空間的な学習とバーンズ迷路と乙女の苦痛のパラダイムを用いたマウスの向社会的行動の分析

要約

このプロトコルは、バーンズ迷路を使用して記憶・学習能を測定します。新たな乙女の苦痛パラダイムは、自発運動量とマウスにおける向社会的行動を評価するために使用されます。

要約

バーンズ迷路は、空間的な学習と食餌制限または非常にストレス刺激への暴露を必要としないメモリの信頼性の高い尺度です。バーンズ迷路迷路のプラットフォームと探索行動から脱出する一般的な動機などの他のマウス動作を評価することも。バーンズ迷路は、遺伝子の突然変異であるかどうかを測定できる環境変数が取得及び空間記憶の保持に影響を与えると同様またはマウスで採用されている検索方法に関する情報を提供します。ここでバーンズ迷路を使用して単一発達エタノールの露出イベント アダルト マウスのメモリの赤字を検出します。新しく記述された乙女の苦痛のパラダイムは、アリーナのオープン センター フィールドで商工会議所の中に閉じ込めて雌マウスに男性マウスを公開します。それは社会的に閉じ込められた女性への対応、向社会的行動を示すマウスのための機会を提供します。新規アリーナとメジャーの自発運動のマウスの動作を調べるため乙女の苦痛パラダイムを使用もできます。バーンズ迷路と乙女の苦痛のプロトコルの両方で必要最小限の金融投資と共通の実験用品からテストの大部分を構築できます。これらのツールの柔軟性とアクセスは、開発の過程での行動の変化を検出するも使用できます。

概要

このプロトコルの目的は、バーンズ迷路と同様の社会的応答と乙女の苦痛のパラダイムを使用して歩行を用いたマウスの記憶・学習能を測定することです。齧歯動物などマルチ スポークの装置の 1 つの腕で隠された食品を見つけるためにマウスの能力を測定する放射状迷路モリス水迷路は、大きな浴槽やプールの水、マウスの空間学習・記憶テストを用い、隠された水中プラットフォームを見つける時間を評価します。通常、これらのパラダイムのための訓練は複数の試験にまたがるし、両方の測定を可能集録速度や保存期間を短期的および長期的なメモリ試験を学習します。

放射状迷路とモリス水迷路は齧歯動物でメモリをテストするための信頼性の高い方法であるが、一部の研究者の合併症を呈する。両方の迷路は、補強¹として剥奪や強い嫌悪刺激を使用します。放射状迷路は、齧歯動物の食糧報酬を見つける、適切に動機づけを確実に絶食を使用します。モリス水迷路の中で強制水泳による応力の効果はマウス²で結果を変更できます。

バーンズ迷路は、明るく、開いている迷路表面³を脱出するために穴の位置を学ぶための齧歯動物を必要とする代替の空間認識タスクです。マウスがプラットフォームからの脱出の可能性を高めるに弱い嫌悪刺激 (光や音) が適用されます。バーンズ迷路は、絶食を必要としない ― 動物の準備の量はより放射状迷路。動作や食事、ホルモン調節、または視床下部経路に関連付けられている分子を調査する研究者によって、競合することがなく使用できます。

バーンズ迷路は、モリス水迷路上の利点もあります。モリス水迷路、マウス⁴コルチコステロンのより高いレベルを引き起こしているよりもストレスが少ないです。また、それを組み立てるためにはるかに簡単で、テスト プロシージャとストレージの間に以下の専用領域が必要です。

乙女の苦痛のアッセイは、向社会的行動が続く運動を評価することが簡単な 2 つの部分実験です。乙女の苦痛のアッセイは、探索行動と内包された女性齧歯類に応えて男性齧歯動物の社会的応答性を評価するために設計されています。社会性 (と同様社会の目新しさのための好み) を評価するために一般的に使用されるメソッドの近くや他のマウス⁵から離れて時間を過ごすマウスの自由な選択を評価するクローリーの 3 商工会議所社交性テストの使用であります。

クローリーの 3 商工会議所社交性テストと同様に、苦痛の乙女アッセイも別のマウスの存在下で時間を費やすことについて自由に選択を測定しますが、また社会的機能のより深い側面の測定を提供します: 1) で、乙女の苦痛の試金、オープン フィールドに男性の潜在的な嫌悪感が社会的探索または同種の苦しめられた女性を調査する彼のドライブに対してピットインされてので、閉じ込められた雌マウスはオープン フィールドの中心に開催されます。2) 苦痛の乙女のモデルは、マウスで頻繁に探索されていないトラップのマウスへの応答で共感および向社会的行動パターンを評価する方法を提供します。

動物の共感は間違いなく観測と測定可能なこの目的のためのない多くのパラダイムが存在します。たとえば、ラット、捕獲おりの仲間は、ラットが閉じ込められた動物を解放していく、向社会的行動のモチベーションの状態を引き起こすことができます。実際、ラットはチョコレート スナックを含む類似のコンテナーを開く前にも閉じ込められた動物を支援するを選択し、チョコレートにアクセスし、新たに解放されたラット⁶と共有します。

マウスにおける共感性の対策で通常は極度の痛みの実際、痛みの他のマウスを見てマウス、^7、8自体の痛みに敏感。拘束応力は齧歯動物に特徴づけられる現象で、ショック マウス^9,10に共感の一つとしてストレス反応を調べると結合されています。

ストレスを誘発する選択肢が必要なので、誘発される痛みやショックに関連付けられている倫理的な考慮事項があります。痛みやショック治療の不在で共感行動の尺度として苦痛の乙女パラダイムを開発しました。私達の苦痛の乙女のプロトコルに閉じ込められたマウスは、彼らは小さな容器内を好転させることができないまだ彼らはその苦痛に対応する他のマウスのための機会を提供しながら無傷だけいくつかの瞬間後苦痛の明白な徴候を表示します。

乙女の苦痛の評価を開始するには、雄マウスは小さな空中央のシリンダーを含む大規模な新規アリーナに配置されます。アリーナのどのように多くのセクションを交差しているし、中央のオープン エリアで費やされているどのくらいの時間を含むいくつかの分の探索行動が記録されます。このメソッドは、正常に完了の協調運動が必要な学習状況の潜在的な交絡因子として運動障害を除外するための迅速かつ簡単な方法を提供します。また、オープンのセンター フィールドにどのくらい嫌悪感が存在の基本的な指標を提供します。両方の措置はバーンズ迷路パフォーマンスに影響可能性があります。

初期の探査の後、男性がアリーナから削除され雌マウスは、囲まれた、小さい明確な中央のシリンダー (マウスから血を収集するために使用に似ています) に配置されます。元の雄マウスは、アリーナに再導入し、探索行動を再び獲得しました。乙女の苦痛パラダイム マウス (のセンター広場で、掘りエピソードの数時間で得点)、閉じ込められた女性が存在する場合、かどうか行動パターンの変更に基づく社会的相互作用に興味があるかどうかを評価する、マウスの展示 (シリンダー調査と閉じ込められた女性と接触イベントの量で得点) 閉じ込められた女性に向けて向社会的行動。乙女の苦痛の試金を使用して、研究者が馴染み深く、新しいマウスをトラップするかどうかに応じて (クローリーの 3 商工会議所社交性テストに類似) 社会の目新しさのための傾向を測定できます。

一緒に、バーンズ迷路と乙女の苦痛実験マウスの正確な評価学習能力と社会的な反応で許可非常にストレスの刺激の欠如。すべての行動実験と同様これらの実験は動物によって経験される不快感を最小限に抑え、動物の経験に向けて素晴らしい感度で行わなければなりません。

ほとんどの迷路のような自発運動の違いに影響を及ぼすバーンズ迷路のパフォーマンス研究者も評価してください運動、特に (よう運動を損なう可能性のある突然変異マウスの学習を評価するためにバーンズ迷路を使用する場合、ハンチントン病マウス モデルで見つけられるそれらまたはさらされる毒素は、多動性は、誘導やエタノールなどの動きを遅らせる可能性があります)。さらに、迷路と商工会議所の表面を徹底的に掃除する必要があり、香りキューを避けるためにそれぞれの動物の間変更された寝具を困惑させます。

重要なは、最小限の投資でのサイトにすべての材料を加工できます、ほぼすべての設定は、大きな柔軟性を可能にこれらの実験をレプリケートできることを意味するこれらのアッセイの物理的な設置面積が小さい。この種のアクセスは、パイロット データが実質的なサポートの欠如ですばやく収集する必要がある場合、限られた資源でより小さい機関で実行する良い科学をことができます。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ハンプデン ・ シドニー ・ カレッジのランドルフメーコン カレッジ (、いくつかの仕事が以前実行された) によって承認されました。

マウスの基本住宅

1. 固体底と側面、柔らかい寝具と紙のシュレッダーのような材料を入れ子のレイヤーとプラスチックのケージ内マウスを家します。細切りのトウモロコシの穂軸で構成される寝具または木の削りくずを使用し、寝具が衛生のため定期的に変更されることを確認します。
2. 食糧へのアクセスを提供し、水の自由。プラスチック製ケージの上部は住宅食品ホッパーです。食品ホッパーから正しく作り出されたマウスの餌のペレットを調剤し、水ディスペンサーを提供します。外部の汚染物質からマウスを保護するためにエアフィルターをケージ上部に機能を確認します。
3. 住宅施設で 12 時間の明暗周期に従うことによってマウスの自然なリズムを維持します。夜の時間帯などの動物の暗い周期の間に理想的には、一日の同じ時間で行動なテストを実施します。
   注: ハウジングにマウスを区別するために注意する必要があります。特徴的なマウスのさまざまな方法があります、耳パンチ、耳タグ、および尾のマーキングなど。

2. バーンズ迷路テスト: 建設

1. 直径 120 cm 円形木製ボードを取得します。
2. 20 の円形の穴 (直径 4.5 cm) の円の周囲をカットします。迷路の端から 2.5 cm、13 cm 隣接穴とは別に各穴を配置します。
3. 表面を滑らかにし、それらに光沢のある白い (明るい色を推奨) を描きます。
4. 小さなカップの挿入するため迷路ボードの指定の 1 つの側面は、それぞれの 20 穴と各ホール (各穴の両側に 1 つ) の場所の 2 つのフックから約 2-3 cm をフックします。
5. フックと迷路の側面の穴をカバーするため浅い黒 (プラスチック) ディスクを使用します。迷路の下にディスクを握るために太い輪ゴムを確保するためのフックを使用します。
6. バーンズ迷路、地上とはテーブルや椅子のような他の同様に背の高いオブジェクトから 120 cm を安全にマウントします。ボックスや便は、迷路の中をサポートする使用できます。
7. 迷路の 3 側面の余分な迷路的手掛かりとして (三角形、円、およびクロス) 各壁に 1 つの形をした大きな白いポスターを配置します。各試行の迷路の周りの壁にポスターを維持します。
8. 迷路の最後には、マウスの迷路上に表示されている研究者なしデータを正確に記録できるので、オブザーバーを非表示にする固体黒いカーテンを設定します。
9. 迷路全体表面の鳥瞰図とアリーナでビデオカメラを中断します。
10. 表面をきれいにすべて迷路 (黒ディスクとターゲット ボックスが含まれている) の水で、70% エタノール溶液各マウス試験の前後に。
11. 100 W 光源 25 cm を迷路 (トライアルのスタート/フィニッシュでオン/オフ回転) の中心に置き、ディスクと床に直面してフックを持っていることを確認します。
    注: ルームで他のすべての天井の照明がテスト中にオフしている必要があります。100 W の光の横に掛け超音波ノイズ メーカーの添加をお勧めします。それをオン/オフに各試験の開始/終了。

3. バーンズ迷路テスト: プロシージャ

注: は、テストを再開する前に完全に乾燥する時間を可能にする、各試験の前後には、水と 70% のエタノール溶液で迷路のすべてのコンポーネントを洗浄してください。クリーニング品の準備と試験のタイマーを持っていることを確認します。

1. 信頼性の高い同定法を使用している間グループのすべてのマウスを家します。迷路で積極的に実行されていないときは、マウス試験室の外してください。これ途中で超音波の鳴り物にさらされないことを確認することです。
2. マウスをそっと拾って手に足尾のベースからそれらを保持して処理します。
3. 訓練のためには、/の学習を評価するために行の 7 日間の 1 日あたりの毎日一度迷路の実行マウスを持っています。
   注: 後日メモリ/保持を評価するための一つの長期的な試験を行うことができます。現在のプロトコルは生後 32 から始まる思春期のマウスを訓練され、生後 4 ヶ月で大人の長期試験を行った。
4. テスト期間中に使用するターゲットの穴に各マウスをランダムに割り当てます。穴は 1-20 迷路の下にまたはどこ彼らは見えない迷路の中でマウス迷路境界の外側にラベルすることができます。
5. 小さいブラック ボックス (23 x 11 cm) で割り当てられた穴ディスクを置き換えます。しっかりと輪ゴム最寄りのフックに接続されているバーンズ迷路に取り付けます。
   注: ターゲット ボックスは浅い十分なので、マウスはそれに簡単にステップ ダウンすることができますまたはそれにジャンプするマウスがないことを確認する手順が含まれています。
6. テストを開始するまでの 30 秒間に適応するカップの下に迷路の中央にマウスを配置します。ビデオの録画を開始します。
7. 光と超音波の鳴り物を入れます。動物の最初の見出しをバイアスを避けるために文字列のメカニズムを介してカップを持ち上げます。Timer を起動し、観察するカーテンの後ろに座る。
8. マウスがターゲットの穴に入る後、裁判またはバインダーの開始で使用される同じ不透明なカップで穴をカバーし、超音波の鳴り物をオフにします。マウスがターゲットを入力していない 5 分が経過した後場合、は、ターゲットの穴にマウスを同種します。
   1. マウスが入る穴を確認します。マウスがターゲット ボックス内にあるとき穴をカバーし、鳴り物をオフにします。1 分間妨げられていないターゲット ボックスに残っているために、マウスを許可します。
9. ターゲットの穴は各マウスのトレーニング期間中一定であるがマウス ランダムな順序で毎日実行前のマウスで左の手がかり/香りを次がないことを確認します。

4. バーンズ迷路テスト: データ分析

1. バーンズ迷路学習試験中に記録次タイミング データ: 迷路に費やされた時間の合計し、ターゲットを見つける時間がターゲットを入力した場合は、ターゲットの穴を入力する時間です。
2. エラー (不適切な穴探検の数) の数を決定するのには、マウスの全体的な動きを追跡ターゲットがある前後に。またターゲットの穴から探検する最初の穴までの距離を記録 (距離は離れての穴の数で測定されます)、任意の顕著な行動をグルーミングと一緒に。
3. 各試行間に迷路の図を一枚の紙にそれぞれの動物の動きを追跡し、ターゲットの反対側の象限に探検された穴の数を決定すると同様、検索戦略を分析に使用します。ビデオ分析を使用して、パスを確認します。

5. 乙女-の-遭難テスト: 拘束室を構築します。

1. 明確なシリンダーを鼻の先端に尾のベースから雌マウスの長さの 3/4 と等しい長さにカットします。シリンダーの寸法がマウスの中に配置を好転させることができないものであることを確認します。
   注: 我々 は 1 カ月齢のマウスの 4 cm 長いチューブと 8 センチ 4 ヶ月齢マウスの管を作るために 50 mL のコニカル チューブの円錐端をカットします。
2. キャップの一つ、削除して再接続できるようにシリンダーの両端をキャップします。パンチ 3 4 穴、約 0.5 cm、各キャップ。穴が鼻触るマウスと呼吸¹²を許可するのに十分な大きさであることを確認します。
   注: また、採血中にマウス拘束のデバイス使用できます。

6. 乙女-の-遭難テスト: アリーナの準備

1. アリーナで 19 cm 壁付け 38 × 38 cm の不透明なトップレス プラスチック正方形ボックスことを確認します。均一に約 2.5 cm の高さにトウモロコシ寝具でそれを埋めます。
   注: トウモロコシの穂軸寝具簡単掘りイベントを検出します。
2. アリーナ全体がビューであるようにアリーナにビデオカメラを停止します。

7. 乙女-の-遭難テスト: 探索行動測定

1. アリーナ中央に閉じた状態と空のストレス チャンバーを配置します。
2. 中断されたカメラで記録を開始します。
3. 雄マウスを選択します。マウスは、識別のためにマークされている場合、は、この男性の身元に注意してください。ない場合は、ケージに戻った後区別することができますこのマウスをマークします。
4. アリーナの左下隅でカップの下に男性マウスをそっと置きます。30 秒後に、文字列のメカニズムを介してカップを削除します。
5. 10 分、録画中にその視野を出さないように注意しながら探索するマウスを許可します。10 分の終わりには、アリーナから、マウスを削除して次の 5 分¹²の持株ケージに戻る。
6. 録音を停止し、適切な識別子を持つビデオ ファイルを保存します。

8. 乙女-の-遭難テスト: 社会的な反応測定

1. 探索行動測定のように同じアリーナと録音の設定を使用します。
2. 雌マウスを選択します。マウスは、識別のためマークされて、この女性の身元を注意してください。ない場合は、ケージに戻った後それを識別できるように、このマウスをマークします。
   注: littermate、おりの仲間、または新しいマウス使用できます、研究の質問に応じて。複数の試験が行われている場合は、すべての試験でリレーションシップの種類を保持します。
3. 雌マウス優しく首拘束、尾のベースで必要に応じて、押しながら拘束室にそれを下げます。それの後ろに開口端を閉じ、好転することがあることを確認します。
   注: は、雌マウスは拘束チャンバーに入ることに耐性があるとして一口抵抗力がある手袋を着用を検討します。
4. 中断されたカメラで記録を開始します。
5. 共感アリーナの中央に内閉じ込められた雌マウスの拘束室を置き、10 分の順応する女性を許可します。女性の視野からままに注意してください。
6. 雌マウスが 5 分間拘束室にしたら前に、と同じプロセスを使用して共感アリーナにマークされた雄マウスを配置します。雄マウス マウスの視野からままに世話をもう一度、アリーナを探索するさらに 5 分を許可します。
7. 録音を停止し、適切な識別子を持つビデオ ファイルを保存します。
8. 5 分の終わりには、アリーナから両方のマウスを削除し、ケージに配置します。トウモロコシ寝具を交換し、アリーナと 70% エタノール¹²チャンバー内にストレスをサニタイズします。

9. 乙女-の-遭難テスト: データ分析

1. トラッキング ソフトウェアを使用することができます、しかし、ビデオは手動で分析もできます。ビデオ ファイルがコンピューター上に表示されると、画面上に透明シートをオーバーレイし、マーカーを使用してアリーナの広場を説明します。アリーナの正方形を 9 つの等しいコンパートメントに分割します。
2. 初期の探索的測定の最初の 5 分の動画データを確認します。番号を記録するコンパートメントの交差 (自発活動/探索行動)、アリーナ (オープン フィールド嫌悪) と掘りとグルーミングのエピソードの数、マウスに触れた空虚な中心拘束時間数の正方形の中心に費やされた時間商工会議所。
   注: は、男性の 10 分の初期探鉱、5 分で 2 番目の得点は行われませんも 10 分、女性は男性の不在で中央の部屋に閉じ込められています。
3. 男性はアリーナに閉じ込められた女性と再導入直後の社会的応答測定 5 分の映像データを確認します。初期の探索的メジャーとして同じデータを記録、さらに雄マウス トラップ雌マウスの鼻に触れた回数を記録します。

結果

バーンズ迷路

バーンズ迷路の使用方法を示すため、単一初期エタノール曝露がマウスの開発のコースを学習の違いを原因かどうかを検討しました。2.5 g/kg のエタノール溶液を注入したか C57Bl6/J マウス (n = 8) または生理食塩水 (n = 6) 2 回、2 時間おきに生後 6 日目で。我々 は思春期 (P30)、バーンズ迷路上...

ディスカッション

バーンズ迷路、乙女の苦痛実験マウスの向社会的行動、自発運動、空間学習を評価する方法が安価、迅速、かつ比較的簡単。他の利点には、あからさまなストレス、苦痛、または動物のための食事制限がない場合があります。ほとんどの学習/記憶パラダイムのようなバーンズ迷路の不利な点はターゲットの穴の位置を学ぶして動物に必要な試行回数です。

データの収集:...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Damsel-in-Distress
50 mL conical tube	Fisher Scientific	14-432-22	Any brand of 50 mL conical tube will work
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
hammer	Grainger	6R252	Any standard hammer will work
nail (size 8D)	Grainger	4NFE3	Similarly-sized nails should work just as well
opaque, topless plastic box	AcmePlastics	CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025	Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse.
video camera (smartphone)	N/A	N/A	Any camera-equipped smartphone will work
bite-resistant gloves	Kent Scientific	GLVDYN02	Any brand offering appropriate protection
transparency sheet	Staples	954145	Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring
Barnes Maze
Petri Dishes	Corning	353025	Spray painted and used as covers for Barnes maze holes
Plywood (3/4 in.)	LP Building Products	22487	To construct Barnes maze
Spray Paint	Krylon	1274937	Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood
Cup Hooks (5/8 in.)	Ace Hardware	5360615	2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat
Poster Board	Creatology	n/a	Used at edges of maze as extra cues
Light Bulbs	Phillips	n/a	100W light bulb, used to during the trials
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
Ultrasonic noisemaker	Victor mini PestChaser	M753SN	Used as aversive stimuli