豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療

要約

このプロトコルは、自家細胞移植を介して代謝性疾患モデルを治すため豚肝細胞分離とex vivo遺伝子デリバリーを記述したものです。この特定のモデルは、成功した療法を支持するユニークな利点を楽しんでいます、アプリケーションはその他の病気と徴候に対処する関連する財団。

要約

遺伝子治療は、多くの先天性肝臓の代謝異常を治療するに最適です。Ex vivo、として彼らの使用を提供する安定した遺伝子発現の宿主ゲノムに統合する能力をベクトルのために、ヒトでは、多くの造血器疾患の治療にレンチウイルスベクターを正常に使用されています。このメソッドは、肝細胞の遺伝子治療前のヴィヴォの遺伝性の tyrosinemia タイプの大型動物モデルへの応用を示します私。このプロセスは、1) 自家ドナー/受信者動物、2 から初代肝細胞の分離) レンチウイルスベクター、ポータル経由で修正された肝細胞の 3) 自家移植と肝細胞伝達を介して遺伝子配達前のヴィヴォ静脈注射。メソッドの成功は、一般的に肝切除術、単離細胞の再接が、高割合の伝達のための十分な実行可能な肝細胞の分離切除標本の取り扱い注意の効率的かつ滅菌除去に依存していて、感染を防ぐために全体の無菌手術。これらの手順のいずれかで技術的な障害は、自家移植のため導入された肝細胞実行可能な低収量やドナー/受信者動物の感染症になります。強力なに基づいて健康な細胞と小さな修正された細胞の生着率も肝臓の再作成につながるとヒト 1 型遺伝性 tyrosinemia (HT 1) このアプローチのために選択の豚モデルが一意にそのような方法に従うネイティブ病気肝細胞の選択的優位は。この成長の選択は、すべての兆候には当てはまらないだろう、このアプローチに他の適応症の拡大のための基盤は、肝臓内の両方その他の疾病に対処し、ながら、この環境の操作は、ウイルスのベクトルと的外れの毒性と腫瘍のための機会への暴露を制御します。

概要

先天性肝臓の代謝は、総称してできるだけ多くの 1 の 800 出生¹に影響を与える遺伝病の家族です。これらの疾患の多くは単一遺伝子の欠陥は²であり、機能的肝³の十分な数に影響を受けた遺伝子の単一の修正されたコピーを導入することによって治すことができます。修正が必要な肝細胞の実際の割合病気⁴によって異なりますが、たとえば、排泄蛋白質細胞質対それをエンコードし、タンパク質の性質に大きく依存します。ほとんどの場合、代謝性疾患の任意の治療の有効性はしばしば循環で利用可能なバイオ マーカーの存在によって簡単に試金します。

HT 1 は先天性欠陥 4-フマリルアセト酢酸加水分解酵素 (ファー)⁵、チロシン代謝⁶の最後の酵素ステップからの結果肝臓の代謝異常です。FAH の欠乏は、急性肝不全と死を引き起こすことができるまたは病気の慢性の形態が原因で肝硬変や肝細胞癌肝毒性代謝産物のビルドに します。病気は、2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) をもたらすチロシン代謝の FAH の上流酵素の小分子阻害薬の投与により臨床的に管理されます。病気は、肝細胞の数が少ないもの成功補正で結局起因する肝臓全体の再作成両方の小規模および大規模な動物モデルに修正された細胞の遺伝子治療法をテストする理想的な環境^7,8します。 これは、修正細胞後者で裸眼の細胞毒性代謝産物の蓄積のために深遠な生存の利点があります。肝臓の再生能力と一貫性のある修正された肝細胞の選択的な拡大のため裸眼肝細胞の損失ができます。治療は、移植チロシンと succinylacetone のレベルを循環の減少を測定することによって簡単に続くことが。

部分肝切除を含むプロシージャの侵襲を正当化するためにこのアプローチの目的は、耐久性のある治療法をする必要があります。したがって、レプリケーション無能なレンチウイルスベクターは、安定して肝細胞ゲノム⁹に統合されるために使用されます。肝臓としての娘のすべてのセルに修正された遺伝子の配信を確保する成長し、裸眼の細胞の急速な損失を置き換えるに拡大します。これは有糸分裂¹⁰週間の問題で治療の効果を失うことの間に 1 つの娘細胞にのみ渡されるエピソームとして主に存在している関連付けられているアデノ ウイルス (AAV) ベクターで有利であります。

文献の成長するボディにレンチ ウイルス¹¹懸念の安全性をサポートしていますが、遺伝毒性イベントが制御体外環境に宿主細胞の情報伝達を制限することによって軽減されます。このメソッドを実行すると、門脈内自家移植と再導入される肝細胞への暴露を制限するとき、無料ベクトルがホストに導入決して全身。

このレポートでは、手術の方法と分離肝細胞遺伝子療法前のヴィヴォと後続の自家移植¹² HT 1 豚⁸の治療のために使用される前のヴィヴォプロシージャについて説明します。完全なプロセスには 1) 肝細胞と肝臓のホストの成長刺激の源、2) 遺伝子補正前のヴィヴォ、最終的に 3) の再導入に続いて摘出した肝臓から肝細胞の分離として機能する部分切除が含まれています、修正された肝細胞は、ホストにバックアップします。説明する方法をいくつか修正して、すべての大型動物モデルに適用されますが、FAH 欠損豚¹³だけは修正された肝細胞の選択的な環境の利点があります。

プロトコル

動物のすべてのプロシージャは、見直しされ、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって試験を実施する前に承認制度のガイドラインに従って行われました。ここで説明する手順を健康と手術に不向きと判断される年齢の 3ヶ月男性と女性の大きな白い農場の豚 (50 %landrace/50% 大きな白い遺伝的背景) を施行しました。 動物は、獣医の介護施設スタッフが互換性のない見なされない限り社会的収容されます。 動物は、少なくとも一度毎日介護スタッフによる食事 2 回毎日、臨床症状の観察の適切なレベルを供給します。

1. 手術のための準備

1. 5 mg/kg の telazol および 2 mg/kg 筋肉内鎮静作用を誘発するキシラジンを管理します。術後鎮痛のための 0.18 mg/kg の用量で皮下ブプレノルフィン SR を管理 (この線量から鎮痛、72 h になる予想)。鎮静を確認する応答のための動物を手動で確認します。
2. 鎮静、薬理学的アクセスの周辺の耳静脈に静脈カテーテルを挿入します。
3. 手術前 25 mg/kg の静注セファゾリン、セフチオフルの 5 mg/kg 筋肉内を管理します。
   1. 血圧とプロシージャ全体で通常の生理学的範囲内で心拍数を保つため、静脈内に食塩を管理します。
4. 胃を解凍する場所 orogastric チューブ。適切なサイズの気管内チューブの気管内挿管を行い呼気を検出するために手動で胸を圧縮することによって適切な配置を確認し、1-3% イソフルランと動物を機械的に換気します。
5. 心電図 (ECG) リード、血圧計カフ、温度プローブ、およびバイタル サインの監視および記録にパルスオキシメータを配置します。仰臥位で動物を置いて、betadine で骨盤を肋骨から腹部をスクラブ、薬液をドレープします。
6. 麻酔外科平面を維持するために手順 1-3% イソフルランと件名を換気します。変更のためのバイタル サインを監視し、イソフルランを血圧低下は劇的に、イソフルランを削減し、よう活力を復元するための制度的承認エージェントを開始場合前切開レベル時の心拍数を維持するために調整を続ける静脈内アドレナリン。
   1. 心拍数、呼吸、血圧、追跡し、大規模な動物福祉基準の遵守を確保するため機関固有のポリシーに従って動物の福祉を維持する手術記録に体温を記録します。

2. 腹腔鏡下肝部分切除

1. 臍頭側にオープン八専テクニックを使用して初期ポート サイト エントリを実行します。腹膜が視覚化されたとき安全に腹腔内に 12 mm のトロカールを紹介します。このポートを 5 mm、30 ° の範囲を通過します。
2. CO₂ 15 mmhg と腹部を吹き込むため。腹腔鏡カメラを直視下で肝臓の左葉外側に三角 2 つの追加の 5 mm ポートを配置します。ポートの正確な配置は、サイズと動物の解剖学に依存します。
   1. この時点で、5 mm のポートの 1 つに腹腔鏡を配置します。
3. 左葉の主要な割れ目の時点で肝左外側のセグメントを識別します。この割れ目は、医療および左外側セグメントを分離します。外科的ホチキスを使用してこの割れ目に沿って肝静脈とともにポータル構造を確保 (材料の表を参照してください)。60、45、または 30 mm 長い血管の負荷を使用してホッチキスから順次実行を使用してこの裂を実質を縦断面します。
   1. 実質切除が完了したら、十分な止血を確認する残肝を評価します。メスや縫合と実質内から任意の出血を制御します。
4. 内視鏡把持および、内視鏡的組織検索バッグ使用して肝のセクションを取得します。
5. ポートを削除して中断サイズ 0 縫合正中線筋膜、深い真皮層の実行 2-0 縫合、真皮層の実行中 4-0 縫合糸で、3 つの層に 12 mm ポート切開を閉じる。2-0 の 1 つのレイヤーに 5 mm ポートを閉じることができます。
6. (材料の表を参照してください) 切開に滅菌ドレッシングを配置します。
7. セルは 4 時間以内で準備されます、全身麻酔下の動物を自家移植の時まで手術後維持。
8. また、セル操作は長い期間を必要とする場合、(このメソッドの個々 のアプリケーションに基づく伝達/選択期間を長くまたは肝細胞のスフェロイドの形成を許可するなど) は麻酔繰り返しから回復する動物を許可する、セルは準備ができているときは自家移植前に全身麻酔導入手順。

3. 肝細胞の分離

1. その液温の組織への導入時に 38 ° C 肝のセクションの大きな露出血管内にカテーテルを血流 (43 ° C の水浴中維持される) 暖かい分散ソリューションを提供する設定を蠕動性ポンプを接続します。すべての配管、機器、およびソリューションは、ように細胞の移植に適した滅菌保持されなければなりません。
   1. プライム ポンプとチューブ II あたりを私と組織にあたり II 配信ごと切り替える配置活栓まで。プライム チューブ セットの残りの部分を導入することを防ぐために完全にラインでバブル トラップを充填置きのあたりに、活栓を切り替える組織に気泡します。
2. きれいな横断方向の垂直を門脈枝の断面を明らかにするための肝循環にカットを準備し、肝静脈カテーテル法のため。
3. 液の漏出を避けるためにジャスト フィット カテーテルで利用可能な公開された静脈カテーテルを入れて下さい。少なくとも 1 のポータル、組織の適切な血流を確保するため 1 肝静脈を cannulate します。
   1. 確実に、catheter(s) 空気のプライミング/無料の静脈にカテーテルを配置する前に。
4. ぬるま湯につき 100 mL/分、出口管静脈から静脈に 30 秒ごとに移動 1 分サイクル 15-20 分のすべての利用可能な静脈を介して灌流します。中につき、注入は真空下で廃棄物コンテナーにプロシージャ トレイを空にする避難チューブを設定します。
5. 100 mL/分としての静脈につき、合計 30 分のサイクリングで II あたりに切り替えます。当たり中、活性酵素の調製を節約するために再投与の貯水池に戻すあたり II をリサイクル リターン ポンプを使用します。流出ポンプ以上にリターン ポンプを設定 (すなわち、 94 mL/分)、ソースのボトルに過剰な空気を返すに触らない。
   1. 肝カプセルが破損した場合は、この時間を短縮することができます。
   2. 肝臓は完全に消化されない場合 (焦点で穏やかな圧力とえくぼ残っていない) 灌流のさらに 5 分を実行ことができます。
6. 時折 (約 5 分) は、バブル トラップおよび/または肝細胞が寒くないように肝臓の表面温度を文書化します。肝臓が冷める場合 (< 35 ° C) 38 ° c. に近い肝臓の温度の復元に風呂の水の熱を上げる肝灌流が進むにつれて、ブランシュをする必要があります。
7. 滅菌プレートやシャーレ細胞文化フードへの輸送のために肝臓を削除します。肝細胞処理中に整合性を維持するために滅菌ドレープ、滅菌フィールドをカバーします。
8. 滅菌ドレープから肝のセクションを公開し、冷たい肝細胞洗浄メディア (HWM) で肝臓が水没します。上部にはさみをドラッグすることによって、カプセルを混乱させます。滅菌手袋の着用、中に肝細胞を解放する肝臓を優しくマッサージします。
9. 大きい (~ 200 mL) 遠心ボトルに滅菌ガーゼを肝細胞を含む HWM をフィルター処理します。3 通、(該当する場合) として最初の再懸濁後複数のボトルから細胞ペレットを組み合わせることで、以下の手順で肝細胞を洗います。
   1. 50 x g、5 分、4 ° C で遠心分離
   2. 吸引し、HWM の 150 mL で再懸濁します。
   3. 3^rd洗浄後 HWM にペレットを残します。
10. 利用可能な診断またはその他のデバイスを使用して細胞濃度をカウントします。これらの細胞は、遺伝子治療、細胞の選別、自家移植の前に他の専門など、興味の前のヴィヴォ操作のため準備が整いました。HWM の最終巻は、特定濃度 (セル/mL) をターゲットに調整できます。

4. 肝細胞情報伝達

1. メディアで肝細胞を再懸濁します (ダルベッコ変法イーグル培地 [DMEM], 10% 牛胎児血清 [売却]、ペニシリン ・ ストレプトマイシン ・ 4-(2-hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic 酸 [HEPES]、デキサメタゾン、上皮成長因子 [EGF] ・ NTBC) 1-2氷の上の円錐管の mL あたり 100万個。
2. 常温レンチウイルスベクターを解凍し、感染細胞をバインドする (MOI) の多様性を 20 ターゲットで氷の上の円錐管に追加。細胞の表面にウイルスのベクトルをバインドする 90 分の 10 の rpm で 4 ° C でセルを回します。
3. チューブを 30-40 分 5 分ごとに容易にバインドされたセルを伝達ベクトルをミックスする反転の 37 ° C に転送します。
4. 4 分氷の上望ましい集中に生理食塩水で細胞ペレットを再懸濁します 4 ° C で 50 x g で細胞を遠心します。この洗浄を準備から任意の非連結ベクトルの削除を繰り返します。
5. 可能であれば、生存性、付着性、伝達効率、等をチェックするセル (6 ウェルあたりすなわち500,000 の細胞も細胞培養プレート) の十分な因数をプレートします。
   注: 同じ日手順については特に、自家移植の前にこれらのパラメーターを評価することが可能です多くの場合。たとえば、本明細書に記載されている手順は、移植前に肝細胞に容易に assayable なかったアルファ 1 antitrypsin 肝特異プロモーターの制御下でタグなしのFah cDNA を採用しました。ただし、これらのめっきされたセルは、(すなわち、西部にしみが付くこと経由で) 伝達の成功またはプロシージャの一般的な成功の予測の指標として、自家移植後検定することができます。

5. 肝細胞移植

1. 2 に 5 MHz の探触子を用いた超音波を介して門脈を識別します。18 G、5 インチ主要な門脈の分岐に近位に向かって針を直接します。
2. 注射器を使用して 1 × 10⁹肝細胞 (約 10 g) を低速手動注入を開始します。注入カテーテルを用いた移植中ポータル圧力を監視します。
   1. ポータルの圧力の増加上記基準以上 8 mmHg、注入を一時停止し、ベースラインのレベルに戻るには圧力を許可します。
   2. ポータルの圧力が一時停止した後ベースラインに返されない場合、5 分間注入は注入を中止します。
3. 移植カテーテルの抜去後、血栓の有無を評価して門脈血流超音波を使用します。

6. 術後回復およびメンテナンス

1. 適切な回復エリアに制約を移動し、動物が完全に外来、15-30 分ごとに暖かい毛布を維持体の温度や空気加熱のラップに、必要に応じて、心拍数、酸素飽和度、体温が監視するまでを確認します。
2. 毎日 (研究の終わり) まで口の中で inappetence の発作が発生することができます胃の潰瘍のチャンスを減らすために 1 mg/kg オメプラゾールを管理します。
3. 術後、動物ラボとの獣医のスタッフによって密接に監視されます、通常、追加の鎮痛薬のブプレノルフィンを術前投与から別を必要としません。 遭難/痛みの兆候は、修飾された獣医の心配のスタッフ (切開、inappetence、無気力を守って) によって観察される、抗炎症剤 (すなわち、カルプロフェン) が投与されることがあります。

7 のレシピ

1. このプロトコルで使われるレシピの表 1を参照してください。

試薬	HWM	試薬	(10 倍) につき	II あたり (10 倍)
ウィリアムズ-E パウダー (g/L)	10.8	食塩 (g/L)	83	39
NaHCO3 (g/L)	2.2	KCl (g/L)	5	5
HEPES (g/L)	2.6	HEPES (g/L)	24	240
ペン/連鎖球菌 (100 x, mL/L)	10	グリコールエーテルジアミン四酢酸 (g/L)	9.5	-
ウシ胎児血清 (mL/L)	100	N アセチル L システイン	8	8
pH	7.3	(N ・ A ・ C、g/L)
		ニトログリセリン (mL/L)	5	5
		CaCl2 2 H2O (g/L)	-	7
		コラゲナーゼ D (mg/mL)	-	0.2
		pH	7.4	7.6

表 1: 肝切片から肝細胞の分離で使用される解決のレシピ。

結果

肝切除と移植は図 1で図式で表されます。肝切除を施行した 5 豚の代表的なコホート研究において、ほとんどの利回りがあった > 1 × 10⁹肝細胞生存率約 80% (表 2) の任意のタイプの細胞の多くを提供する必要な操作、遺伝子を含む療法。それらの 5 を示した豚良い生存率および典型的な肝細胞の形態伝達と初期めっき (

ディスカッション

このレポートでは、HT 1 の豚のモデルを治す自己遺伝子ex vivo療法アプローチについて説明します。部分肝切除、肝細胞分離前のヴィヴォと分離肝細胞の情報伝達に続いて是正遺伝子を運ぶ遺伝子導入ウイルスが含まれます。修正自己肝細胞は門脈⁸を介して FAH 欠乏動物に戻って、移植されます。説明する方法はいくつかの変更とすべての大動物モデルに適用で?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314