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要約

ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。

要約

多くの内分泌システム、継続的に放出されていない循環の要因やホルモンが放出因子の応答の離散パルスとして分泌されます。シングル ポイント サンプリング対策は通常生理学的な条件の下でまたは不全の条件時に拍動性ホルモンの分泌のパターンの生物学的意義を十分に理解して適切です。黄体形成ホルモン (LH) が下垂体前葉の gonadotrope 細胞によって合成・ パルスの評価のための血液サンプルを頻繁に回収を必要とする拍動パターンで分泌されます。これは、マウスで最近まで高感度 LH 測定法の開発は、可能なされていないとの技術の進歩は、低ボリュームのサンプル コレクション、最初ジムと同僚によって記述を頻繁に。1ここで LH の律動性分泌を検出する十分な処理環境に順応マウスから頻繁に末梢血サンプルのコレクションのためのプロトコルについて述べる。現在のプロトコルは、複数時間にわたって LH の堅牢で連続パルスの評価を可能にする拡張の馴化期間を詳しく説明します。このプロトコルでは尾の先端がクリップされて、手持ちピペットを使用して尻尾からは採血します。シリアルのサンプルは、ごきぶりマウスで拍動の LH の評価のため重要なは、90-180 分に 5-6 分毎に収集血のコレクションと LH の堅牢なパルスの測定は、十分な処理を与え目を覚まし、自由行動下のマウスで行うことが順化および環境ストレスを最小限にするため。十分な馴化は、採血前に 4-5 週間以内に達成できます。このプロトコルはマウス神経内分泌研究の強力な動物モデルの複数の時間にわたって拍動の LH 分泌パターンの評価の全血試料の収集を確保するための方法論の進歩を強調表示します。

概要

哺乳類の生殖腺機能、性腺刺激ホルモン分泌、黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体からによって異なります。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) の視床下部分泌への応答での拍動やサージ パターンで、性腺刺激ホルモンが分泌されます。合成と LH と FSH の分泌、視床下部 GnRH、生殖腺ステロイド ホルモン、アクチビン-インヒビン-フォリスタチン システムとの無数を含む分子の様々 な内分泌、パラクリンやオートクリン アクションによって規制されています。生理的ストレスとエネルギーのバランスを含みます。2

血液中の LH 拍動パターンはおよそ指数除去に続いて、末梢血に lh ではなく急激な放電から発生します。重要なパターンの各 LH 放電の頻度と LH 反応の振幅が備わって、どちらのによって決定されます、一部、視床下部下垂体門脈血の測定のための収集の難しさに GnRH。 期限のリリース拍動の GnRH、サンプリングと LH の測定は、視床下部-下垂体-性腺軸の GnRH 調節のプロキシとして使用されます。そのため、重要な情報は、周波数と振幅、LH のパルスは、1 つのサンプルからは判断できないのでエンコードされます。

LH の律動性分泌の解析とその大規模な血液量と頻繁に血液検体採取許容のための大型哺乳類 (ヒト、霊長類、羊) に限定されてきました。齧歯動物、頻繁に採血はラットに限られていたし、心房カテーテルを留置することでいます。3,4比較的低コストと遺伝の可用性 (例えばcre lox、CRISPR) し、複雑な神経回路 (例えばオプトジェネティクス、chemogenetics) 操作するマウス魅力的なモデル有機体;しかし、頻繁に血液サンプルの達成と LH 濃度の後続の分析まで最近、実証してとらえどころのないです。この記念碑的なタスクは、スタインと協力者によって開拓されました。1以来、いくつかのラボは、頻繁に採血と様々 な実験パラダイムの拍動性の LH 分泌を評価する超高感度の LH アッセイを利用し始めています。5,6,7,8,9に留意は道に沿って作った複数の改良と、少なくとも 40 年10に対して進行中のマウスから複数の血液サンプルを集めることの実用的な方法の追求がされていること。11,12

LH パルス パターン (すなわち周波数、振幅) の評価は、この遺伝的扱いの動物モデルの基底のゴナドトロピン分泌の監視の主要な改良を表します。従来、単一の血液サンプルにマウスで LH 濃度を測定しました。シングル ポイントのサンプルの 1 つの弱点は、LH 濃度は、当然のことながら各パルス中に変動非常に可変データ セット。もう一つの弱点は、孤立した測定は本質的に lh パルスのパターンによって伝えられる重要な情報を逃すことです。したがって、自由行動下で頻繁に血液サンプルを集めるための方法、気ままなマウス (サンプリング中に穏やかな処理) を除いて、拡張情報を提供し、有用性拍動性ホルモンの規則を調べる多くの研究所を。

ここでは、頻繁のコレクションのためのプロトコルについて述べる (6 分毎) 血液サンプル目を覚まし、気ままなマウスから。重要なは、我々 は、処理を含める全血試料中の拍動の LH 分泌の堅牢で連続検出は、事前および事後評価急性チャレンジにする時間の長さを決定することができますで収集できる順化プロトコルなど固定化と抑制の心理社会的ストレスに対する応答です。全血中 LH 濃度の効果的なアッセイが以前に記載されています。1この議定書は LH パルス測定のための血液サンプルを集めるための方法に焦点を当てた。

プロトコル

ここで説明したメソッドは国家機関の動物医療と使用ガイドラインに一致して、機関動物ケアとカリフォルニア大学サン ディエゴ校利用委員会によって承認されています。

1. 馴化処理

  1. 処理手順
    1. キャビネット、バイオ セーフティにおけるマウス ケージを配置します。ケージとバイオ セーフティ キャビネット内の適切な表面 (例えばきれいなケージ蓋) 上の場所から最初のマウスを削除します。
    2. そっと人差し指と 1 つの手の親指で尾のベースを保持することによって作業面の上にマウスを抑制します。その後、しっかりと人差し指ともう一方の手の親指で、尾の先端にベースから、尾の腹側表面をストロークします。6 回をなでるこの手順を繰り返します (すなわち1 セット) マウスをケージに戻ります。
    3. 6 分待ってし、1.1.2 の手順を繰り返します。
      注: 合計では、1.1.2 のステップごと繰り返されます 4 回マウス (6 ストロークのすなわち 4 セット)、それぞれのマウス処理の各日で 24 尾ストロークの合計を受信します。
  2. 毎日の処理の頻度
    1. 1.1、手順 (マウスは土曜日または日曜日順化の最終 2 週間までには処理されない) 週 5 日で 2 週間前に計画された血液収集日まで 5、マウスを処理します。
    2. サンプリング期間中に実験的治療に任意の追加処理 (例えばスクラッフィングまたは腹腔内投与) を含める場合は、各処理のセッション中にこの処理アクティビティにマウスを慣らします。
      注: 馴化の注入法、シャム注射を実行するのに鈍い針を使用します。
    3. 前述の 1.1 では、週 7 日間計画された血液収集日の前に 2 週間の間にマウスを処理します。
    4. 計画された血液収集日の前に少なくとも 2 週間のサンプリング中にマウスに混乱を最小限に抑えるためにペアでマウスを家します。

2. 採血管の準備

  1. ガラス瓶の中の超高感度 LH アッセイバッファーを準備: 0.2% ウシ血清アルブミンと 0.05% 【 0.2 g KCl、8 g, 塩化ナトリウム 1.44 g ナ2HPO4 (無水)、0.24 g KH2PO4純水 1 L、pH 7.4、フィルター、オートクレーブに PBS でトゥイーン 20、4 ° C で保存1
    注: 覚悟の超高感度 LH アッセイバッファー ボリュームことができますに基づいて計算されます数のサンプルとサンプル (2.2 & ディスカッション) 下記のとおりあたりにボリューム
  2. 毛細血管の血液コレクターズ (0.6 mL マイクロ遠心チューブ用) を準備します。チューブと割り切れるアッセイバッファー ラベル (57 μ L 管ごとにバッファーの注意してください、このボリュームは集められた血の量や必要なバッファーへの血液の比率に応じて異なる場合があります)。チューブは日サンプリング前準備、4 ° C で保存

3. 採血

  1. 血のコレクションの材料の準備。
    1. 用安全キャビネットを準備し、フードや近隣のカートの次の材料をアレンジ: 10 μ L ピペット (3 μ L または必要な採血量に設定)、ピペット チップ、無駄に使用されるピペット チップ、タイマー、動物数とサンプル数 (印刷の箱サンプリングまたは動物の問題についてメモ)、採血管、はさみ、小さなガーゼ (2"× 2") とバケツを氷します。
      研究室のタイマーにメモ:「カウント アップ」機能役マウスを乱すことができる可聴アラームはありませんので
    2. 永久的なマーカーを使用して、サンプリング中に正しいマウスの迅速な同定を支援する (麓) 各マウスの尾をマークします。
  2. 尾と前の血のコレクションの準備のクリッピング。
    1. 血のコレクションの開始前に 45 分で檻から最初のマウスを削除し、バイオ セーフティ内の適切な表面 (きれいなケージ蓋がうまく) にキャビネットを配置します。
    2. シャープ、滅菌はさみを使用して次の無菌調製、鼠の尻尾の先端の 1-2 mm を削除する (すなわち、アルコールや betadine とスクラブ)。
      注: これは、目を覚まし動物穏やかな拘束やイソフルラン麻酔下で実現できます。 さらに、ローカル IACUC の推奨事項に従う、鎮痛が提供されるかもしれない。
    3. 前述のようにマウスの尾を慎重にストローク (1.1.2; 1-2 ストロークが一般的に十分な) 尾先端の血液のフォームの液滴まで。
    4. きれいな先端のピペットを使用して尻尾先端から 3 μ L の血液を収集、血でピペット チップを破棄します。
    5. マウスをケージに戻す前に、血流が停止したことを確認します。必要な場合は、滅菌ガーゼで穏やかな圧力を適用します。
    6. 3.2.1 - すべてのマウスの 3.2.5 の手順を繰り返します。尾の先端に血液形態の水滴までしっかりとねずみのしっぽをなでるによって後続の血液サンプルを収集できます。
      注: しっかりしたストローク後血液滴を形成していない、尾が生理食塩水に浸したガーゼのパッドで濃くことができます。血栓が多いフォームにそれほど頻繁にサンプリング中 (すなわち > 15 分間隔)。血栓が静脈からクリアされると、サンプリングを続行できます。
    7. 各マウスはこの前採血準備期間中に約 45 分の 6 分毎に上記から 3 μ L の血液を収集し続けます。血とピペットの先端を破棄します。
  3. 採血
    1. 前述のように尻尾先端から 3 μ L の血液を収集します。(泡の寝具汚染有無) ピペット チップに全体 3 μ L サンプルが取得できるように注意してください。ラベル付き管内アッセイバッファーに血液サンプルを取り出します。逆解析による混合し、氷にチューブを返します。
    2. マウスをケージに戻す前に、血流が停止したことを確認します。必要な場合は、滅菌ガーゼで穏やかな圧力を適用します。
    3. 所定のサンプリング期間手順 3.3.1 - 6 分毎、各マウスの 3.3.2 を繰り返します。苦痛 (例えば部分的に閉じたまぶた、[その他の治療が原因でない] 背を丸めての位置または処理への応答の欠如) の印をそれぞれの動物を監視し、必要に応じてサンプリングを終了します。
      注: は行動の苦痛やサンプリングの終了を必要とする他の合併、当研究室でに非常に稀に発生します。
    4. 動物はない次の採血安楽死させて、尻尾先端から血流が完全に停止したことを確認します。それぞれの動物のケージ (または変更ケージ) の中からこぼれた血を拭く、ハウジング ラックに動物のケージを戻ります。

4. サンプルの処理と解析

  1. 分析まで、-20 ° C で血液サンプルを格納します。
    注: LH です; アッセイバッファーで希釈した全血サンプルで試金します。血清または血漿の分離はストレージや分析の前に必要ありません。
  2. 超高感度 elisa 法による血液検体は上記 ng/ml の全血アッセイ バッファーのサンプル ボリュームの希釈のための補正を次の1およびレポートの値です。
  3. データ セットの LH パルスを識別します。計算し、データ セットに応じて平均パルス振幅とパルス周波数 (またはパルス間間隔) を比較します。
    注意: プログラム基準13,14 15、16 LH パルスを検出するためご利用。

結果

4 マウスから代表的な LH パルス パターンは、図 1 (データ転載ヤンら2017) に表示されます。LH は、急性の心理社会的ストレス チャレンジへの応答を決定するため頻繁に血液サンプルで測定しました。大人女性 C57/Bl6 マウスが卵巣摘出、頻繁に血のコレクションのこのプロトコルの詳細として処理します。LH の律動性分泌の治療前のベース?...

ディスカッション

ここで全血尻尾先端サンプル マウスの拍動の LH 分泌の評価のための頻繁に血のコレクションのためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、心理社会的ストレスへの暴露に続く拍動の LH 分泌の急性変化の検出のためのサンプルの収集を有効し、LH パルスの他の急性または慢性の操作の評価に適しています。

このプロトコル LH パルスの信頼性と堅牢性のプロフ?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、夫妻ジェニファー ヤンとアレクサンダー (サーシャ) カウフマンの多くの有用な重要な議論と同様に、この手法でテクニカル サポートをありがとうございます。血清ホルモン アッセイは、再現リガンド アッセイ研究解析コア、ユーニス · ケネディ · シュライバー NICHD/NIH (NCTRI) グラント P50 HD28934 によってサポートされているヴァージニアの大学センターで 2017 ヤンら、によって行われました。

研究支援の源: R01 NICHD 86100 (巴)、RBM T32 NICHD 007203 によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosaftey cabinetLab Products IncL/F-B
Bovine serum albuminSigmaA5403
Tween-20SigmaP2287
KClSigmaP9333
NaClSigmaS7653
Na2HPO4 (anhydrous)SigmaS7907
KH2PO4SigmaP5655
Ultrapure waterMilliporePurified and filtered water
Broome Rodent Restraint DeviceHarvard Apparatus52-0460Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeakn/an/ahttp://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001

参考文献

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