高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

要約

HIV 1 融合を介して流れ cytometry または蛍光顕微鏡による検出可能な緑の蛍光蛋白質の表現を報告する細胞に基づく試金を記述します。無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用できます。

要約

この試金は流れの cytometry または蛍光顕微鏡による特に HIV 1 融合による緑色蛍光タンパク質 (GFP) 検出の式を報告する設計されています。HIV 1 記者ウイルス (HIV 1 ギャグ-本院)、Cre リコンビナーゼをマトリックスとギャグ エンベロープタンパク質のキャプシド蛋白質間の HIV-1 ゲノムに挿入することによって生成されます。ウイルス粒子に Cre リコンビナーゼ標的細胞にそれから解放されるこれのパッケージでこの結果の行、Cre リコンビナーゼ アクティブ赤色けい光たんぱく質 (RFP) GFP スイッチ カセットを安定に発現します。基底状態でこのカセットでは、RFP だけを表しています。次の標的細胞に Cre リコンビナーゼの配信、loxP サイトが並ぶ、RFP を切り取る、GFP の表現の結果します。この試金は無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用ことができ、HIV-1 ウイルス膜融合の阻害物質としてプリン受容体拮抗薬のクラスを識別するために使用されています。

概要

新規抗レトロ ウイルス療法の必要性 hiv-1 侵入阻害剤の高スループット スクリーンの開発を求めています。ギャグ本院レポーターの試金はホスト細胞膜¹ウイルス膜融合を具体的に測定することにより細胞に感染システムの融合の段階でウイルス エントリの阻害剤を識別するために開発されています。アッセイを開発したウイルス膜融合の時点までの HIV-1 感染症の初期の段階で具体的に行動した新規阻害剤のスクリーニング。感染細胞を測定する課題の 1 つですので、新しい感染の測定は入力セルから区別することは困難に、初期接種が感染ドナー細胞と ininfected ターゲット細胞に含まれています。理想的なシステムは、ドナー細胞の存在しないターゲット細胞感染症の開始によって誘導されうる異種の遺伝子マーカーを伴うでしょう。ウイルス蛋白質酵素融合、BlaM Vpr によるアッセイを混合人気バイラル コンテンツは、効果的、細胞スクリーニング²高スループットの制限があります。このアッセイには、β-ラクタマーゼ (バーン) レポーターの遺伝子で HIV 1 Vpr を融合、粒子にパッケージ化され、ウイルスの膜融合に標的細胞に配信が含まれます。基板 CCF2 AM は標的細胞の細胞質に読み込まれ、胸の谷間に蛍光シフトを受けます。CCF2 AM 基板は高価な法外な高スループット画面のためすることができます。ドナーとターゲットの細胞を区別するために色素ラベルする必要がある対象とする集団。最後に、プロトコルには、負担と高価なことができる多数の化合物をテストするとき、洗って、インキュベーションのいくつかの手順が必要です。

ギャグ本院アッセイは、高スループットの融合細胞間伝達の阻害剤のスクリーニングを開発する、これらの問題への解決策として開発されました。このシステムには、セルに読み込まれる基板は不要です。アッセイ無細胞研究も使えます、擬似型の HIV-1 ギャグ-本院ウイルス粒子を用いた他のウイルス融合研究に適応可能です。HIV Env を介した細胞融合アッセイは、しかし、これらは HIV 1 ギャグ-本院アッセイは^3,4、5実際ウイルス粒子を使用しないでくださいウイルス Env 蛋白質による細胞融合を測定できます。この試金は流れの cytometry または蛍光顕微鏡で読むことができます。それは、正常にプリン阻害剤^1,6の小さな図書館と同様に FDA ライブラリ画面に使用されています。他の研究者は、プリンを細胞質^7,8ウイルス カプセル化 β-ラクタマーゼの転送を報告する適応し、最適化された高スループットの融合アッセイを用いた HIV 1 融合阻害剤を識別したも.

ギャグ本院ウイルスは、行列と HIV 1 プロテアーゼ サイト⁹が並ぶキャプシドの Cre リコンビナーゼを挿入するギャグ iGFP ウイルスに似たようなアプローチで設計されました。Cre 酵素はウイルス粒子内の hiv-1 プロテアーゼは活性化が成熟するギャグのエンベロープタンパク質内に挿入される前駆体として行われます。したがって、Cre 配信は、ターゲット セルを介してウイルスの膜融合過程にプロテアーゼ活性化 HIV 1 粒子の内容の配信によって異なります。プロトコルの 2 つのバージョンは、ここで提供されます。最初は、HIV の直接の細胞間伝播を研究に標的細胞に感染するのに HIV-1 感染人口を使用します。2 番目のバージョンは、携帯無料のウイルスを研究するのに携帯無料のウイルスを使用します。細胞間伝達アッセイは、セルがフリーズ解除日から 7 日間または 5 日間場合セルはすでに解凍され、継代を取ります。無細胞感染試験は、細胞の解凍し、継代細胞を解凍する必要がある場合 5 日間、3 日間で実行できます。指示が Clevers ラボ¹⁰によって作成されたプラスミドを使用して目的のセル型 (既存 RG 対象のセルの行を使用していない) 場合で RG (赤・緑) ターゲット細胞ラインを生成するもあります。このアッセイでウイルス発現細胞とウイルス適切なバイオ セーフティの予防措置を取ることをお勧めします。このアッセイ BSL2 + 培養施設での感染部分を行っています。セルを修正した後は、標準的なフロー、フローサイトメトリーおよび顕微鏡施設で分析できます。

ここで説明画面への本法の適用する化合物の小説の HIV-1 ウイルス膜融合 (図 1) を阻害します。プリン受容体は、炎症性メディエーターです。当研究室は、プリン受容体非選択的阻害剤が HIV-1 ウイルス膜融合⁶の阻害剤として機能する実証されています。高スループットこのアッセイの使用率が新規 HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別できることを報告する.受容体のプリン クラスの阻害剤が HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤の新規クラスを表すことを示します。

プロトコル

1. ターゲット細胞の生成

注: この手順は省略可能です。既存の RG ターゲットのセルラインを使用している場合は、手順 2 で開始します。

1. 293 t 細胞¹¹ [ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を 10 mL]¹⁰ pCL 10A1 の pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE で¹² (包装プラスミド) の 70% コンフルエント 10 cm プレートを cotransfect、1:1 の比率 (合計 20 μ g) カルシウム ベースのトランスフェクション¹³を使用しています。
2. 15 mL の円錐管にプレートからメディアをピペッティングし、細胞の残骸をペレットに 23 ° C で 5 分間 3,000 x gでチューブを遠心分離ウイルスの培養上清中の 48 時間後トランスフェクションの 10 mL を収穫します。
3. 0.45 μ m フィルターを 10 mL の注射器に接続します。遠心分離の後全体の上澄みを取るし、注射器を読み込みます。きれいな 15 mL チューブにサンプルを実行します。
4. 適切なサイズにフィルターのウイルス上清の約数 (通常、0.5-1 ml)。これらがすぐに次の手順で使用するまたは-80 ° C で凍結して格納できます。
5. 96 ウェル プレートで好みのセルラインに感染するのにウイルス上清の 50-100 μ L を使用します。5% CO₂と 37 ° C で培養します。RFP 信号 (40 倍の倍率、532 nm 励起、588 nm 発光) 蛍光顕微鏡下で 24 h とすぐに表示されますが、最大 72 時間かかる場合があります。
   注: これらの実験 Jurkat 細胞が使用されたが、他の種類を同様に使用することがあります。
6. 10 井戸のシリーズを設定するピューロマイシンとよく少なくとも 1 を残し、各追加ピューロマイシン導入されたセルを選択します (5 μ g/mL に 0.5 μ G/ml の濃度の範囲を使用します。 セルの種類ごとに異なることがあります) コントロールとして放置。細胞生存率 (ピューロマイシン抵抗なくセルでセル換散が発生) の数日間のコース上と比較して監視無処理と使用ピューロマイシン RFP 発現細胞のみが生き残るための濃度。
   注: は、transfected セル存続間融合細胞が殺されている濃度を選択します。
7. 単一セル流れ cytometry 並べ替えまたは限界希釈を使用して (1.8-1.10 のステップを参照)、(成長に数週間かかる場合があります) 細胞ラインを開発する単一セル¹から派生した文化を育てます。
8. 希釈法を使用する場合、診断を使用してセルをカウントし、約 500 セル/mL にサンプルを希釈します。
9. 96 ウェル プレート [10 %fbs と 2% ペニシリン ストレプトマイシン、Jurkat 細胞を用いた場合とロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 中] メディアの 50 μ L にセル希釈の 50 μ L をピペットし、メディアの 50 μ L を含む 11 の井戸に 1:1 のシリアル希薄を実行します。最高の結果を得るのため、少なくとも 10 のレプリケートを実行します。
10. 組織文化のインキュベーター (5% CO₂と 37 ° C) で、約 4 週間のプレートの顕微鏡 (40 X) を介して細胞の成長を監視します。クローンのカルチャ (顕微鏡で見られる、40 X) として成長と最低ピューロマイシン濃度から文化を選択します。
11. 23 ° C で 5 分間 800 x gで文化 (500,000 細胞/ml、診断とカウント) の 20 mL を遠心、500 μ L の 10 %dmso と FBS の再採取を固定します。-80 ° c 細胞凍結コンテナーを使用し、液体窒素中で保存します。

2. 細胞ウイルス感染

1. 標的細胞の調製
   1. 37 ° C の水のお風呂に入れて Jurkat RG レポーター細胞の融解 1 つ 500 μ L バイアル。RPMI 完全培地 10 mL に、バイアルから細胞をピペットおよび 23 ° C で 5 分間 800 x gで混合物を遠心分離T-75 フラスコ RPMI 完全培地 20 mL にペレットを再懸濁します。フラスコは一晩 (37 ° C、5% CO₂) 孵化させなさい。
      注: RPMI 完全培地には、RPMI 1640、10 %fbs、2 mM L グルタミン、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg/mL が含まれています。
   2. 次の日は、ピューロマイシン (メディアの 8 mL あたり 2 mg/mL のストックの 1 μ L) の 0.5 μ g/mL を追加します。200,000-800,000 細胞/ml (カウントを介して検定) の密度を維持する、細胞を培養します。
   3. 転送アッセイを設定する前に日は、新鮮な RPMI 培ピューロマイシンの 0.5 μ G/ml で 200,000 – 400,000 セル/mL までセルを分割します。
2. ドナー細胞の調製
   1. Untransduced Jurkat 細胞および文化媒体 (前述の手順 2.1)、200,000-800,000 細胞/ml の密度を維持を完了 RPMI の 20 ml T-75 フラスコでそれらを解凍します。
   2. 7,500,000 細胞 (800 x gで 5 分) を遠心し、サプリメントと nucleofection ソリューション V 120 μ でそれらを再懸濁します (材料の表を参照してください)。エレクトロポレーション キュベットにセルを転送し、ギャグ本院¹ DNA の 4.5 μ g を追加します。セルを transfect (エレクトロポレーション ベースのアプローチを介して材料表を参照してください) (例えばS-18) 適切なプログラムを使用して、その後すぐに RPMI 培地 3 mL に転送 (10 %fbs)。
   3. 5% CO₂と 37 ° C でそれらを一晩インキュベートして回復する細胞を許可します。
   4. 次の朝、23 ° C で 5 分間 800 x gで細胞を遠心し、アッセイのセットアップに進む前に 37 ° c (5% CO₂) 回復する 2 h をできるように RPMI 完全培地 3 mL にそれらを再懸濁します。
3. 共培養
   1. (ドナー細胞ターゲット) の試金するにあたり 50,000 セル (800 x g 23 ° C で 5 分間) を検定し、スピンを使用してセルをカウントします。ピューロマイシンなしで完全に RPMI で 1 x 10⁶セル/mL を再します。
   2. 一皿で各井戸にドナー細胞懸濁液の 25 μ L を追加します。別の板で標的細胞の 25 μ L を追加します。
   3. 各ウェルに適切な濃度で RPMI 完全培地で希釈した試験化合物の 25 μ L を追加します。30 分間化合物とドナーとターゲットの細胞を孵化させなさい。
      注: 濃度は薬剤によって異なります。それに知られている IC₅₀がある場合は、これを出発点、上と下を滴定として使用します。IC₅₀が既知の場合は、10 μ M の最終的な集中の 200 μ M 在庫を準備します。
   4. 前処理後、他に 1 つのプレートの内容をピペッティングによるドナー細胞と標的細胞を組み合わせて、5% CO₂と 37 ° C で培養のインキュベーターで 40 h 細胞をインキュベートします。
4. フローサイトメトリー
   1. パラホルムアルデヒド (PFA) を最終濃度 2% の各ウェルに追加します。
      注: ストック溶液の 16%、これも 100 μ L あたり 14 μ L。
   2. 注意: PFA は露出した皮膚や目に有害であります。実験用の上着、手袋と安全メガネを着用し、安全フードの原液を処理します。
   3. MCherry と FITC チャンネル流れの cytometer で細胞を読みます。
      注: 感染細胞対の背景の上に GFP を発現する細胞の 5-20% を参照してくださいすることが可能です。感染していない細胞。
   4. 蛍光顕微鏡 (40 X) GFP 固有のチャネル上で GFP シグナルを可視化 (400 の励起フィルターと nm と 508 の排出フィルター nm)。

3. 携帯無料ウイルス感染症代替プロトコル

1. 標的細胞の調製
   1. 37 ° C の水のお風呂に置くことによって Jurkat RG レポーター細胞の融解 1 つ 500 μ L バイアル。RPMI 完全培地 10 mL に、バイアルから細胞をピペットし、RPMI 完全培地 23 ° C で 5 分間 800 × gで遠心分離T-75 フラスコ RPMI 完全培地 20 mL にペレットを再懸濁します。フラスコは一晩 (37 ° C、5% CO₂) 孵化させなさい。
   2. 次の日は、ピューロマイシン (メディアの 8 mL あたり 2 mg/mL のストックの 1 μ L) の 0.5 μ g/mL を追加します。200,000-800,000 細胞/ml (カウントを介して検定) の密度を維持する、細胞を培養します。
   3. 転送アッセイを設定する前に日は、新鮮な RPMI 培ピューロマイシンの 0.5 μ G/ml で 200,000 – 400,000 セル/mL までセルを分割します。
2. 携帯無料のウイルスの生産
   1. Transfect 293 t 細胞¹¹の 70% コンフルエント 10 cm プレート (DMEM の 10 mL の 10% に FBS) カルシウム ベースのトランスフェクション¹³を使用してギャグ本院¹プラスミドの 5 μ g で。
      注: このスケールは約 2 〜 4 の 96 ウェル プレート、トランスフェクションの効率によって十分であるウイルスの 10 mL になります。
   2. 15 mL の円錐管にプレートからメディアをピペッティングし、すべて細胞の残骸をペレットに 5 分間、3,000 x gでチューブを遠心分離によって 48 時間で全体のウイルス上清を収穫します。
   3. 0.45 μ m フィルターを 10 mL の注射器に接続します。遠心分離の後全体の上澄みを取るし、注射器を読み込みます。きれいな 15 mL チューブにサンプルを実行します。
   4. ウイルスを使用して、ターゲットの細胞をすぐに (ステップ 3.3) に感染または凍結し、-80 ° c (使用する前に必要に応じてサンプルの雪解け) ウイルスを保存します。
3. 感染症
   1. (ステップ 3.1.3) から RG Jurkat 標的細胞を数えるピューロマイシンなし中 5 分あたり 800 x gでも 50,000 の標的細胞を検定とスピンを使用して、完了 RPMI で 1 × 10⁶セル/ml に細胞を再します。
   2. 一皿で各井戸に RG Jurkat 細胞の 25 μ L を追加します。別皿で 25 μ L を追加 (2 ng) 各ウェルにウイルス。
   3. 各ウェルにメディアを適切な濃度に希釈テスト混合物の 25 μ L を追加します。セルと 30 分間化合物とは、ウイルスを孵化させなさい。
      注: 試験濃度は薬物によって異なります。それに知られている IC₅₀がある場合は、これを出発点、上と下を滴定として使用します。不明な場合は、最終濃度 10 μ M の 200 μ M 在庫中を準備します。
   4. 前処理後、井戸から標的細胞にウイルス/複合ミックスのコンテンツ全体 (50 μ L) を追加し、5% CO₂と 37 ° C で培養のインキュベーターで 40 h のためのすべてを孵化させなさい。
4. フローサイトメトリー
   1. PFA を最終濃度 2% の各ウェルに追加します。
      注: ストック溶液の 16%、これも 100 μ L あたり 14 μ L。
   2. MCherry と FITC チャンネル流れの cytometer で細胞を読みます。Gfp は、GFP チャンネルの蛍光顕微鏡による可視化も可能です。
      注: 一度感染細胞対の背景の上に GFP を発現する細胞の 5-20% を見ると期待できます。感染していない細胞。

結果

感染していない RG Jurkat 細胞は非常に強力な RFP の信号 (図 2 a、感染していない列) と背景 GFP 信号 (0.3%) の低レベルを展示します。ギャグ本院感染原因 1 HIV 融合阻害剤 AMD3100 の存在で GFP シグナル (24.9%) の増加 (20 μ M) は、この信号を感染していない背景レベル (0.34%) にまでもたらすの開発を阻害します。時逆転写阻害剤 AZT など後の融合イベン?...

ディスカッション

ギャグ本院アッセイはウイルス複製の融合段階を阻害することが薬剤の候補者をスクリーニングするため非常に有用であると証明しました。この分析を実行すると、良好な信号を取得する最も重要なステップは、ほとんどのウイルス感染の試金に似ています。最初の重要なステップは、品質の良いウイルスの高価を作り出しています。この手順は、293 t 細胞が必要です継代頻度 (少なくとも?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).