再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

要約

設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン ラックの解析のための詳しいプロトコルについて述べる。

要約

DNA ナノ構造に基づく機械システムまたは DNA ナノマシン オングストローム分解能をナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール運動を作り出す、ドラッグデリバリー、分子の原子炉などナノテクノロジーの様々 な分野で大きな可能性を示してください。・ nanoplasmonic システム。DNA の入力への応答の複数の段階で、要素の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作できますまとめて、再構成可能な DNA アコーディオン ラックが説明されています。プラットフォームには、再構成の複数の段階のネットワーク規模にいくつかの要素から DNA ナノマシンの制御できる要素の数を増やす可能性があります。

このプロトコルで再構成可能な 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラック全体の実験プロセスをについて説明します。プロトコルには、構造と合成と再構成のウェット研究室の実験の設計ルールとシミュレーションの手順が含まれています。さらに、TEM (透過型電子顕微鏡) とフレット (蛍光共鳴エネルギー移動) を使用して構造の解析は、プロトコルに含まれます。このプロトコルで覆われている新規の設計とシミュレーションの方法は、さらにアプリケーションの DNA アコーディオン ラックを使用する研究者を支援します。

概要

DNA ナノ構造や DNA ナノマシン^1,2,3,4,5に基づく機械システムが一意にナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール モーションを出すのでオングストローム分解能、様々 な生体分子の刺激^2,3,6によると。これらの構造の機能性材料を取り付けると自分の位置を制御する、これらの構造は、様々 な分野に適用できます。たとえば、DNA ナノマシンは分子原子炉⁷、薬配信⁸、および nanoplasmonic システム^9,10の提案されている.

以前、紹介した再構成の DNA アコーディオン ラックは、要素¹¹ (図 1 a) の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作することができます。異なり、いくつかの要素を制御するだけ他の DNA ナノマシン、プラットフォームはまとめて、さまざまな段階に周期的に配列した 2D または 3D 要素を操作できます。プログラム可能な生物・化学反応ネットワークまたは分子コンピューティング システム ビルドできることを私達のシステムから制御可能な要素の数を増やすことで期待しています。DNA アコーディオン ラックは、複数の DNA 梁のネットワークは単一座礁させた DNA (図 1 b) の接合に接続されて、構造です。DNA 梁によって生成されたアコーディオンのラックは、梁の粘着部分に交配させるし、ロック (ロック状態) のブリッジ部分の長さによると梁の間の角度を変更する DNA ロックによって再構成されます。さらに、鎖の足掛かりに基づく変位^12,13を介して DNA ロックをデタッチによって自由国の形成の後新しいロックを加えることによって多段の再構成を示します。

このプロトコルで再構成可能な DNA アコーディオン ラックの全体設計・合成プロセスをについて説明します。プロトコルには、設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラックとこれらの再構成の合成の分析が含まれています。以前研究¹¹の基本的なモデルのプロトコルで覆われた構造で、65 65 nm nm の 14 の梁から成る。設計とシミュレーションの面でのアコーディオンのラック構造設計は従来 DNA 折り紙^14,15 (すなわち、ぎっしり詰まった) によって違います。したがって、設計ルールと分子シミュレーションを従来の方法から変更されています。示すために、caDNAno¹⁴の変更されたアプローチと追加のスクリプト oxDNA^16,17を使用してアコーディオンのラックのシミュレーションを用いた設計法を示す.最後に、構成されたアコーディオン ラック構造の分析 TEM およびフレットの両方のプロトコルを説明します。

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プロトコル

1. 6 DNA アコーディオン ラック caDNAno¹⁴で 6 のデザイン

1. ダウンロードし、インストール caDNAno 2.0 ソフトウェア¹⁴ DNA アコーディオン ラックを設計する (caDNAno 2.5 も https://github.com/cadnano/cadnano2.5 で利用可能です)。CaDNAno¹⁴を開き、正方格子で新しいパーツを追加する正方形ツールをクリックします。
2. アコーディオンのラックの各ビームの数、caDNAno¹⁴ (図 2) の左の格子パネルに描画します。
3. [鉛筆ツール] をクリックし、caDNAno¹⁴の右の編集パネルで各ビームを描画します。休憩梁すべて 32 bp は、隣接する梁の接合部は。関節と同じ位置に定番のクロス オーバーを配置します。CaDNAno¹⁴ 挿入ツールや[鉛筆] ツールを使用して、追加の単一座礁させたクロス オーバーがある関節をできるようにします。
4. [鉛筆ツール] をクリックし、関節を接続します。各ビームは 7 つの関節です。
5. ルーティング アルゴリズム¹¹以前に報告された足場を使用して、単一のループに足場をマージする足場のクロス オーバーを生成します。8 未満になる足場と主食の鎖間最小結合ドメインはいけない bp (図 3)。
6. 図 3に示すように、アコーディオンのラックの反対側にある頂点のアセンブリに慣れていない足場を配置します。
7. 分割ツールをクリックします。ステープル繊維、円形または 60 より長い毛を壊して bp。
8. ロックの dna を設計します。
   1. 分割ツールをクリックします。粘着部分を作るし、8 を削除する定番 DNA 領域の休憩 8 bp 定番 DNA 領域の bp。6 6 によってアコーディオン ラック 18 粘着部分 (図 1) があります。
   2. ロック鎖の両端に粘着部分に相補的なはリバース シーケンスを配置し、ポリ T (図 1 b) の所望の長さの鎖から成っているブリッジの地域でそれらを接続します。
   3. 再構成、追加 8 ストランド変位、DNA の終わりに足掛かりシーケンスの bp をロックします。表 2使用足掛かりシーケンスです。
   4. ポリ A 鎖が逆ブリッジ領域に補足を準備します。
   5. デザインのストランドにある逆再構成実験 DNA ロックを補完するもの。
9. シーケンス ツール足場 DNA をクリックします。標準 M13mp18。エクスポート ツールをクリックして csv 形式 (表 1) で、シーケンスを保存は、足場を選択します。

2、oxDNA の構造をシミュレートします。

1. ダウンロードして oxDNA^16,17をインストールします。最新のソース コードは、https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/ で利用可能です。
2. OxDNA^16,17パッケージで提供されている ' cadnano_interface.py' の python スクリプトを使用して caDNAno¹⁴ファイルから開始の設定ファイルを作る。使用方法のとおりです: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'。トポロジ ファイルと構成ファイルが生成されました。
   注: トポロジ ファイルを含むどのように多くのストランドし、ヌクレオチドは、構造とのヌクレオチドの間基幹バックボーン債に関する情報。構成ファイルには、刻み、エネルギー、ボックスのサイズなどの一般的な情報が含まれています。位置ベクトル、バックボーン基底ベクトル、法線ベクトル、速度、およびヌクレオチドの角速度など向きの情報が含まれている (図 4)。
3. アコーディオンのラックの真の構造情報を反映し、caDNAno¹⁴からトポロジおよび構成ファイル内の情報を変更します。CaDNAno¹⁴からトポロジおよび構成ファイルは、視覚化されたとき、すべてのビームが平行に配置されます。ただし、アコーディオンのラックは、結合ヌクレオチド間の距離は、シミュレーション (図 5) まで格子構造です。
   1. 回転、各ビームを任意の格子構造に移動します。構成ファイルで左に 9 つの列が位置ベクトル、バックボーン基本ベクトルと法線ベクトル (図 4)。ビームを回転するには、すべての位置の回転変換を用いたバックボーン ベースと通常のベクトルを回転させます。図 5に示すように、それを見つけるに位置ベクトルを変更することでビームを移動します。
   2. OxDNA パッケージで提供されるスクリプトを使用して構造体をリラックス ($oxDNA の例を参照してください/例の RELAX_INITIAL_CONFIGURATION さらに詳しい情報/)。
4. 分子動力学法によるリラックスした構成ファイルを使用して 1000 万の手順を実行します。使用方法のとおりです: './oxDNA < 入力 >' すべての 5000 や 10000 ステップ データを保存します。
5. 可視化
   注: 構造は、cogli を使用して視覚化されました。
   1. ダウンロードし、cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/) の最新バージョンをインストールします。
   2. OxDNA シミュレーションからトポロジおよび構成ファイルで、cogli を実行します。使用方法のとおりです: './cogli1 t < トポロジ ファイル >< 構成ファイル >'。
   3. ボックスを非表示には、 bを押します。

3. 構造体の合成

注: 以前のプロトコル^15,18から合成法が適応されます。

1. オリゴヌクレオチド プロバイダーからデザインの DNA ステープルを購入します。
2. これらの DNA ステープルはヌクレアーゼ フリー水を使用して 100 μ m の濃度を調整します。
   1. 1 つの管に '無料の状態の構造を構成する各 DNA 鎖をプールし、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。
   2. プール DNA ロックはチューブに鎖の長さとロックのサイトの数によって、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。18、9、4 サイトをロックが使用されます。同じ濃度でブリッジの領域に補足であるポリ A 鎖を追加します。
   3. プール鎖 DNA に相補的な逆に、管に長さによって鎖をロック各ストランドの 2 μ M に濃度を調整してください。
3. 300 の MgCl₂ソリューションを準備ヌクレアーゼ フリー水の 70 μ、1 μ M MgCl₂ソリューションの 30 μ L を混合することによって nM。ヌクレアーゼ フリー水の 95 μ L と 100 倍トリス EDTA 溶液の 5 μ L を混合することによってトリス EDTA 溶液 x 5 を準備します。
4. 定番 MgCl₂ソリューションの 1.1 μ L の DNA の 2 μ L、トリス EDTA 溶液、ヌクレアーゼ フリー水の 7.6 μ L と足場の DNA 濃度が 110 の 7.3 μ L の 2 μ L を追加混合株式の 20 μ L にする nM。最終的な足場 DNA 濃度を 40 に設定海里、200 nM、MgCl₂から 16 mM と 0.5 にトリス EDTA 溶液に DNA をホチキス止め x。
5. 60 ° C ° C あたり 40 分のレートで 4 ° C から 4 ° C とクールな毎分の割合で 60 ° C にサーマルサイクラーを 80 ° C でクールな混合原液を急速に熱します。

4. 構造体の浄化

注: すべての構造体のサンプルを分析する前に精製しました。このセクションで以前の文学¹⁹から適応されているペグ浄化のプロトコルについて述べる。以前の文学^15,18で説明するよう、サンプルをゲル電気泳動浄化もことができます。

1. 5 M の NaCl と 100 x トリス-EDTA を準備します。
2. ペグ 8000、トリス EDTA x 100 の 500 μ L と 5 M の NaCl の 101 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 249 μ L の 150 μ L を混合することによって沈殿バッファーを準備します。
3. セクション 3.3 から 300 nM MgCl₂ソリューションの 5.5 μ L、セクション 3.3 から 5 x トリス EDTA 溶液 10 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 84.5 μ L を混合することによってターゲット バッファーを準備します。
4. セクション 3 とセクション 4.2 から沈殿バッファーの 20 μ L から合成構造のミックス 20 μ L。その後、4 ° C で 16000 × g で混合株をスピンします。上澄みを除去し、セクション 4.3 からのターゲット バッファーのペレットを溶解します。

5. 'ロック状態' '無料状態' からアコーディオン ラックの再構成

1. 構成実験 DNA ロックせず構造を合成します。
2. セクション 3 からロック dna を準備します。
3. 合成構造の 20 μ L に所望の長さの dna ロックの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。
4. 0、10、25、50 のサンプルをインキュベートまたはどのように迅速に再構成して 100 分が発生します。
   1. 100 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 30 分間インキュベートし、ゆっくり 0.33 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
   2. 50 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 15 分間インキュベートし、ゆっくり 0.66 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
   3. 25 分インキュベーション 7.5 分の 50 ° c サンプルをインキュベートし、ゆっくり 1.32 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
   4. 10 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 3 分間インキュベートし、ゆっくりと 3.3 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
   5. 0 分インキュベーション dna ロックが追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。
5. 取り付け手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。

6. アコーディオン ラック '無料状態' の 'ロック状態' からの再構成

1. 構成の実験を希望する長さの DNA ロック構造を合成します。
2. セクション 3 から逆の相補的な鎖を準備します。
3. 合成構造の 20 μ L に所望の長さのロックの鎖に相補的なリバース、ストランドの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。
4. 0、12、60、120 サンプルをインキュベート、どのように迅速に再構成して 240 分に発生します。
   1. 12、60、120、240 分インキュベーション 40 ° C にサンプルを急速に加熱し、ゆっくりとそれぞれに対応する時刻の 20 ° C まで冷却します。脱着の手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。
   2. 0 分インキュベーション逆相補的な鎖が追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。

7. 電子顕微鏡イメージング

注: 電子顕微鏡イメージング プロトコルは、以前の文学^18,20から適応されました。

1. ヌクレアーゼ フリー水の 87.5 μ L と 10 M NaOH 溶液 12.5 μ L を混合することによって 1.25 M NaOH 溶液を準備します。
2. 2% ウラニル ギ酸溶液 50 μ L に 1.25 M NaOH 溶液 1 μ L を追加します。
3. 渦 3 分、最大速度で 3 分間遠心するためのソリューション。3 分間のグロー放電 TEM グリッド上精製サンプルの 3 μ L を預金し、急速にろ紙を洗い流します。
4. 30 秒間入金の準備ウラニル ギ酸溶液 7 μ L と急速にろ紙を洗い流します。
5. 長さとアコーディオン構造の tem イメージの角度を測定します。

8. フレット解析

1. Atto 550 と Atto 647N 染料、フェルスター距離、6.5 を使用して nm。蛍光標識鎖で主食 58、表 1の主食 117 を置き換えます。セクション 3 で説明する方法によって蛍光標識ストランド構造を合成します。
2. 精製した試料の濃度を測定します。
3. まあ 384 プレートに 10 nM と負荷 50 μ L のサンプルを正規化します。
4. エキサイト、550 nm 帯およびメジャー ドナーとアクセプター色素サンプル 570 から蛍光スペクトル nm 800 から nm、蛍光光度計。
5. 同じ方法でドナーのみのサンプルの蛍光スペクトルを測定します。
6. 650 でサンプルの染料を刺激 nm と蛍光スペクトル測定 670 から nm 800 から nm。これは、受容体の濃度を測定することです。
7. 3 つのサンプルが合成され、個別に浄化すると同じ実験を繰り返すことによって標準偏差を取得します。
8. 比²¹以下の方程式で記述されるような方法で FRET 効率を計算します。
   
   DA₅₅₀: ドナーとアクセプター 550 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。
   D₅₅₀: 550 nm 励起のドナーのみのサンプルのアクセプター発光範囲で蛍光強度。
   ダ₆₅₀: ドナーとアクセプター 650 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。

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結果

OxDNA^16,17から 6 によって設計された 6 DNA のアコーディオン ラックをシミュレートし、結果を図 6に示します。シミュレーション結果から構造の歪みのない意図されていた構造が形成されることが確認されました。

図 7の TEM イメージ 2?...

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ディスカッション

このプロトコルは、設計、シミュレーション、合成、および基本的な 2D DNA アコーディオン ラックの解析から全体のプロセスを紹介します。変更された設計とシミュレーション ルールは記載柔軟性^14,15のクロス オーバーで、DNA アコーディオン ラックはヌクレオチドという点で標準的な DNA 折り紙の設計ルールが異なるためにをされています。この...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 Single-stranded DNA	NEB	N4040s
1M MgCl2 Solution	Biosesang	M2001
Tris-EDTA buffer	Biosesang	T2142
Nuclease-Free Water	Qiagen	129114
5M Sodium Chloride solution	Biosesang	s2007
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
10N NaOH	Biosesang	S2038
Uranyl formate	Thomas Science	C993L42
Thermal cycler C1000	Biorad
Nanodropic 2000	Thermo Fisher Scientific
TEM (LIBRA 120)	Carl Zeiss
Fluorometer Enspire 2300	Perkin-Elmer
Centrifuge	Labogene	LZ-1580