アポ E 欠損マウスにおける鉱質コルチコイド受容体の活性化を介して動脈硬化性プラークの誘導

要約

アルドステロンの連続リリースで、動脈硬化の食事と飼育アポ^-/-マウスの大動脈における動脈硬化を誘発するプロトコルについて述べる。プラークの組成の同定手法について述べる。

要約

動脈硬化は、血管内皮細胞に影響を与える慢性的な炎症反応によるもので、高血圧、高脂血症、糖尿病などいくつかの要因によって促進されます。日には、心血管疾患の開発のための危険因子としてのアルドステロンを循環させるための役割を支持する証拠があります。トランスジェニック マウス モデルは、動脈硬化につながる細胞および分子プロセスの研究に生成されています。本稿では、アポ^-/-マウスでアルドステロンの連続的な注入の利点を受け取り、治療の 4 週間後大動脈で動脈硬化性プラークを生成するプロトコルについて述べる。我々 は、したがって、定量化及び大動脈レベルでアテローム性動脈硬化病変の評価のための方法を示しています。アルドステロン注入の付加価値は、脂質や炎症性細胞の豊富な動脈硬化病変の治療の 4 週間後の世代で表されます。我々 は詳細にプラークの中で脂質とマクロファージの含量を定量化する染色の手順を説明します。特に、このプロトコルでは、心臓組織の抗原性を保持し、興味の抗原の検出を容易にするために 10 月に組織埋め込む心を実行します。プラーク表現型の分析は、動脈硬化の進展の病態を検討し、抗動脈硬化薬の開発のための新しい薬理学的ターゲットを識別するために有効なアプローチを表します。

概要

動脈硬化症は、死亡率と罹患率世界¹の主要な原因の一つです。それは、血管が脂質と動脈硬化性プラークの形成を決定する白血球で潜入している慢性炎症状態が特徴です。急性の心臓イベントの大半は、プラークの破裂による血栓性イベントに関連付けられます。破裂しやすいプラークは、「傷つきやすい」定義され、プロ炎症性白血球、壊死性コアと薄い線維性被膜²の高められた浸透によって特徴付けられます。最後の十年では、臨床的および実験的研究は、病気の複雑な病態を明らかにしました。いくつかの動物モデルは、アテローム性動脈硬化³の誘導に関与する分子メカニズム解明のために使用されます。現在、マウスは人間と比較してその病態における既存のいくつかの種特異的な違いにもかかわらずアテローム性動脈硬化を勉強する最も頻繁に使用される種であります。特に、コレステロールを循環主にで構成される高密度リポタンパク質 (antiatherogenic プロパティ) を持つマウス モデルで人間を主に低密度リポタンパク質 (LDL) として運ばれるコレステロールを循環しながらおそらくなぜ、野生型マウスの自発性動脈硬化⁴を開発しない主な理由を表します。さらに、野生型マウスが約食餌療法のコレステロール⁴の 50% を吸収する人間に対し一般的に食事からのコレステロールの吸収に耐性。これらの制限を克服するためにいくつかの遺伝子組み換えマウス モデルが生成されています。アポ E-欠損マウス (アポ^−/−) と LDL 受容体-欠損マウス (来す^−/−) が活躍しています。高脂肪高コレステロール食、アポ e^−/−マウス開発プラークより多くを来す^−/−マウスに比べて急速にアポ^−/−マウスの使用は、この理由のため、来す^−/−マウス^5,6のそれよりもより広範です。アポ^−/−マウスは、アテローム性動脈硬化のあらゆる段階で病変を開発し、マウスのプラクは不安定な表現型⁷を表示しないが、人間で観察に匹敵します。一般的に、アポ e^−/−マウスは自発的にアテローム性動脈硬化を開発し、このプロセスは西部の食事療法³加速します。頚動脈、肺、大腿や腕頭動脈、大動脈のルート⁶のレベルでは、アテローム性動脈硬化の重症度を評価できます。特に、大動脈の根は、マウスにおける動脈硬化病変を開発する傾向が解剖学的サイトを表します。このため、この地域の動脈硬化性プラークの形成を評価する方法が一般的です。

いくつかの研究は、アルドステロン、アテローム性動脈硬化^8,9,10の開発に関与しているを示しています。アポ^−/−マウス動脈硬化飼料におけるアルドステロン輸液は、炎症や脂質に富むプラーク形成¹⁰を誘導する大動脈の動脈硬化病変の開発を加速します。

要約すると、アルドステロン注入、動脈硬化食事供給、アポ^-/-マウスの動脈硬化病変の評価・定量化心臓組織の埋め込みを含むプロトコルについて述べる。この手順では、炎症を起こして、脂質の豊富な動脈硬化性プラークの効率的な形成を促進して、粥状動脈硬化の研究の貴重なモデルを表します。

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プロトコル

研究は、イタリア国民協会の健康ケアおよび使用委員会承認番号 493/2016-広報によって承認されました。実験動物の使用のための欧州共同体のガイドラインに従ってすべてのプロシージャを行った (欧州指令 2010/63/UE)。

注: 車両 (食塩エタノール) やアルドステロンを含む浸透圧側脳室内の皮下注入 (240 μ g kg^-1 ・・・ d^-1) 8-10 週間で-古い男性マウスApoE遺伝子の欠損。一般的に、8-10 週で-古い男性アポ^−/−マウス約 25 〜 26 グラムの重量を量る。

1. アルドステロンの溶解

1. 無水エタノール 1 mL にアルドステロン パウダーの 5 mg を溶解します。
2. 2.27 μ g の濃度を得るために食塩水の 68.3 μ L に (エタノールに溶解) アルドステロンの 56.7 μ L を追加/μ L (各側脳室内の最大容量が 125 μ L) このソリューションの 125 μ L で完全に全体の浸透圧ミニポンプを記入します。
3. 0.11 μ L/h; の側脳室内の流量を使用します。したがってソリューションの 2.64 μ L をリリースごとの 24 時間を与える各マウス約 6 μ g ·28 日のアルドステロンの d^-1 。

2. 浸透圧ポンプ充填・注入

注: ポンプは 2 つの別々 のパーツ供給: ポンプや流量制御の本体。

1. 記入し、手術用手袋を使用してミニポンプを処理します。
   注: 皮脂ミニポンプのパフォーマンスを妨げる可能性があります。滅菌の層流フードでは、次の手順を実行する必要があります。
2. 1 mL シリンジに充填チューブ (、ミニポンプに付属) を添付し、アルドステロン ソリューションまたは車両を描画します。
   注: ポンプに気泡の形成を防ぐために管からソリューションを吸引しながら、注射器の中の空気を悟られないようにすることが重要です。
3. それはさらに行くことができるまで、側脳室内の上部に穴を充填チューブを挿入 (図 1 a-1 b)。ゆっくりとアルドステロンや車両でポンプを入力します。流体のレベルを示すポンプ内部の暗い影に注意してください。充填ポンプと共にこのレベルの上昇を見る。
   1. 流体のビードが上がるとポンプ本体からポンプを充填を停止します。
4. 慎重に充填チューブ、流量制御を (図 1) 側脳室内の本体に挿入します。ポンプ本体とレギュレータがしっかりと装着されていることを確認します。マウス (プライミングの手順) で移植前に 24 h までの 37 ° C で滅菌生理食塩を含むビーカーで塗りつぶされた浸透圧ポンプを残します。
5. 無菌を促進する 70% エタノールで消毒エリアでの手術を行ってください。
6. 0.25% ブピバカインの切開部位を 1-3 滴を適用し、3% イソフルランと動物を麻酔します。供給ガスを入れますと誘導室動物 500-1000 mL/分の場所に流量計を設定し、上部をシールします。5% イソフルラン気化器をオンにし、リカンベントまでマウスを監視します。
   1. ノーズに流れるシステムを切り替えます。商工会議所とノーズの位置から動物を削除します。2-3 分でマウスは目を覚ますを開始します。100-200 mL/分の流量計とで 3% イソフルラン気化器でガスの流れを再起動します。
   2. ペダルの撤退と眼瞼反射神経をテストすることによって手順を実行する前に麻酔の十分な深さを確保します。呼吸およびプロシージャ中の刺激への応答を監視し、必要に応じて気化器を調整します。
   3. 眼軟膏を適用することによって完全に乾くことから、角膜を保護します。
7. かみそり (図 1) を使用して手術部位から髪を削除することによって動物を準備します。通常皮下注入ポンプの用地は背面にあります。
8. 不織布パッド材 70% イソプロピル アルコールで飽和状態で手術部位を準備します。
9. (70% エタノールで消毒) 清潔で専用スペースを使用し、滅菌ドレープで覆われています。ガラス ビーズ滅菌器で器具の先端を配置します。滅菌機器で手術を開始し、無菌の楽器を処理します。
10. 外科はさみを使用して 0.8 1 cm 切開 (尾の近くに約 2 cm) のように、 1E 1F の数字します。滅菌手袋と楽器の先端手術専用スペース以外に触れていないが、無菌性を維持します。
11. 皮膚のみがない基になる組織を削減する注意してください。切開を開く鉗子を保持するために 1 つの手を使用します。上向きに (マウスの右または左側) に肩甲骨を背面からポンプのためのポケットを作成するために皮膚を広めるにトロカールを保持するために他の手を使用します。
12. 切開にポンプを挿入します。ポケット (図 1 H) に、完全にポンプをそっと押し込みます。テンションがないと傷を閉じるために無料または必要な皮膚のストレッチ、十分な皮膚があるはずです。ポンプを挿入すると、縫合手術ワイヤー (polyglactin 910 縫合サイズ 6 - 0) で切開
    メモ: レギュレータの頭はマウス (図 1) の前面を向いてなければなりません。
13. クリーン綿棒 (図 1I) と 10% ポビドン ヨード軟膏を適用し、地球温暖化の段階で動物を飼います。胸骨の横臥を回復するまで無人でマウスを放置しないでください。水分補給状態を評価し、必要に応じて 0.9% 食塩液 0.5 mL を皮下に管理します。動物をそのルーチンの筐体に戻ります。
14. ドキュメントの機関のガイドラインに従ってください (例えば、手術と術後については、プロシージャと日付更新ケージのカードと手術フォームに記入) (ブプレノルフィン、0.05 mg/kg) 手術後の痛みを軽減する鎮痛剤を提供し、抗生物質 (エンロフロキサシン 85 mg/kg) 手術後の感染症を避けるために。
    1. 毎日の監視を継続し、痛みの兆候を調べます。傷口が完全に閉じて、皮下ポケットに側脳室内を維持に注意を払います。傷が開くことができます、マウスは、側脳室内を失う可能性があります。

3. 心臓の解剖

1. 犠牲、80-100 mg/kg 筋肉内投与した Zoletil の anestethize マウスの時。Zoletil は、深い麻酔を誘導します。注: マウスは、ペダルおよび眼瞼反射のテスト手順を実行する前に麻酔の十分な深さを確認します。マウスは、深い麻酔中灌流されます。胸骨は、胸骨の頭に向かって取り消し中に肋骨を横方向に切断することによってはさみや鉗子を使用して、胸腔内を開きます。
2. 10-15 ml の冷たいダルベッコ リン酸緩衝食塩液 (PBS) と血管系を修正する中性緩衝ホルマリンの 10% の 40-50 mL の重力灌流システムによって左心室を介してマウスを灌流します。固定は、マウスが積極的な筋収縮を展示し、硬直するときに示されます。
   注: 固定プロセス 10 〜 20 分の場所になります。蛍光抗体法や免疫組織化学的解析を実行する固定臓器や組織を使用することが可能です。重要なは、このような固定組織は遺伝子発現および西部のしみが付く分析を使用できません。
3. 鉗子で中心を押し (図 2 a) の損傷を引き起こすことがなく、心にできるだけ近く、大動脈の軸に垂直にハサミやメスの刃で切断で大動脈から心臓を区切ります。右および左心房 (図 2 b) のより低い点を結合する直線に沿って横にカットするメスの刃を使用します。
4. 最適な切削化合物 (OCT) (を通して心の空洞) 断面の心臓の上の部分を塗りつぶし (図 2 D-2E)。10 月 (図 2 f) でカバーして長方形金型のベースに垂直に置かれた大動脈の軸に cryosection プラスチック金型内の組織を置きます。閉じ込められた空気の泡はないはずです。任意のバブルが存在する場合は端に移動ましょう。
5. ドライアイスに金属板を配置し、(図 2) の金型を慎重に。OCT は白になると、銀の箔を金型をラップし、-80 ° C で保存

4. 切削部大動脈のルート

1. -20 ° C にクライオスタット マシンを設定します。切る前に埋め込まれた組織を置いて、この温度を調整する約 15 分間、それを残してください。-17 ° c (図 3 a) 試料ホルダーの温度を設定します。
2. クライオスタット (図 3 b) のブロックの温度を平衡と (図 3) 金型から冷凍の心ブロックを取るクライオスタット マシンの内部凍結心ブロックを配置します。良い標本ホルダー (図 3 D) にブロックの寸法を合わせて冷凍ブロックから余分な 10 月をカットします。
3. 心室に外側を向きますと指向試料ホルダーに冷凍の心ブロックをマウント (図 3E-3 i)、頭 (図 3J) を方向づける標本試料ホルダーに挿入します。大動脈基部をブレード (図 3 K) に垂直になるようためにブロックの切断を許可する試料ホルダーの向きを調整します。
4. ブロックを切り、大動脈のルートに到達するまでのスライスを放棄 (図 3 L-3 n)。連続切片を収集し、(図 3O) スライド ガラスの上に置きます。すべて 3 大動脈弁が表示されるまでは、顕微鏡下で大動脈の解剖学的プロファイルを監視 (図 3 P-第 3 四半期)。
5. オイル赤 O の Picro シリウス赤染色、10 μ m/セクション、6 セクションを収集 μ m/セクションの MAC3 (図 3 r) を染色します。周り収集 (ハート) の 3 つの弁のいずれかまでの 6-8 スライドが消えるか、もはやそのままではないです。

5. 免疫組織化学

注: 次のプロトコルで報告されたすべての染色手順は、ガラス Coplin 染色瓶に実行されます。

1. 中性脂肪のオイル赤 O 染色
   1. 70 mL の水道水で 5 分洗浄 37% ホルムアルデヒドのセクションを修正し、余分な水をしみ。
   2. 32 mL のオイル赤い O を取得する蒸留水でオイル赤い O (イソプロパノールは 0.5%)、48 mL を希釈 0.3%。
   3. オイル赤 O の 70 mL で切片を染めると、10 分で 10 分洗浄セクション水道の 0.3%。
   4. マイヤーのヘマトキシリンの 70 mL で 1 分間染色します。1 分の水道水のセクションを洗います。
   5. 70 mL に 0.5% 炭酸リチウムのセクションを浸します。1 分の水道水で洗ってください。
   6. 光学顕微鏡にデジタル カメラを使用して水溶液の取り付け中、キャプチャ画像のセクションをマウントします。
2. Picro シリウス赤のコラーゲンの汚れ
   1. 10 μ m 冷凍セクションをカットし、スライドの下部にマウントします。
   2. 70 mL で 5 分、乾燥した空気、水で簡単に洗浄用アセトンのセクションを修正します。
   3. 70 mL 0.2% リンモリブデン酸 5 分水で簡単に洗浄のためのセクションに配置します。
   4. 70 ml の 0.01 N HCl。 破棄ソリューションの 90 分すすぎ 1 回 0.1 %picro シリウス液 70 mL セクションに配置します。
   5. 2 分簡単にリンスの 0.01 N HCl の 70 mL で蒸留水。空気が乾燥。
   6. 70% のエタノールの 70 mL で簡潔に場所。
   7. 完全に乾いたら、テルペン由来のエージェントをクリア 70 mL に配置し、ポリを使用してセクションをマウント (ブチル メタクリル酸-co-メタクリル酸メチル) 光学顕微鏡にデジタル カメラを使用中、キャプチャ イメージのマウント ベースします。
      注: Picro シリウス赤染色の利点の 1 つはタイプを識別することが可能だ (太い繊維, 黄色オレンジ色の複屈折) ・偏光顕微鏡^{11 でタイプ III (薄い繊維、緑色の複屈折) コラーゲン繊維ネットワーク}.
3. マクロファージの汚損のための Mac3 汚れ
   1. 6 μ m 冷凍セクションをカットし、スライドの下部にマウントします。
   2. 70 mL で 5 分間つかる 70 mL の PBS の 2 分間冷アセトンのセクションを修正します。
   3. ピペットを使用すると、カバー部 1% ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) ソリューションと抗原検索のため室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。70 mL の PBS 5 分間浸します。
   4. ピペットを使用して、20 分洗浄 70 mL の PBS 3 時間 5 分の 0.3% 過酸化水素とスライスをカバーします。
   5. アビジン-ビオチン複合体 (ABC) を使用して、-次の手順のための HRP キット。
   6. ピペットを使用して、20 分間室温で通常ウサギ血清中のセクションをブロックします。洗い流さないでください。
   7. MAC3 で染色 (1: 300) で 90 分間した洗浄 70 mL の PBS の 5 分の 3 回。
   8. PBS 3 時間 5 分の 70 mL としたリンスの 45 分の二次ビオチン化抗ラット IgG (レバレッジ) で染色します。
   9. 30 分間の PBS 3 時間 5 分の 30 mL でリンスしたウサギ IgG ABC とセクションをカバーしてください。
   10. 10 回で蒸留水 70 ml の 10 分間すすぎ 3-アミノ--9-エチルカルバゾル (AEC) のセクションをカバーします。
   11. マイヤーのヘマトキシリンの 70 mL で 1 分間染色します。1 分の水道水のセクションを洗います。
   12. 0.5% の 70 mL でセクションを浸す炭酸リチウム。1 分の水道水で洗ってください。
   13. 光学顕微鏡にデジタル カメラを使用して水溶液の取り付け中、キャプチャ画像のセクションをマウントします。

6. 大動脈基部の節でアテローム性動脈硬化病変の像

注: 興味の抗体または MAC3 オイル赤 O 染色大動脈のルート セクションは、(材料の表で示される) 適切なソフトウェアを使用して分析できます。染色の関心のコンポーネントの肯定的な合計のピクセルは、全体のプラークの面積に正規化されます。画像が収集し、, 解析治療盲目捜査官。

1. 校正
   1. ソフトウェアを開き、分析する (jpg) の画像を選択します。
   2. ホームを選択 |作成|迅速な校正。
   3. 画像のキャリブレーションを設定するには、イメージのスケール バーに沿って線を描画します。
   4. キャリブレーションの設定を保存します。
2. 画像解析
   1. [オプション] メニューから保存したセットアップ校正を選択 |空間キャリブレーション オプション。
   2. 校正を選択 |を適用します。
   3. [選択] メニューの [ポリゴン] ツールを選択し、に沿ってすべての動脈硬化病変の境界を描画します。
   4. 数/サイズを選択 |タイプ。メニューからエリアと% 領域を追加します。
   5. 数/サイズ」メニューから選択マニュアルと新しいウィンドウが開きます。
   6. このウィンドウから画像を色を選択ツールをクリックし、 HSIモードを選択します。
   7. 色の範囲を作成する興味のマーカーの肯定的なピクセル [マウス カーソルをポイントします。
   8. カウントをクリックし、値合計、測定表の観察は、アテローム性動脈硬化病変の全領域に関して (μ m²も表現) マーカーの領域の割合を示します。

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結果

8 〜 10 週間 Apo^-/-マウスのミニポンプが車両やアルドステロンを吹き込むに移植された (図 1E-1I) と 4 週間 (調整カロリー ダイエット脂肪から 42%) 動脈硬化食事を供給します。治療の最後に、マウスが安楽死、PBS と前述の通り 10% ホルマリン潅流します。大動脈は心臓の先端部から分離され、OCT (図 2) に?...

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ディスカッション

動脈硬化は、マクロファージ、T リンパ球、血管内皮細胞、平滑筋細胞¹など、複数のセル型の間の相互作用を含む大型と中型の血管に関連する慢性炎症性疾患です。マウスの動脈硬化モデルの制限にもかかわらずアテローム性動脈硬化の過程に関する証拠の大きいボディがあり。これらのモデルには、特定の年齢や性別の実験的コホートを急速に生成する利点があります。?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images