粉媒介者として世界的に使用されています。53他のマネージの送粉者と24,54,55,56,,5758のグループ、、成人のツツハナバチ蜂が日常的に。ブルームの作物44に噴霧殺菌剤にさらされます。最近散布作物の成人女性が収集し、殺菌剤を含んだ花粉の後で開発の幼虫の唯一の食事療法を形作る彼らのひな部屋を買いだめ。汚染された花粉規定を消費してその後殺菌剤の残留42幼虫を公開できます。暴露のリスクはいくつか密接に関連ホスト植物59,60,61上だけ飼料 oligolectic 種以上あります。特定の野生のミツバチは、たとえば、優先的に寄生62の減少の手段として低品質キク科花粉用飼料に表示されます。しかし、殺菌剤影響 oligolectic 孤独な蜂の幼虫のフィットネスを与える程度は経験的定量化されていません。本研究の目的は、メインをテストするためのプロトコルを開発する、対話型生体外でのフィットネスに及ぼす殺菌剤の露出と花粉のソースは孤独な蜂を飼育しました。調べるために、 O. ribifloris sensu lato (s. l.) の卵を商業的に得ることができる (材料表)。この人口はネイティブの粉と地域53,報63,64 内花蜜豊富なヒイラギナンテン aquifolium (オレゴンブドウ) のの強い好みとしてその重要性のため理想的です(図 2)。

figure-introduction-4338
図 1。大人のツツハナバチ ribiflorisの高解像度写真。写真クレジット研究昆虫博士ジム杖 USDA-ARSこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-introduction-4663
図 2。.フォア グラウンドでネスト女性ツツハナバチ ribifloris (s. l.)の葦をネスト Phragmite商工会議所パーティションと葦の端子のプラグは、練りの葉から構成されます。写真クレジット キンボール クラーク氏 NativeBees.comこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

本研究の第一の目的は消費する (開発時間と前バイオマスの面で測定される) 幼虫のフィットネスで花粉を殺菌剤処理の効果を評価します。広く用いられている殺菌剤 propiconazole への露出は、いくつか種23,24,32,44,45、間大人のミツバチの間で死亡率の増加にリンクされている中 54,55,56,57,58,65,66,67, 幼虫蜂への影響が小さい知られています。本研究の第二の目的は、幼虫フィットネスで非ホスト花粉を消費の影響を評価することです。以前の研究では、oligolectic 蜂の幼虫が非ホスト花粉68消費を強制する場合の開発に失敗することを示します。このような結果は、蜂生理学69、花粉生化学70、および関連付けられている天然の花粉規定71有益マイクロバイ変化に起因する可能性があります。本研究の第 3 の目的は、幼虫のフィットネスに殺菌剤治療と食事花粉のインタラクティブな効果を評価することです。

母体サイズなど多数の生物学的特徴、準備率、採餌戦略と花粉量72,73,74,75知られている孤独な蜂の幼虫のフィットネスに影響を与えます。これらの要因は、葦、幼虫の健康を評価するとき防御実験デザインの開発に挑戦をもたらすとの間の有意な変動を導入できます。また、密封された入れ子葦中幼生が発生すると、子孫にそのような変動の影響が視覚化することは困難と定量化された非殺傷技術 (図 3) を使用してせず。このような課題を克服するために本研究の内ですべての仮説は、その入れ子の葦の外飼育幼虫を用いたテストされます。実験的なデザインを完全に交差 2 × 2 因子のセットアップ、2 レベルから成る各因子とを表します因子 1: 殺菌剤暴露 (殺菌剤;ない殺菌剤);要因 2: 花粉の源 (ホスト花粉、非ホスト花粉)。蜂は、卵から管理された実験室の条件下で無菌 multiwell 細胞培養皿の中で前の段階に発生します。それぞれはよく花粉規定と 1 つの卵の標準化された量の貯蔵は個別に。孵化後、幼虫が井戸の内で割り当てられている花粉のフィードし、幼虫の発育が完了すると蛹化を開始します。過去の研究では、原因不明の死亡が野生49,76で遭遇よりもこの人工飼育環境内で発生したミツバチの間で低いことを示しています。生体外での使用-飼育ミツバチ フィールド ベースの研究上のいくつかの利点がある: 1) 自然変動とフィールド ベースの研究に通常関連付けられているコントロール不良要因の交絡影響を最小限に抑える2) ことができます;、試験治療グループ間で同時にテストに関心の各因子の操作の複数のレベル3) 複製の数があらかじめ決められた、することができ、各複製の実験的要因を個別に操作できます。4) 幼虫応答変数が簡単に可視化し、不穏な隣接する幼虫; せず個別に記録されました。5) プロトコルは、複数の要因と応答の変数を含むより複雑な実験的デザインに合わせて変更できます。

figure-introduction-7144
図 3。自然営巣リード内の内容ツツハナバチ ribifloris (s. l.). (A)たて個々 の室、花粉規定とパーティション、および(B)を示す解剖葦収穫花粉規定と関連付けられた卵 (黒い丸で示されます) のクローズ アップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

1. 殺菌剤曝露実験のための Propiconazole ソリューション

  1. 実験の日滅菌水で商業的に購入した propiconazole 14.3% の適切なボリュームを溶解することにより 0.1 x 殺菌剤液を準備します。すべての治療に唯一の作りたて殺菌ソリューションを使用することを確認します。
  2. 23 x 花粉花粉蜂収集24 (0.361 PPM または花粉の有効成分 g-1 μ g) 以前報告された propiconazole の最大濃度を取得提供のグラム当たりの殺菌剤液 0.1 μ L を追加します。

2. 卵とツツハナバチ葦からホスト花粉規定を収穫します。

  1. 滅菌メスを使用して、分析するたてツツハナバチの葦を入れ子にし、個々 の部屋を公開するリードの長さに沿って 2 つの部分に分割を接続します。
    注: 各巣は 8 に 14 室と部屋の内の 1 つの卵の間にあります。
  2. 以前に発行されたガイドライン77に基づいて男性の卵を含む部屋を識別するために視覚的にリードを確認します。入れ子のリードから関連付けられた卵と一緒に各花粉の規定を削除し、きれいな配置滅菌曲がった針の使用ボートの重量を量る。
  3. 優しくきれいな細かいペイント ブラシを使用してくださいプロビジョニングから黄身花粉提供の新鮮重を記録し、卵の規格研究所バランスを使用してください。男性花粉規定の平均体重を計算します。
  4. 温度上昇と脱水への暴露から卵に損傷のチャンスを減らすために最小の遅延で後続の手順を実行します。

3. ホスト植物花粉規定を準備しなさい

  1. 寄生虫には現在78がないを確認する入れ子の部屋から発掘された母性集められたホスト植物花粉を目視で確認します。任意の潜在的な母性のバイアスを減らすために滅菌シャーレで単一のマスに花粉規定を組み合わせるし、滅菌針でよく混ぜ。
  2. 合計の質量を分ける新しい花粉規定、各再構成された規定の重量が自然に割り当てられた男性規定の平均体重にほぼ等しい (意味 ± 0.35 ± 0.01 g SE N = 42)。
    注: ためツツハナバチ sp。男性の子孫、女性77に比べてオス幼虫の低体重で、この結果に小さい花粉規定を割り当てます。いずれかにセックス固有の相違から生じるこのような偏りを避けるため、実験では男性の卵のみを使用します。

4. 非宿主植物花粉提供を準備します。

  1. 標準研究所のボールミルを用いた微粉末に市販購入した蜂蜜蜂収集した花粉を粉砕します。
  2. 母性収集ホスト花粉規定 (~ 20%) の含水率に基づき、水和物の生地のような一貫性を形成するため徹底的に滅菌 40% 砂糖ソリューション79とミックスの適切なボリュームを使用して花粉粉末。
  3. 個々 の花粉の固まり、自然に割り当てられた男性規定の平均体重と同じ重さ約それぞれに分割します。
    注: 水分母性収集されたホスト花粉花粉規定 30 のランダムに選択された男性室80からの新鮮な乾燥重量を比較することによって前の規定を標準化できます。乾燥重量を得るためには、花粉の規定は、エアカーテンで凍結乾燥する必要があります (1.5 72 h の Pa)。

5. 汚損細胞培養皿を準備しなさい

  1. ライン オートクレーブ錫カップ (5 × 9 cm) 48 ウェル培養プレートの個々 の井戸。滅菌鉗子、カプセルの上部の縁を軽くフレアを使用して花粉規定を収容します。
  2. 治療群に基づく滅菌ツールを使用してブリキのカップ内単一ホストまたは非ホストの花粉規定量を配置します。
    注: 交差汚染を避けるためには、するには、処置および制御グループの個別の刷版を使用します。

6. 殺菌剤を追加します。

  1. 滅菌木製の棒を使用して花粉塊内の中央に配置されてうつ病を作る。各花粉の準備のための新しいスティックを使用します。
  2. うつ病 (治療) のための殺菌剤のソリューションまたは (コントロール) の滅菌水の適切なボリュームに追加します。ピンチ殺菌剤間の表面接触を最小限に抑えるため滅菌の鉗子を用いたうつ病のオープニング ・滅菌水と卵。
  3. 実験的なデザインの階乗のセットアップが配置されていることを確認、模式図 (図 4) に描かれています。

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図 4。実験装置の概略図。実験は、完全に交差 2 × 2 因子の設定を表します。因子 1 殺菌剤暴露を表し、2 つのレベルから成っている: (i) 殺菌剤 (N = 10)、および (ii) 殺菌剤 (N = 10)。要因 2 花粉源を表し、2 つのレベルから成っている: (i) ホストの花粉 (N = 8)、および (ii) 非宿主花粉 (N = 8)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

7. リアし、幼虫を観察

  1. きれいな細かいペイント ブラシを使用して花粉規定の上面にランダムに選ばれた男性の卵を配置します。一度卵は、すべての規定に置かれている、角のテープにラベル付けを確保する細胞培養プレートの蓋を取り付けます。
  2. きれいなトレイにウェルのプレートを置き、直接光との接触を妨害する暗い布でカバーします。場所 6 ウェル プレート含む 30 mL の滅菌水の乾燥を防ぐためにトレイ内の。室温で孵化盆インキュベーター中邪魔を残します。
  3. ウェル プレートの蓋を削除せず解剖顕微鏡の下で毎日の健康な版を観察します。動きをチェックして、幼虫が生きていることを確認します。動きが検出されない場合は、死んだ幼虫と残りの花粉規定を含む錫のカップを破棄します。前の段階に達するまでウェル プレート内で妨げられていない開発するすべての存続の幼虫を許可します。
  4. 41前段階に達すれば、ブリキのカップから幼虫を削除します。いずれかをきれいにするブラシの使用は、シルクの繭から排便します。慎重に解剖顕微鏡を用いた絹の繭を切って、ゴム鉗子でイラガ前蛹を抽出します。
  5. ツールが柔らかい体を刺さないでように優しくイラガ前蛹を処理します。イラガ前蛹 (前バイオマス) および前の段階 (幼虫の発生時間) に卵から発達の時間の新鮮重を記録します。
    注: 任意の死んだ幼虫は、死体と残った花粉規定上望ましくない微生物の増殖を防ぐために直ちに破棄する必要があります。これは、残りの健康な幼虫を感染症の危険を減らします。

結果

幼虫フィットネスの 3 つのメトリック (i) 幼虫の発生時間、(ii) 前のバイオマスと (iii) パーセント生存を使用して定量化を行った。殺菌剤の露出を使用して双方向の分散分析を行った (2 つのレベル: ない殺菌剤、殺菌剤)、花粉源 (2 つのレベル: ホストの花粉、非ホスト花粉) 独立変数と従属変数として幼虫の発生時間。殺菌剤の露出のための主な効果 (F1,28 <...

ディスカッション

その自然営巣葦、研究室の条件の下で外の蜂を飼育幼虫フィットネスに係る複数の仮説のテストが可能します。正体不明の要因は蜂の死亡率を引き起こすリスク評価に関する研究継続する生体外で実験助けることができる潜在的な脅威を特定し、野生花粉12 のこの種豊富なグループの経営慣行を通知 ,38,49,

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者に感謝キンボール クラークとティム クローツツハナバチネスト葦を提供するため、メレディス ・ ネスビットとモリー Bidwell ラボ、夫妻のカメロン Currie、クリステル Guédot テリー ・ グリスウォルド、マイケル ・ Branstetter の 3 つの匿名のレビューについて原稿を改善した、有用なコメント。この作品は、米国農務省農業研究サービス充当資金 (現在研究情報システム #3655-21220-001)、ウィスコンシン州農務省、貿易、および消費者保護 (#197199)、(の下で全米科学財団によって支えられました。グラント号DEB-1442148)、DOE グレイト レイクス バイオ エネルギー研究センター (科学 BER ・ デ ・ FC02-07ER64494 の DOE のオフィス)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.)Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reedsNativebees.comNAFreshly plugged reeds
Dissection setVWR89259-964Sterilize before use
Long Nose PliersHusky1006
6 well culture platesVWR10062-892Sterile sealed
48 well culture platesVWR10062-898Sterile sealed
Petri dishesVWR25373100Sterile sealed
Square Weighing BoatsVWR10770-448
Camel Hair BrushBioquip1153A
Tin capsulesEA ConsumablesD1021Sterilize before use
SucroseVWR470302-808
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3%
Honey bee pollenBee energised897098001244Untreated, natural, raw pollen
MicrobalanceVWR10204-990
PulverisetteLAB SYNERGY INC.30334913
Wooden sticksVWR470146908Sterilize before use
Sealing tapeVWR89097-912
MicroscopeVWR89403-384
Planting trayVWR470150-632
EthanolVWRBDH1158-4LP
Centrifuge tubeVWR21008936
MicrosyringeCole-PalmerUX-07940-07
Rubber tweezerAmazonB0135HWPN4
Syringe needlesVWR89219-334
Freeze drierLabconoLFZ-1L
Statistical softwareSPSSVersion 21.0

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