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要約

ここでは、効率的に細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えをショウジョウバエ視覚系内低豊富で存在を隔離するための細胞解離プロトコルを提案する.

要約

次世代シークエンシングの感受性の最近の改善はトランスクリプトームとゲノム解析の少数のセルへの適用を容易にしました。携帯型固有の遺伝的ツールの富を誇るショウジョウバエ視覚系における開発にこの技術を活用した正確な携帯電話の解像度を持つ開発の分子基盤に対処するための強力なアプローチを提供します。このようなアプローチ可能であること、確実かつ効率的に細胞脳内低豊富で存在を浄化する能力を持っていることが重要です。遺伝のモザイク実験単一細胞のクローンの効率的な精製ができる方法を紹介します。このプロトコルで一貫して実現高収率の細胞蛍光を用いた浄化セル (FACS) (ラベルのすべてのセルの ~ 25%) を並べ替えをアクティブ化してによって生成された単一のセル複製のトランスクリプトーム解析を正常に実行モザイク解析抑制型細胞のマーカー (MARCM)。このプロトコルは、特定の細胞型へのトランスクリプトームとゲノム解析を開発と異なる遺伝的操作のコンテキストでのさまざまな段階で視覚システムの適用に最適です。

概要

ショウジョウバエ視覚系は、発達や行動の遺伝的基盤を研究するための優れたモデルです。ステレオタイプ化された細胞アーキテクチャ1と特定のセル型2,3を操作するための高度な遺伝子のツールキットを装備されています。このシステムの主要な強さは、自律的遺伝的モザイク メソッド4,5を使用して、単一のセル解像度に目的のセル型で遺伝子の機能を調べる機能です。我々 はこれらの遺伝学的ツールを組み合わせてセル型固有トランスクリプトームを実行する次世代シーケンシングの最近の進歩しようし、単一細胞でゲノム解析の遺伝的モザイク実験でクローンを作成します。

これを行うには、脳内低豊富な細胞集団を選択的に分離する堅牢で効率的な手法の開発が不可欠です。以前は、FACS、によって蛹の発育中に視覚系における特定の細胞型を分離し、RNA シーケンス6を使用して彼らのトランスクリプトームを決定するためのプロトコルを開発しました。これらの実験で (例えばR7 視細胞) 特定のタイプの細胞の大半は蛍光標識しました。前記同じ種類の細胞のサブセットだけがラベル付けされて、遺伝のモザイクの実験でこのメソッドを使用して我々 は品質シーケンス データを取得するのに十分な細胞を分離できませんでした。これに対処するため、我々 は細胞解離プロトコルを改善することによって細胞の収穫を増加する求めた。

我々 のアプローチは、解離細胞の健康を最大限、解離と解離のバッファーを変更することにより細胞の健康を改善するためのプロトコルの合計の長さを減少させ、切り裂かれたティッシュの機械停止の量を減らすことだった。我々 はモザイク解析を用いた抑制型セル マーカー5 (MARCM)、野生型かの興味の遺伝子の突然変異体をある特定のセル型のクローンを蛍光標識する単一の生成を可能にする改善された議定書7をテストします。それ以外の場合をヘテロ飛ぶ。ここで、同一条件の下で私たちの以前のプロトコルは RNA シーケンスの十分な材料を生成する失敗、改良されたプロトコルに成功しました。私たちは再現性をもって高細胞収率 (標識細胞の ~ 25%) を達成するため、1,000 ほどの細胞7から高品質 RNA シーケンス データを得ます。

いくつかのプロトコルはショウジョウバエ6,8,9,10、11,12,13種類の特定のセルを隔離する以前記載されています。,14,15,16します。 これらのプロトコルは脳の中で豊富な細胞を分離、大抵。我々 のプロトコルは、その後トランスクリプトームとゲノム解析の FACS を用いた視覚システムで低豊富な細胞集団 (脳あたりより少ない 100 細胞) を分離することに最適です。このプロトコルでは、再現性をもって FACS と RNA シーケンスによる高品質トランスクリプトーム データの取得によってフライ視覚系から低豊富な細胞を分離する方法を提供を目指してください。

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プロトコル

1. 実験前に計画

  1. 実験を開始する前に遺伝学特に任意のセルのラベルに期待どおりに動作を確認するため小規模な試験を実行します。
    1. 最初のパス、使用免疫組織化学どうを光学顕微鏡と不必要なセルのラベルです。理想的には、遺伝子マーカーは、視葉 (図 3)、網膜内の特定になります。のみ視葉が細胞解離のため使用され、ので中央の脳でラベリングするの問題ではないです。同時に脳あたりラベル興味のセルの数を決定します。
    2. 遺伝のラベルがセルの純粋な人口を決定するパイロットの FACS 実験 (図 4) を行う、必要な特異性再現性をもって分離することができます、興味のセルの数を評価することができます分離それぞれの脳から。必要な場合は、濃縮を決定する定量的 pcr 法によって単離細胞の純度や特定の遺伝子の解消充実を評価します。
  2. 交配の実験のための材料の必要な量を得るために必要な数を決定します。
    メモ: は、実験の経験に基づき、蛍光に分類されたセルの ~ 17 ~ 25% がこのプロトコルで一貫して孤立した、高品質な RNA シーケンス データは 1,000 FACS 精製細胞 (より少ないセルが十分な可能性があります) から取得されます。
    1. RNA シーケンス解析の 1000 個の細胞を得るためには、脳 (視葉あたり 20 セル) あたり蛍光ラベル興味の少なくとも 40 のセルがあることを確認します。約 10 〜 脳につき興味のセルを精製する必要がありますので 100 脳を解剖します。
    2. 各実験で解剖する開発の適切な段階で ~ 100 ハエを取得するには、(これは両親の遺伝子型によって異なります) バランサーに対して選択する場合 ~ 100 十字を使用します。ハエが興味の対立遺伝子/遺伝子のホモ接合体少ない十字架が設定できます。
    3. 細胞の健康を最大化し、遺伝子発現と脳を解剖したが、これは調整することができます後に発生することができますゲノム構成する非特異的な変化を最小限に抑える 1 h に郭清のウィンドウを制限します。Dissectors、dissectors のスキルに依存 1 h で 100 の脳を解剖する必要の数を決定します。

2. 仕事を飛ぶ

注: ハエは、特に断らない限り 25 ° C ~ 50% の湿度で発生します。以下の雌の遺伝子型は遺伝子型 M として遺伝子型 F、および男性のとして示されます。

  1. 拡大株式
    1. 若いハエ (ないよりも週古い遺伝子型 F) ~ 100 バイアルおよび遺伝子型 m ~ 30 バイアルを取得します。
    2. 1 週目の木曜日に、生鮮食品に遺伝子型 F の 100 バイアルを反転します。金曜日から始まる毎日が週 2 の火曜日のバイアルを反転します。これらの 6 の反転は、処女を収集するために使用されます。また 2 週の水曜日に、生鮮食品に遺伝子型 M のハエを反転し、週 2 の金曜日に両親をクリアします。これらのバイアルは、十字架の男性を収集するために使用されます。
  2. 処女を収集
    1. 3 週目の月曜日から遺伝子型 F バイアルから処女を収集します。1 日 2-3 回を収集し、18 ° C ~ 50% の湿度で処女を格納します。これを 4 週目の火曜日まで毎日繰り返します。それらの多くは死ぬので、可能な限りできるだけ多くの処女を収集する勧め 十字架を設定する前に。通常、〜 2,500 100 を設定する収集する処女を交差させます。
  3. 十字架を設定
    1. 4 週目の金曜日に、遺伝子型 F の 15 の処女と十字架 (通常の実験あたり 100-200 十字) の指定番号と各クロスの遺伝子型 M の男性 7 名を設定します。そのまま翼を持つ若くて健康な男性を使用する非常に重要です。
    2. 十字架をフリップ日曜日から第 5 週の土曜日まで毎日。死んだハエが見つかった場合は、新鮮な処女や男性と十字架を補足します。食品の乾燥を防ぐ、だから必要に応じてバイアルを水が欠かせません。乾燥した食糧は大幅に収率を低下します。
  4. FACS の並べ替えのネガティブ コントロール
    1. 標識されている任意のセルなしネガティブ コントロールを含める FACS の並べ替え。理想的には、適切な並べ替え FACS のためゲートを設定する基底発現レポーター (UA 構造が「漏れやすい」にすることができます) を決定できるので、(例えばUA GFP) 記者が (例えばGAL4)、ドライバーないネガティブ コントロール必要があります。実験のハエと同時に陰性対照のハエを反転し、それらを同じ方法でステージします。
  5. ステージングの蛹
    1. 蛹の発育 (例えば蛹殻形成過程 【 h APF 】 後 40 h)、ステージの特定の段階で細胞を収集するには、1 時間と合わせて 1 時間タイム ウィンドウ中の蛹は解剖 (前述) を割り当てられます。FACS は細胞解離、解離後に発生しますあり ~ 40 分かかる直後に行わなければなりません。したがって、ステージングと解剖の正確な時間は、FACS の可用性によって決まります。
    2. 40 h APF で蛹を得るためには、特定の時点で 6 週目の月曜日にステージ (例えば17) 40 h 後の蛹を解剖する (例えば、水曜日 9)。優しく白い前蛹をピックアップし、予め温めておいた瓶の壁上に配置するウェット絵筆を使用します。目的遺伝子と蛹を選ぶだけ。
  6. 生物学的複製
    1. 各実験のため少なくとも 3 生物の複製を行います。簡単な方法として、同じ十字架を使用 (週 6) 同じ週に 3 回の実験を繰り返します。たとえば、火曜日と水曜日、2 番目と 3 番目の複製の蛹をそれぞれステージします。木曜日と金曜日、それぞれこれらの蛹を解剖します。

3. サンプル準備

注: このプロトコルで使われるすべての試薬は、材料表に表示されます。

  1. 解剖および組織解離のソリューションを準備します。
    1. 蛋白質分解酵素ブレンド原液を準備 (材料表参照) ddH2O 濃度 26 Wünsch ユニット (Wu) を凍結乾燥させた酵素を再構成することによって/mL。260 呉 (大きなバイアル) バイアル、バイアルに ddH2O の 10 mL を追加し、使い捨ての因数 (4.2 μ L が解離あたり必要)。-20 ° C で原液を保存します。各実験には、2 つのサンプル (否定的な制御と実験的組織) の解離が必要です。
    2. Rinaldini のソリューション (RS) と完全なシュナイダーのメディア (CSM) × 10 (月曜日の週 6) 郭清の前日を準備します。各バイナリの CSM の 5 mL と RS x 1 の約 5 mL と 5 mL の 2 サンプルの解離の CSM の準備 (負の制御と実験)。4 ° c、1 ヶ月で 10 倍の RS と週まで 4 ° C で CSM を格納します。
      1. 10 x RS の 100 mL を準備するには、NaCl、KCl、NaH2PO4NaHCO3の ddH2O 250 mL のビーカーに 100 mL のブドウ糖の 1 g は 1 g の 50 mg の 200 mg の 8 g を溶かします。フィルターは、0.22 mm のフィルターで滅菌します。
      2. DdH2チューブ O 1 mL に 20 mg の L-グルタチオンを追加します。
      3. CSM の 50 mL を準備するには、熱の 5 mL 不活性ウシ血清、10 mg/mL インスリン溶液 0.1 mL、200 mm L グルタミン ソリューション 5 mL、20 mg/mL、L グルタチオンの 12.5 μ L と (5,000 単位のペニシリンとストレプトマイシンの 5 mg ペニシリン ストレプトマイシン溶液 1 mL を追加します。/mL) 38.9 mL シュナイダーのメディアに。フィルターは、0.22 mm のフィルターで滅菌します。
      4. RS 実用的なソリューション x 1 ddH2O 10 x の RS を希釈します。各サンプルの非接着剤のチューブで 1 x rs 500 μ L を準備します。
    3. 水浴をオンにし、37 ° C の温度を設定温度計を使用して温度が正確であることを確認します。風呂の水は、パパイン活性化する前に適切な温度である必要があります。夕方朝解剖前に温度を設定することをお勧めします。
  2. 準備パパイン酵素ブレンド
    注: は、すべての解離の前に、新鮮なパパイン ソリューションを確認します。
    1. 火曜日週 6 およそ 45 分の解剖を開始する前に、4 ° C からパパイン パウダーの 1 バイアルを取得し、室温でインキュベートします。パパイン パウダーに後で追加する常温エッペン チューブの CSM もおきます。
    2. 解剖の開始前に分は、濃度が 100 単位/ml (cap) を通じて直接パパインのバイアルに室温 CSM を追加する注射器を使用 (各バイアルで粉の量はわずかに異なる; バイアル含む 123 単位追加 1.23 mCSM の L)。ミックス、最初、キャップの内側に引っかかって、粉をキャプチャするバイアルを反転し、ピペットを上下します。
    3. 水のバスで 37 ° C 水の入ったビーカーにバイアルを追加します。パパイン ソリューションのバイアルがフローティングではないことを確認します。37 ° C で 30 分間パパインをアクティブにします。
    4. 風呂の水でビーカーに、パパインを追加した後-20 ° C からタンパク質分解酵素ブレンド (26 呉/mL) の因数を取得し、室温でインキュベートします。活性化の 30 分後、室温でパパインをインキュベートします。
  3. 解剖
    1. 6 週目の火曜日に、きれいな鉗子で冷たい CSM で段階的な蛹の脳を解剖し、視葉と中央の脳の交差点をつまんで視葉を断ちます。
    2. 1 x RS (実験的組織の 1 つチューブ) と陰性対照組織用の 500 μ L を含むマイクロ チューブの下部に葉を追加します。氷の上の管を常に保ちます。
    3. 1 h でできるだけ多くの葉を解剖します。陰性対照組織 10 葉は十分です。プールは、チューブ間の転送中に組織の損失を除去するために単一のマイクロ チューブに視葉を解剖しました。
  4. 細胞解離
    1. 葉をカバーする十分を残して、P200 ピペットを使用して解剖視葉と、チューブから 1 x RS を慎重に取り外します。慎重に可能な限り小さな脳を邪魔するように、チューブの側に 1 x rs 500 μ L を追加します。氷の上の管を常に保ちます。
    2. 葉が底に沈殿させる。一度だけ、200 μ L を取るし、ミックスするうちピペット (葉を移動する必要があります)。再度解決葉をしましょう。
    3. 2 つのサンプル (実験的および否定的な制御) のための 600 μ L 分注は、マイクロ チューブに室温パパインを活性化。0.18 呉/mL の最終的な集中を取得する 600 μ L パパイン ソリューションに常温酵素ブレンドの 4.2 μ L を追加します。上下にピペッティングで混ぜます。これは、解離のソリューションです。
    4. 慎重に各サンプルから 1 x RS を削除し、葉に解離液の 300 μ L を追加します。25 ° C、チューブ thermomixer で 15 分間 1,000 rpm でサンプルをインキュベートします。
    5. 5、10 分の時間ポイントで、チューブの底に沈む葉 thermomixer せを停止します。ミックスに 200 μ L をピペットで移しなさいソリューションのかかります。
    6. 15 分後に、葉底に沈殿し、葉 (葉を邪魔しないようにしてください) から解離ソリューションを慎重に取り外しますをしましょう。
    7. 1 x RS で二回洗います。これを行うには、慎重に追加 500 μ L 1 x の RS (葉を邪魔しないようにしてください)。ミックス、軽く 200 μ L をピペットで移しなさい、マイクロ チューブに、ピペットで移しなさい。葉の底に沈むし、繰り返してみましょう。
    8. (前の手順と同じ) CSM の 500 μ L で 2 回各サンプルを洗います。
    9. 慎重に CSM を削除し、チューブに CSM の別の 200 μ L を追加します。P200 ピペットを使用してソリューションが均質になるまで、泡なし、上下ピペッティングにより組織を混乱させる (すなわち、見ることができますは、もはや組織の残党)。
    10. 氷の上 5 mL FACS チューブに 30 μ m メッシュ キャップを介して細胞懸濁液をフィルタ リング (P200 を使用し、全体の懸濁液を通過するかどうかを確認)。解離のチューブを洗浄する CSM の別の 500 μ L を追加し、FACS チューブにソリューションをフィルターします。
    11. 慎重に FACS 管の帽子を脱いで P200 とメッシュ フィルターの下にソリューションを収集し、FACS チューブの懸濁液の残りの部分に追加。サンプルは、FACS のため準備ができています。
    12. FACS 精製した細胞の準備ができてを事前に収集するためのチューブを持っていることを確認します。RNA シーケンスの RLT バッファー (換散バッファー) RNA 精製キットからの 300 μ L を含むマイクロ チューブに直接各サンプルからセルを並べ替える (1: 100 2-使用前にメルカプトエタノールを追加)。
  5. FACS の並べ替え
    注: 解離後、すぐに FACS (最大 1 時間) によってセルを並べ替えます。確認本 FACS セッションにそれに応じて実験を計画するとき。100 μ m ノズルのサイズとセルソーターは通常使用されます。
    1. 陰性対照および並べ替えを行うためのゲートを設定する実験のサンプルの細胞分布を比較します。理想的には、パイロットの FACS 実験におけるゲーティングを確立、陰性対照サンプルは確認または事前に設定されたゲートの微調整を提供します。興味のセルはよくネガティブ コントロールと実験例 (図 4) の両方に存在する背景セルからを区切る必要があります (これをパイロット実験でテスト)。
    2. 準備のコレクション チューブで並べ替えられた細胞を収集します。
  6. RNA の浄化
    1. ピペットを上下に細胞を溶解バッファー RLT の 300 μ L に直接セルを並べ替える。
    2. RNA から動物と人間の細胞を浄化を使用して総 RNA の浄化の標準プロトコルに従うを浄化キットの柱に DNA 消化7(材料の表を参照してください)。RNase フリー水の 20 μ L の RNA を溶出します。
    3. 液体窒素と-80 ° C でストアを持つ RNA サンプルを凍結します。
    4. 各実験の制御と実験条件の少なくとも 3 の複製を実行します。同時にすべてのサンプルの cDNA ライブラリを準備し、同じ技術の可変性を制御するためのフロー ・ セルですべてのサンプルを実行します。すべての RNA のサンプルの準備は、2-5 μ L (サンプルごと) にボリュームを減らすために速度 vac を使用します。

4. cDNA ライブラリの準備スマート seq2 による配列解析

注: 技術的な可変性を最小限に抑えるために、同時にすべての cDNA ライブラリを作るし、同じフロー ・ セルに順序を付けます。

  1. 濃縮された RNA の 1.5 μ L の入力を使用して、スマート seq217次の変更以外の標準的なプロトコルに従うことによって cDNA ライブラリを作る: PCR のため別の忠実度の高い PCR マスター ミックス (材料の表を参照) を使用拡大;使用、柱に PCR 精製キットの PCR の製品を浄化するために磁気ビーズの代わりに (材料の表を参照してください)。
  2. スマート seq2 プロトコルには、tagmentation 後最終的な濃縮 PCR のステップと同様、逆のトランスクリプションの後 PCR 増幅前一歩が含まれています。PCR の拡大のサイクル数は、豊富な入力材料に依存します。入力として 1,000 細胞は通常 PCR 増幅前一歩 15 サイクルと 12 サイクル最終濃縮 PCR のステップの使用にします。
  3. ライブラリのプール、1 つのフローのセル (例えば、 NextSeq プラットフォーム) に順序を付けます。

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結果

一般的な方式
プロトコルの一般的なスキームを図 1に示します。プロトコルは 3 つの主要な部分に分かれています: 作業、サンプル準備、シーケンシングおよびデータ解析を飛ぶ。わかりやすくするための一般的な方式では、プロトコルの「実験前に計画」セッションは含まれません。

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ディスカッション

このプロトコルはシンプルで、実行する技術的に困難ではないが、いくつかの重要なステップの意志を見落としている場合があります携帯電話の収量がかなり低下します。(ステップ 2.3.2。)十字架は、健康と食べ物が乾かないことが重要です。十字の定期的な散水は、ハエは、開発の適切な段階では、右の遺伝子型の郭清可能数を最大化するために不可欠です。どのくらいの頻度をまかれる?...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この研究は、賞を受賞番号 K01NS094545、神経変性疾患研究センター ・ レフラーから切り替えたの下健康の国民の協会の NINDS によって賄われていた。我々 は、貴重な会話のため石灰タンとジェイソン マキューアンを認めます。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Liberase TMRoche5401127001Proteolytic enzyme blend
NaClSigma-AldrichS3014
KClSigma-AldrichP9541
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-Aldrich S5761
GlucoseSigma-AldrichG0350500
L-GlutathioneSigma-AldrichG6013
Heat Inactivated Bovine SerumSigma-AldrichF4135
Insulin SolutionSigma-AldrichI0516
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
Penicillin-Streptomycin SolutionSigma-AldrichP4458
Schneider's Culture MediumGibco21720024
PapainWorthingtonLK003178
2-Mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250-100ML
RNeasy Micro KitQiagen74004RNA purification kit
RNase-free DNaseQiagen79254
SuperScript II Reverse TranscriptaseLife Technologies18064-014
dNTP MixLife TechnologiesR0191
MgCl2 SolutionSigma-AldrichM1028-10X1ML
Betaine SolutionSigma-AldrichB0300-1VL
RNaseOUTLife Technologies10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNew England BiolabsM0492S
MinElute PCR Purification KitQiagen28004
Nextera XT DNA Library Prepration KitIlluminaFC-131-1024
Nextera XT Index KitIlluminaFC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Bottle-Top Vacuum Filter SystemsCorningCLS431153
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000020
FACSAria Flow CytometerBD Biosciences656700
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY–401–2501

参考文献

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139 FACS RNA MARCM

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