低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル

要約

ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網) を生成し、その後成長無料腫瘍細胞を効率的にトラップの方法を紹介します。

要約

好中球リリース好中球細胞外トラップ (網) を取り込んで微生物を破壊することができますをアクティブ化します。最近の研究では、ネットがさまざまな病気プロセス、自己免疫疾患、血栓症、腫瘍の転移などに関与していることを示唆しています。ここで、網に付着後成長無料腫瘍細胞の捕捉中にネット活動を検出する詳細な培養技術を紹介します。第 1 に、開腹症例から術後腹腔洗浄液から低密度好中球 (LDN) を集めました。LDN の短期養殖緑蛍光核と染色体の対比染色に視覚化された大規模なネット形成で起因しました。ひと胃癌細胞株ネットと NUGC 4、OCUM 1、MKN45 の共同培養後多くの腫瘍細胞は網によって閉じ込められました。その後、添付ファイルは、DNase I. 低速度撮影ビデオは網によって閉じ込められている腫瘍細胞が死んでいなかったこと明らかに取り付けた網の劣化によって完全に廃止されたが、代わりに連続培養における旺盛します。これらのメソッドは、ネットとセルと材料の様々 なタイプの接着剤の相互作用の検出に適用可能性があります。

概要

循環血液における多形核好中球は通常単核細胞から密度グラデーション製法によって区切られます。ただし、CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)、および CD14(-) の表現型を持つ低密度好中球 (LDN) として知られているいくつかの好中球、単核細胞と共同浄化されました。LDN の相対数は、大幅自己免疫疾患^1、2敗血症³がん^4,5など様々 な病態で増加します。以前の研究では、LDN が好中球⁶の表現型と機能別のクラスであることを示しています。循環血液で LDN は通常の密度好中球^2,7より好中球細胞外トラップ (網) を生成する可能性が高いことに注意してください。ネットは核酸、ヒストンやプロテアーゼ、粉粒体、ゾル性細胞質蛋白質から成る web のような構造であり、彼らは効率的にわなに掛けることができる病原体⁸を破壊して。

最近では、ネットをキャプチャだけでなく、微生物も血小板、血栓形成⁹および腫瘍転移^10,11に役立つ腫瘍細胞を循環する示されています。しかし、ネットと血小板または腫瘍細胞間接着剤の相互作用の背後にある分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近では、体外で接着アッセイは、骨髄性白血病細胞 (K562¹²) および肺癌細胞 (A549¹³) が β3 と β 1 インテグリンを介してネットに接続するを明らかにしました。著者には、好中球由来及びホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 接着基板¹⁴によって活性化ネット ストックが使用されます。かどうかの生産網と同じ分子構造を保持"由来の無細胞ネット証券「高速遠心分離によって分離されたこのアッセイは、好中球の不在で NET コンポーネントと現実の相互作用の検出を使用できますが、それは議論の余地vivo。最近、我々 は腹部手術に含まれる大規模な網を生成、腹膜転移¹⁵を引き起こす腫瘍細胞に接続されている多くの成熟した LDN 後その腹腔洗浄液を発見します。本研究では、物理的な操作をすることがなくそのままネットへの腫瘍細胞の接着を調べた正常に。ネットと無料の腫瘍細胞間接着の相互作用を検出する技術の詳細を紹介します。

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プロトコル

LDN は本研究で登録された患者から得られたし、制度的レビュー ボードの自治医科大学によって承認されました。

1. 腹腔内洗浄と純の検出から LDN の分離

1. サンプルの収集
   1. 消化管の悪性腫瘍による腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖する前に腹腔内に直接通常の滅菌生理食塩水 1000 mL を吹き込みます。
      注: サンプルは、年齢や性別に基づくバイアスのない胃切除術、結腸切除術、または食道切除術を受けた患者から得られました。生理食塩水は、コンテナーに転送され、注がれる腹部全体 1 分以内。これは日常的に患者に重大な影響なし術後腹腔洗浄として実行されます。
   2. 少なくとも 1 分間広く腹腔洗浄液。
      注: サンプルが均一なので、外科医の手でゆっくりと、注入液攪拌はそれをお勧めします。
   3. 4 50 mL 注射器洗浄液 200 mL を回復します。
      注: 時々 ゴム コネクタが流体を取るされます。
2. 顆粒球特定 mAb、CD66b¹⁶を使用して腹膜の LDN の浄化を実行します。
   注: 密度勾配遠心後の中間層には、多くの単核細胞が含まれています、CD66b モノクローナル抗体を用いた多形体好中球の正の選択を行った。
   1. 腹腔洗浄液を 50 mL のチューブに転送します。
      注: この手順では、不純物を除去する 100 μ m ナイロン フィルターを通して流体を渡します。
   2. 室温 7 分 270 x g で腹水を遠心分離します。
   3. 5 mL の 0.02 %edta で PBS でペレットを再懸濁します。
   4. 慎重に 3 mL 密度勾配ソリューションに細胞懸濁液 5 mL をオーバーレイします。
   5. 休憩なしの常温 15 分 1,700 × g で遠心分離機します。
   6. 2 〜 3 mL のピペットを使用して中間層 (図 1 a) を含む溶液を収穫し、10 ml の PBS の 0.02 %edta のミックスします。
   7. RT で 7 分の 400 x g で腹水を遠心し、上澄みを廃棄します。
   8. 破棄した上清で 7 分間 270 x g で 0.02 %edta と遠心分離機の PBS の別の 10 mL を追加します。
   9. 磁気細胞分離キット用のバッファーの 60 μ L 細胞ペレット (1 x 10 の⁷) を溶かしてください。
   10. ペレットに Fc ブロックの 20 μ L を加え、4 ° C で 10 分間インキュベート
   11. 反 CD66b の 20 μ L マイクロ ビーズと共役し、4 ° C でさらに 10 分間インキュベートを追加します。
   12. 洗浄し、再 MAC バッファーを 500 μ l 添加の餌を中断します。
   13. 磁気セパレーターの磁場中磁気列に細胞懸濁液を適用し、15 mL のバッファーとカラムを洗浄することにより、流れを含んでいる CD66b(-) 細胞を収集します。
   14. 磁選機から列を削除して、しっかりと列にプランジャーを押すことにより磁気標識 CD66b(+) 細胞をすぐに洗い流します。
       注: CD66b(+) セル人口を示す FACS 解析によって決定される好中球のほとんどで構成されています > CD66(+) 分画の 95% は CD11b、CD15、CD16 に肯定的な CD14 の負。
3. ネットの世代
   1. RT で 7 分間 270 × g で遠心分離後再分離の LDN を中断 (5 x 10⁶) 1 ml の 10% の FCS で RPMI1640。
   2. 6 ウェル ポリ-L-リジン コーティング プレート (直径 6 cm) 5% CO₂の 37 ° C で 2 時間の LDN を文化します。
   3. 5 μ M の最終的な集中に蛍光グリーンの対比染色 (核や染色体を染色する膜不透過性色素) を追加します。
   4. すぐにネット (蛍光顕微鏡下で LDN から追放するものと細胞外 DNA コンポーネント) の形態を観察します。

2. 赤い蛍光細胞リンカー染付腫瘍細胞の染色

1. ひと癌細胞株 MKN45、NUGC、および OCUM 1 を準備します。
2. 1 x 10 の⁷セル PBS + 15 の mL の管、室温 7 分 270 × g で遠心分離で 0.02 %edta を洗う
3. ペレット、染色色素の溶液 1 mL を追加し、そっとピペットします。
4. 赤蛍光細胞リンカー色素染色溶液 1 mL に 4 μ L を溶解し、2.2 の段階から細胞懸濁液と混ぜます。
5. 室温 4 分のペレットを孵化させなさい
6. DMEM の 4 つの mL を追加 (10 %fbs) 染色反応を停止します。
7. 7 分 270 × g を遠心し、上清を捨てます。
8. 2.6 および 2.7 の手順を 2 回繰り返します。
9. 蛍光顕微鏡で確認 (励起 = 551 nm、出力 = 567 nm) 腫瘍細胞が赤を染色します。

3. 癌細胞接着のネットの解析

1. 1 ml 0.1 %bsa 添加 RPMI 1640 の赤蛍光染色腫瘍細胞 (1 x 10⁶) を再停止します。
2. 手順 1.3 で説明したように網を作り出した LDN 文化に腫瘍細胞を追加します。
3. 回路網に接触する腫瘍細胞を可能にする、37 ° C で 5 分間インキュベートします。
   注: 長い潜伏癌細胞接着の LDN またはプレートを誘導します。
4. メディアを取り出して、皿を旋回を prewarmed メディア (0.1 %bsa + RPMI 1640) 2 mL を追加して優しく洗浄します。
5. 手順 3.4 では洗濯の手順を 2 回繰り返します。
   注: ネットから弱アタッチ プレート、網自体の除去を避けるためにできるだけ優しく洗浄を行う必要があります。
6. 核と染色体 5 μ G/ml 網の可視化のための最終的な集中での汚損のため緑の蛍光染料を追加します。
7. 網を観察し、適切なフィルターを使用して腫瘍細胞を添付 (緑、励起 = 504 nm、発光 = 523 nm; 赤、励起 = 551 nm、出力 = 567 nm)。
8. ネットで閉じ込められている腫瘍のセルを表示する数字をマージします。
   注意: いくつかの実験で DNA 分解酵素追加されました LDN 文化 (最終濃度 100 U/mL) に 5 分 5 分の共同培養前に、。

4 閉じ込められた腫瘍細胞の時間経過ビデオ解析

1. 35 mm で腹膜の LDN の文化はラウンド被覆ポリ L リジン手順 1.3 で説明した料理です。
2. 核と 1.3 の手順で説明されているようにネットを可視化する染色体の汚損のため緑の蛍光染料を追加します。
3. インキュベーションの 1 分後にメディアを取り出し、0.1 %bsa + RPMI 1640 2 mL を加えます。
4. メディアを取り出し、無染色 1 × 10⁶ MKN45 セル中断 0.1 %bsa + RPMI 1640 を追加します。右で 5 分間インキュベートします。
5. 手順 3.4 で優しく洗浄することにより任意の未接続の腫瘍細胞を除去し、100 u/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイ添加 10 %fcs を DMEM を追加します。
6. 全体ビューのセルの観測システムで培養皿をマウントし、腫瘍細胞が網によって閉じ込められている適切なフィールドを選択します。
7. 2 日間をさらに共培養し、フィールドの連続撮影通常の光と MKN45 細胞と網をそれぞれ検出する蛍光の下 6 分毎に進みます。
8. 各 timepoint でイメージを重ね合わせ、画像ビューアーのソフトウェアを使用して、時間経過のビデオを作成します。

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結果

2 時間の文化で腹膜灌流液の示した文字列の構造から派生した CD66b(+) LDN の緑色蛍光色素で染色核と染色体 (図 1 b) CD66b(-) 単核細胞がいない中 (図 1)。ただし、前処理は LDN 文化 100 U/mL DNase 私は、特徴的な構造は破壊 (図 1)、彼らが好中球から追放された細胞外 DNA で構成されていたことを示します。LDN ...

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ディスカッション

以前の研究は、^10、生体内で純基板¹¹循環腫瘍細胞をトラップできることを報告しています。転移性乳癌細胞は、好中球を刺激しターゲット器官¹⁷の腫瘍細胞の成長を支援するネットの形成を誘導する示されています。さらに、術後の洗浄液から LDN の短期的な文化が効率的にさらに刺激¹⁵せず腫瘍細胞をわ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro