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要約

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。

要約

真核生物遺伝子組換え分泌蛋白質構造および生化学的研究を表現する科学者のための挑戦だった。バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、いくつかの翻訳後修飾遺伝子組換えの真核生物の分泌蛋白質を表現するために使用するシステムの一つです。分泌タンパク質は、タンパク質の糖鎖修飾、ジスルフィド結合の形成および他のポスト翻訳の修正の分泌経路を介してルーティングされる必要があります。既存昆虫細胞分泌植物タンパク質発現を高めるためには、バキュロ ウイルス発現ベクターは GP67 のいずれかの追加またはプロモーターと多重クローニング サイトの間ヘモリン信号のペプチッド シーケンスによって変更されます。この新設計変更されたベクトル システムは、シロイヌナズナの可溶性組換え分泌植物受容体タンパク質の高収率に成功しました。X 線結晶学的研究 2 発現植物タンパク質、シロイヌナズナ TDR と PRK3 の細胞膜受容体の細胞外ドメインの結晶化しました。変更されたベクトル システムは動物の王国と同様に組換え分泌蛋白質の表現の可能性のある使用できる改良されたツールです。

概要

特に x 線結晶構造解析のための生化学的および生物物理学的特性の均質な組換えタンパク質の大量生産ができるように研究所が不可欠です。大腸菌酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞などそれらの間など定評の異種発現系が多い、バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、ほとんどの一つです。構造的に折り畳まれた大型真核生物に向けた組換えタンパク質タンパク質結晶化1の大量に生産するのに技術が使用されます。

バキュロ ウイルス発現系の表現のベクトルは、強い由来ポリヘドリン遺伝子または遺伝子組換え細胞内タンパク質2,3の高収率を生成する P10 プロモーターを含む設計されています。組換えバキュロ ウイルスをするためには、興味の遺伝子が違いによるとマルチ nucleopolyhedroviral ゲノム由来ポリヘドリン遺伝子 (polh) の軌跡を含む昆虫ベクトルに複製されます。結果としての構築は、シーケンシャルなその正しいオープンリーディング フレーム (ORF) が確認されます。正しいコンストラクト トランスフェクションのプロセスを介して宿主昆虫細胞に導入します。興味の遺伝子は相同組換えによってウイルスのゲノムに挿入されます。このイベントは、組換えウイルスのゲノムは、組み換え体を生成するが、複製が芽生えてウイルス粒子1の生産の結果します。

昆虫細胞発現系において最も一般的に使用される、Sf9 と高の 5 (Hi5) セルです。Sf9 細胞 Sf21、ハスモンヨトウの frugiperdaの蛹卵巣細胞由来のクローンの分離、Hi5 細胞クローン分離親Trichoplusia ni卵巣細胞ライン TN 3684,5から派生しました。Sf9 細胞の共同 transfections、ウイルスの増幅、およびプラクの試金を実施する Hi5 細胞が通常より高い組換えタンパク質6量を生成する選択されています。変異ウイルスを生成する傾向があるため、Hi5 細胞を世代ウイルス後代の増幅に適してない注目に値するです。従来は、25-30 ° C の温度範囲は、昆虫細胞の培養に適していると見なされます。ただし、27 ~ 28 ° C が昆虫の細胞の成長および感染症7,8の最適な温度であることが報告されています。

分泌されるタンパク質の高発現遺伝子の前強い信号系列の導入が必要です。効率的に信号シーケンスは翻訳された組換えタンパク質を小胞体タンパク質の分泌と適切な折り畳みと安定化3に必要な翻訳後修飾に導きます。信号ペプチド配列、バキュロ ウイルスを包む蛋白質 GP64/67、ミツバチ メリチンなどなどバキュロ ウイルスによる発現システム3分泌遺伝子組換え蛋白質の発現を促進するのに選択されています。GP67 のシグナルペプチドの導入は、ターゲット遺伝子9の内因性信号のペプチッドを使用と比較して、分泌の組換え蛋白質の表現の収量を改善するために示されています。ヘモリン細菌感染10時に誘起される巨大な絹蛾Hyalophora 丹野、皓三の体液蛋白質であります。誘導式の比較的高レベルによるバキュロ ウイルス昆虫細胞における組換えタンパク質の分泌発現を仲介する遺伝子の信号のペプチッド シーケンスを使用できます。

シロイヌナズナ管状要素分化抑制因子受容体 (TDR) と両方蛋白質11,12 の植物ロイシン豊富な繰り返し受容体様キナーゼ (LRR RLK) の家族に属している花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3).構造と植物受容体タンパク質も他の植物の分泌タンパク質の構造および生化学的解析が容易になるのこのファミリーの機能を研究するためにバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系に変更されています蛋白質の品質と生産の収量を向上させます。TDR と PRK3 の両方の細胞外ドメインは、バキュロ ウイルス昆虫細胞発現系の 2 つの変更された表現のベクトルを使用して正常に表現されています。TDR と PRK3 蛋白質の両方の細胞外ドメイン、結晶化されています。この記事は、GP67 またはプロモーターと複数クローン間ヘモリン信号シーケンスのいずれかを組み込むことによって式と 2 つの変更されたバキュロ ウイルス発現ベクターで遺伝子組換え分泌植物タンパク質の大量精製を報告します。サイト。

プロトコル

注: 分泌植物蛋白発現および結晶化のための変更された表現のベクトルとバキュロ昆虫細胞システムが使用されます。

1. 植物タンパク質分泌発現の GP67 シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更

  1. 5' BglII 切断サイト13GP67 の分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 a) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。
    注: BglII と病原が消化されるので同じ接着端で起因した DNA、焼なまし結紮順番 BglII と病原の両方のサイトは、劈開はシーケンスに変異が、一直線に並べられたベクトルが消化の DNA のフラグメントを縛ることができます。BglII または病原14。
  2. BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI14発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。
    1. 摘出した DNA のフラグメントそして DNA ゲル抽出キット15によって一直線に並べられたベクトル DNA を浄化します。
  3. 400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファー (50 mM 10 mM DTT、1 mM ATP、10 mM MgCl2トリス塩酸 pH 7.5 25 ° c) および T4 DNA の 5 単位 × 1 を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物にリガーゼ。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
  4. DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。5-10 コロニーをピックアップし、220 rpm、16 h のため振動のインキュベーターで 37 ° C で 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地 2 mL の各植民地の成長します。
  5. DNA の miniprep キット17各プラスミド DNA を抽出し、AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG のプライマーと DNA の配列によってクローンを確認します。
  6. PCR 増幅シロイヌナズナTDR 遺伝子フラグメントのエンコーディング残 30-642 合成 TDR 遺伝子から構築 (プライマーを転送: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC、逆プライマー: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC)。30 サイクル 0.5 mM dNTP ミックス、0.2 μ M プライマー、テンプレート DNA の 0.1 μ g、0.4 mM MgCl2、および DNA ポリメラーゼの反応 1式を含む DNA ポリメラーゼ反応バッファー内の DNA を増幅します。
    1. PCR のサイクルのステップの設定初期変性 95 ° C、30 s、および 30 の変性 95 ° c、30 サイクル s、30 s、や 72 ° c 1 分、72 ° C、5 分で最後の拡張と拡張機能のための 55 の ° C で熱処理します。
  7. PCR のフラグメントと制限の endonuclease 酵素ノッティと病原を変更されたベクトルを消化します。一直線に並べられたベクトルを持つ遺伝子のフラグメントを縛る。400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファーと T4 DNA リガーゼの 5 単位を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物に。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
  8. DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。DNA の配列によって正しいクローンを確認します。

2. 植物タンパク質分泌発現の昆虫ヘモリン シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更

  1. 5' BglII 切断サイト13、昆虫ヘモリン分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 b) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。
  2. BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI14発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。
    1. 摘出した DNA のフラグメントそして DNA ゲル抽出キット15によって一直線に並べられたベクトル DNA を浄化します。
  3. 400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファー (50 mM 10 mM DTT、1 mM ATP、10 mM MgCl2トリス塩酸 pH 7.5 25 ° c) および T4 DNA の 5 単位 × 1 を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物にリガーゼ。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
  4. 結紮の混合物の 5 μ L を DH5α 有能なセルの 100 μ L に変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート上のコロニーを選択します。5-10 コロニーをピックアップし、2 mL LB 培 220 rpm、16 h のため振動のインキュベーターで 37 ° C でアンピシリンの 100 μ g/mL の各植民地の成長します。
  5. DNA の miniprep キット17プラスミド DNA を抽出し、AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG のプライマーと DNA の配列によってクローンを確認します。
  6. 合成 PRK3 遺伝子構造から残 20-237 をエンコーディング花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3) PCR 増幅シロイヌナズナ遺伝子フラグメント (プライマーを転送: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC、逆プライマー: シージーシー GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTGTGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)。30 サイクル 0.5 mM dNTP ミックス、0.2 μ M プライマー、テンプレート DNA の 0.1 μ g、0.4 mM MgCl2、および DNA ポリメラーゼの反応 1式を含む DNA ポリメラーゼ反応バッファー内の DNA を増幅します。
    1. PCR のサイクルのステップの設定初期変性 95 ° C、30 s、および 30 の変性 95 ° c、30 サイクル s、30 s、および 30 のための 72 ° C で拡張子 55 ° C で熱処理各サイクルと 72 ° C、5 分で最後の拡張内にある s。
  7. PCR のフラグメントと制限の endonuclease 酵素ノッティと病原を変更されたベクトルを消化します。一直線に並べられたベクトルを持つ遺伝子のフラグメントを縛る。400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファーと T4 DNA リガーゼの 5 単位を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物に。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
  8. DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。DNA の配列によって正しいクローンを確認します。

3. 生産とバキュロ ウイルスの増幅を構築組換え蛋白質発現カセットをかくまっています。

  1. バキュロ ウイルス発現システム1のプロトコルに従う DH10Bac 有能なセルの 40 μ L を変換する構成体プラスミドの使用 100 ng。48 h の 37 ° C で変換プレートを孵化させなさい。
  2. 各変換プレートから 2 つの白いコロニーをピックアップし、各植民地を 50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 μ G/ml テトラサイクリンを含む LB 培地 2 mL に接種します。抽出し、DNA バクミドを確認するバキュロ ウイルス式システム1のプロトコルに従ってください。分注、それぞれ 20 μ L と 2 つの管で各 DNA、-20 ° C でチューブを格納
    注: 次の手順では、無菌操作を必要があります。
  3. 6 ウェル プレートで 80% 合流に 27 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質 Sf9 細胞の単分子膜を成長します。組織培養プレートのカバーされている領域の割合に基づく合流点の割合を推定します。
  4. 2 滅菌 1.5 mL 遠心チューブに以下のソリューションを準備します。
    1. チューブ 1: 各 transfection のため抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 100 μ L に DNA バクミドの 20 μ L を希釈します。管の側をフリックで希釈を優しく混ぜます。
    2. チューブ 2: 各 transfection のため、抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 100 μ L に脂質のトランスフェクション試薬の 8 μ L を希釈します。6 x の上下にピペッティングによる希釈を徹底的にミックスします。
  5. 2 つのソリューションを組み合わせて、3 x、上下にゆっくりとピペッティングで優しくそれらをミックスし、室温で 20 分間インキュベートするそれら。
  6. Sf9 単層の細胞 2 倍の抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 3 mL で洗う。各 transfection のため脂質 DNA の混合物を含む各チューブに培 Sf9 細胞培養液抗生物質なしの 0.8 mL を追加します。軽く 3 倍のアップとダウンゆっくりとピペッティングによるチューブの内容をミックスします。プレートから洗浄メディアを吸引し、トランスフェクション混合物サンプルを重ねてください。
  7. トランスフェクション混合物の付加の後で 27 ° C で 5 h 用 transfected プレートを孵化させなさい。トランスフェクション メディアを交換して 10 %fbs と 100 μ g/mL (またはリンパ) を含む、完全な Sf9 細胞培養培地に抗生物質ペニシリン-ストレプトマイシン。4 d のための 27 ° c transfected プレートを孵化させなさい。
  8. 収穫し、組換えバキュロ ウイルスを増幅します。
    1. インキュベーションの 4 d の後滅菌 15 mL の円錐管に感染したプレート上澄みを収集します。1010 x g細胞の残骸を削除する 5 分で上清をスピンします。ペレットを破棄し、クリーン チューブに上清をデカント 4 ° C で 1 年間保存します。
      注: これは P0 ウイルスです。それは時間の長い期間のため避けようと-80 ° C で保存されますをすることができます。
    2. 各遺伝子組換えウイルスを増幅するには、150 mm 板上 Sf9 細胞の単分子膜を 80% 合流に成長します。プレートからメディアを吸引 P0 ウイルスの 2 mL をプレートに付着性のセルに追加して、27 ° C の定温器で 1 時間版を孵化させなさい。細胞と培地を混合するプレート 15 分毎をロックします。
      1. 25 ml 10 %fbs と 100 μ g/mL (またはリンパ) を含む完全な恵みのメディアのペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質。P1 通路ウイルスを入手して 27 ° C の定温器で 3 d 版を孵化させなさい。
    3. 滅菌 50 mL の円錐管と 1010 x g細胞の残骸を削除する 5 分でスピンで感染したプレート上澄みを収集します。クリーン チューブに上清をデカント、4 ° C で 1 年間保存できます。
      注: P1 ウイルスは、時間の長い期間のため、避けようと-80 ° C で保存されますを使用できます。
    4. P1 から P2 通路にウイルスを増幅するには、90% 合流する 150 mm 板上 Sf9 細胞の単分子膜を成長、プレートのメディアを吸引、プレート、P1 ウイルスの 2 mL を追加、27 ° C の定温器で 1 時間インキュベートします。
    5. 3.8.2 と 3.8.3 ウイルスの P2 と P3 の通路を取得する手順を繰り返します。2 ヶ月以上 P3 ウイルスを格納しないでください。

4. 蛋白質の表現、NiNTA、および結晶化で精製

  1. 1 L 27 ° C インキュベーター シェーカーで 100 rpm で 2 × 106の密度を 100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質の Hi5 昆虫細胞の文化します。570 x gで 5 分で細胞をスピン、上清をデカント、20 ml たて作り出された P3 ウイルスの細胞を再懸濁します、1 h. そっと振って 15 分毎 × 1 細胞を再懸濁しますスピン ボトルの部屋の温度でそれを維持します。
  2. 100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質の 1 L にセルを転送、1,010 × gで 5 分で細胞を 72 h スピンの 27 ° C インキュベーター シェーカーで 100 rpm で細胞の培養上清を収集します。
  3. 使用 pH インジケーター ストリップ 0.1 M HCl または 0.1 M NaOH を追加して 8.0 上澄みの pH を調整し、最終的な濃度、ph 8.0、100 mM の NaCl、Tris バッファーは 20 mM と 5 mM のイミダゾールを含む結合バッファーを追加します。表現彼タグ組換えタンパク質の推定収量に基づく NiNTA 樹脂 (10-40 mL)、一定の量を追加します。
    1. 樹脂 1 h. 洗浄のための 4 ° C で低速で電磁攪拌のソリューションをミックスし、次の標準的な NiNTA の浄化のプロトコル18バインドされた蛋白質を溶離する。
  4. イオン交換精製タンパク質とゲル濾過クロマトグラフィーとして同質なサンプルを生成するための他の蛋白質の浄化方法。
    注: TDR 外部ドメイン、20 mM トリス、pH 8、100 mM の NaCl はゲルろ過バッファーとして使用されました。PRK3 外部ドメイン、20 mM ビス-トリス、pH 6、100 mM の NaCl は最寄りのゲルろ過バッファーとして使用されました。

結果

図 1に示すように、GP67 またはヘモリン信号シーケンスのいずれかの標的遺伝子の組み込み信号シーケンスに置き換えると分泌された蛋白質を表現する 2 つの変更された pFastBac1 バキュロ ウイルス発現ベクターが使用されました。ウイルス GP67 と昆虫ヘモリン遺伝子は、細胞の高い分泌発現レベルに実証されています。これらの 2 つの信号シーケ...

ディスカッション

サイズおよび生物学的システムで現在の蛋白質の何千もの安定性の多様性を考えると、それは実証研究のためはしばしば特定の蛋白質の表現のために選択される異種発現システムを決定する室します。大腸菌発現系は多くの場合19をスケール アップする細菌は、低コストの文化、メディアおよび相対的な容易さの短いライフ サイクルのための蛋白質の表現のための最...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、Guozhou の徐のノースカロライナ州立大学から新しい学部スタートアップ資金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Incubator shakerVWRModel Excella E2527 oC
IncubatorVWRModel 200527 oC
CentrifugeBECKMANModel J-6with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA PolymeraseAgilent600677-51For PCR amplification of DNA
Thermal CyclerBIO-RADModel C1000 TouchFor PCR amplification of DNA
Incubator shakerNew Brunswick ScientificModel I 24For growing baceria culture
Customer DNA synthesisGENSCRIPT
BamHI (HF)New England BiolabsR3136SRestriction Endonuclease
BglIINew England BiolabsR0144SRestriction Endonuclease
NotI (HF)New England BiolabsR3189SRestriction Endonuclease
XhoINew England BiolabsR0146SRestriction Endonuclease
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202TDNA ligation
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104Plasmid DNA purification from bacteria culture
AgaroseThermo Fisher Scientific15510-019For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cellInvitrogen18-258-012For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB BrothResearch Product International Corp.L24066-5000.0For making bacteria culture
Ampicillin sodium saltThermo Fisher Scientific11593-019Antibiotics
Kanamycin SulfateThermo Fisher Scientific15160-054Antibiotics
TetracyclineThermo Fisher Scientific64-75-5Antibiotics
GentamicinThermo Fisher Scientific15710-064Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cellsThermo Fisher Scientific10361-012For making bacmid DNA
S.O.C. MediumThermo Fisher Scientific15544-034For DNA transformation
CellFECTIN II ReagentThermo Fisher Scientific10362-101Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression SystemThermo Fisher Scientific10359-016Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-galThermo Fisher Scientific15519-028For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTGThermo Fisher Scientific15529-019For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1Thermo Fisher Scientific10360014Baculorirus expression vector
Sf9 cellsThermo Fisher Scientific11496015Sf9 monolayer cells
Hi5 cellsThermo Fisher ScientificB85502High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplementedThermo Fisher Scientific11595030Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplementedThermo Fisher Scientific11605102Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFMThermo Fisher Scientific10902104Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFMThermo Fisher Scientific10486025Hi5 cell culture medium
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081100 ml
FBS CertifiedThermo Fisher Scientific16000-044500 ml
6-well platesThermo Fisher Scientific08-772-1BFlat-bottom
150 mm platesThermo Fisher Scientific353025100/case
1.5 ml Microcentrifuge TubesUSA Scientific1415-2500500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubesUSA Scientific1475-051125 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubesUSA Scientific1500-121125 tubes/bag
Ni-NTA SuperflowQiagen30430NiNTA resin
pH-indicator stripsEMD Millipore Corporation1.09535.0001pH 0 - 14

参考文献

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