組換え膜蛋白質のプロトンの回転率を分析するためのマイクロ寒天塩橋電極

要約

電気生理学的測定の潜在的な拡散の存在は潜在的な電極を変えることによって逆の可能性の正確な測定を妨げます。マイクロ寒天塩橋を使用すると、潜在的な拡散の影響が最小化、再構成された組換え膜タンパク質の基板回転数のより正確な測定を可能します。

要約

日には、すべての薬理学的薬剤の 50% 以上は膜タンパク質の輸送の運動論を対象します。脂質二重膜に再構成した膜のキャリア蛋白質の電気生理学的特性は強力ですが、繊細な物理化学的および薬理学的物性の評価法です。基板回転数は異なる膜タンパク質の活性の比較を可能にするユニークなパラメーターです。無k 輸送では、転基板のグラデーションは、蛋白質の基板の回転率に直接関連する膜電位を作成します。塩化銀電極を用いた電極電位を変化させるし、かなり正確な膜電位測定を妨げる、また液絡部を潜在的なと呼ばれる拡散電位が誘起されます。潜在的な拡散は、電極電位のバランスをとる塩橋によって最小化できます。この記事でマイクロ寒天塩橋は、膜形成用マイクロ ピペットを使用して電気生理学的のセットアップを改善するために設計されています。塩溶液は、アガロースの添加により安定化マイクロキャピ ラリー ピペット チップに表示され、標準電極に簡単に取り付けできます。マイクロ塩橋電極の電極電位は、基準電極と比較してより安定しています。このシステムの実装は電極電位を安定化させ、膜電位 pH 勾配による生成のより正確な測定が可能します。このシステムを用いると UCP1、UCP3 ミトコンドリア キャリアのプロトンの回転率に改めて注目しました、以前の測定値と比較しています。

概要

膜タンパク質は、すべての既知の医薬品¹の 60% までによって目標とされます。膜タンパク質の電気生理学的測定は、膜キャリア蛋白質を介した基板の無k 輸送を分析する強力ですが、繊細なツールです。一定電圧や電圧ランプのアプリケーションによる膜貫通電流変調キャリア、例えば、活性化、基板またはトランスポートによる阻害の薬理学的および物理的特性を評価することができます。速度論。特別な関心は基板回転数時間ユニットごとの膜タンパク質による転流基板の量が表示されます。様々 な膜タンパク質の動態を比較するとき、これは主要なパラメーターです。膜荷電基質の濃度勾配を確立する基板の回転数から推測される起電力を生成します。

塩化銀電極を使用すると、塩素フリー バッファーの存在は、拡散電位電極電位を変化させ、電流-電圧測定²のシフトにつながることを作成します。それは標準的な電気伝導度と能力の計測値の無視以来これらのパラメーターのいずれかが常に存在するが、電流-電圧記録 (コンダクタンス) か、一つの記録 (容量) の違いの傾きに依存します。可能性をキャンセルします。ただし、基板の輸送によって作成される逆電位の記録は潜在的な拡散によって大幅に妨げられます。したがって、逆の可能性の正確な測定のための電極電位を一定に保つあります。

2 つの方法で潜在的な拡散を最小限にできます: (i) 二重膜の存在下で基質濃度は膜の^3,4の一方の側に増加する、または (ii) の塩橋バランス電極電位⁵. 最初の方法、測定値の安定性に大きく依存します。膜を有する基板はソリューションでほぼ均等に分散まで攪拌下の基板の付加からの数分間を生き残るために。膜破裂の間、荷電分子の自由な交換によって基板グラデーションが変更し、測定が不正確に。後者のメソッドは、潜在的な拡散のバランスが、セットアップのサイズによって制限されます。小さなを実装するが、電気生理学的セットアップするミクロな範囲で塩橋の機能は⁶に挑戦します。後者の方法では、塩の溶液はマイクロキャピ ラリー ヒントに満ちているし、緩衝液に食塩水の拡散を防ぐために agarose の添加により安定化します。

このプロトコルでは、マイクロ寒天塩橋とピペット セットアップ⁷に基づいて電気生理学的設定に実装の簡単な生産を説明します。マイクロキャピ ラリー チップは、1 mol % (w/v) agarose が付いて 3 M KCl 溶液を含むし、AgCl 電極及び緩衝液をブリッジの両方に調整されます。マイクロ-塩橋の利点を表示するには、電極の潜在的なシフトの時間録音し膜電位の各種 pH 勾配でのより正確な測定します。リポソームに再構成した組換えタンパク質のモデル システムでミトコンドリア キャリア UCP1、UCP3 同様の条件の下で生産の離職率は改めて注目しました、以前結果^3,8と比較しています。

プロトコル

1. 遺伝子組換え連結を解く蛋白質 (さら) の生産と平面二重膜の形成

1. ループレヒトらによる記述で、UCP1 遺伝子組換え、UCP3 を生成します。⁹ Hilseら¹⁰
2. ベックらによって記述された従来不可欠であるプラスチック ピペットの先端に平面二重膜を形成します。⁷

2. マイクロ寒天塩橋電極の作製

1. マイクロキャピ ラリー ピペットを調整する適切な長さ (材料の表を参照) をヒントします。
   1. 空の先端でバッファーを含む先端に添付されます、スライド式キャリパーを使用してマイクロ寒天塩橋電極の長さを測定する位置をマークします。
      注意: マイクロキャピ ラリー チップはある十分な長さ測定用緩衝液を入力する必要があります。
   2. 鋭いナイフとブレード マイクロキャピ ラリー チップを切り取って、エタノールと水でカット面をきれいに。
2. 塩化銀被覆電極を準備します。
   1. 長さ約 8 cm の銀線を切断し、エタノールと水でそれをきれいに。
   2. サンドペーパーの部分を取り、塩溶液に接触するはず、ワイヤーの端に 1 cm の表面を滑らかに。
   3. 平滑端を 3 M KCl 水溶液に浸し、10 の 1.5 V で DC 電源を使用して塩化物の電気化学的コート s。
   4. 水で電極をきれい、乾燥させ、およびマイクロキャピ ラリー チップを可能な限り深く浸透してコーティングされていない側から塩化銀電極の長さを調整します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
3. 1% (v/v) agarose が付いて 3 M KCl 塩溶液を準備します。
   1. KCl の 4.47 g を量り、フラスコの攪拌で 20 mL の水に溶かします。
   2. かくはんを取り外して、アガロースの 0.2 g を量り、フラスコに追加。
   3. Agarose を溶かし、凝固を防ぐに 100 ° C の解決策を熱する。
      注意: フラスコは非常に高温になります。素手でそれを触れないでください。処理のため手袋を使用します。
4. マイクロキャピ ラリー チップをアガロース溶液で満たしなさい。
   注意: ソリューションは、暑いです。手と水しぶきを避けるために注意深く作業を保護します。
   1. Agarose 起動凝固する場合熱再び agarose を溶かし完全に食塩。
   2. マイクロキャピ ラリー チップに寒天塩液の 10 μ L を浸します。それをしっぽりし、慎重に先端で気泡の空気を避けるために。
   3. ピペットから先端を外し、先端のより広範な側面から塩化銀電極でプッシュします。塩の溶液を電極に浸透を確保します。
   4. 部屋の温度に電極を冷却、アンプに差し込みます。
5. 測定用バッファーを準備します。
   1. その₄MES の 0.195 g ナ₂の 0.710 g を量り、0.121 g のトリス、0.023 g グリコールエーテルジアミン四酢酸、100 mL の蒸留水をビーカーに追加し、ソリューションをかき混ぜます。
   2. PH 電極を使用してバッファーの pH 値を確認し、7.32 に pH 値を調整します。
   3. 参照電極と寒天塩橋電極では、電気的接触を確認してください。
      1. プラスチック製の容器に 1 mL のバッファーを追加します。
      2. 参照電極と寒天塩橋電極ディップし、信号の応答を確認してください。信号応答が正しい場合は、2.7 の手順に進みます。
6. まったく偽信号応答または電気的接触がある場合、は、次のトラブルシューティングを実行します。
   1. 塩溶液との接触電極が確認してくださいし、溶液に電極をプッシュします。
      注: ソリューションは、あまりにも粘着が既にいる場合、マイクロ寒天塩橋を取り外して、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。
   2. 塩の溶液内の空気の泡があるか確認してください。Yes の場合、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。
   3. 塩溶液緩衝液との接触が確認してください。されていない場合は、別 1 mm の先端の管端を切断します。
      注意: 先端はバッファーを含むヒントを貫通する十分な長さではまだされていることを必ずです。まだ接触がない場合は、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。
   4. 上記の手順が役立つ場合は、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。
7. ストレージの 3 M KCl 水溶液に寒天塩橋電極を浸し。
   注: プロトコルをここで停止することができます。一時停止のため一晩、4 ° C で 3 M KCl 塩溶液に電極を格納します。
8. バッファーを含むプラスチック チップを準備します。
   注: 電極が一晩保存、する場合それを取り出し、それまで室温で 30 分間熱。
   1. マイクロキャピ ラリー チップを取るし、電熱線を使用して約 90 度、狭い部分の端から 2 cm のチューブを曲げます。
   2. 非常に鋭いナイフや刃を使用し、管の曲がり部から約 5 mm を切断します。
   3. エタノールと水で最後に表面をきれいにし、先端の穴の直径を測定します。このことから、画面の領域を計算します。
   4. 85:15 (v): ヘキサン: ヘキサデカンで先端の表面をコートします。
      1. 溶媒の 3 μ L をピペット、先端から取り外します。
      2. 先端における残留溶媒のすべてが蒸発したように 1 分の待機します。
   5. バッファーの 3 μ L で測定チップを埋める、塩橋電極上に差し込みます。
      注: は、2.5.3 のステップを実行することで電気的接触、塩橋電極と参照電極場合もう一度確認します。
   6. 電気的接触がない場合は、次のチェックします。
      1. 塩橋電極が緩衝液との接触はあるかどうかを確認します。そうでない場合は、どちらかは先端でバッファーのボリュームを増加したりより長いマイクロキャピ ラリー ヒントを準備します。
      2. 空気の泡のマイクロ塩橋電極から先端を削除、ヒントでは、バッファーを補充、電極に再びそれをプラグインがある場合。

3. 組換えタンパク質再構成膜の電気的パラメーターの測定

1. 三角形の交互になる電圧信号を適用最大電圧 U_max = 50 mV と ΔT_ランプ= 50 ms は、長方形の交流電流応答を作成します。正と負の電流 (I₊と私は_-) の平均値から次の式によると膜の容量を計算します。
   
2. -50 に至る電圧ランプを適用 mV +50 mV と現在のレコードにします。-斜面はコンダクタンス - データを線形関数をフィットし、フィットの x 軸の交点を計算します。
3. プラスチックの先端ソリューションを放電増加基板濃度バッファーで新しいものを記入してください。
   1. 最初の 20-30 s 内膜が形成されない、ボリュームを排出し、それを補充します。膜間の濃度勾配は膜形成中に大きく変わらないことが保証されます。
   2. 膜の形成後 3.1 と 3.2 もう一度適切な膜の形成を確認して x 軸の交点を得るための手順に従います。

4. 基板回転率の計算

注: 詳細^3、7の前の作業を参照してください。

1. 脂質・ タンパク質 (M_脂質および M_蛋白質)、膜の 1 つの脂質ヘッド グループ (_膜脂質) のエリアあたり蛋白質の質量比の分子の固まりから膜タンパク質の量を見積もる脂質 (r)。
   
2. ネルンストの運ばれた基板の可能性を計算します。R はガス定数、T 温度、z 輸送基質、F ファラデーの定数、および c の電荷₁と c₂の基板、膜の両側の濃度。
   
3. 電流電圧の録音から取る逆潜在的な基板勾配の有無で線形フィットから x 軸の交差ポイントの差で計算されます。
4. ネルンストの潜在的な¹¹の逆の可能性の比率によって基板コンダクタンス、G_基板、総膜コンダクタンス、G_合計の割合を計算します。
   
5. 基板回転数 ΔN を計算_基板基板コンダクタンス (G_基板)、印加電圧 U、および基板 z: の電荷から時間単位 ΔT 単位
   
6. 輸送基質タンパク質の数時間ごとの比率、売り上げ高率 κ を算出します。
   

結果

潜在的な拡散の最小化を確認するには、そのまま膜の電流-電圧測定の安定性を測定しました。図 2A、代表電流電圧の録音は存在 (白ドット) と pH 勾配の不在 (ブラック ドット) で描かれています。ネルンストの同等化に従って pH 勾配は、電圧の変化を誘導します。データを線形フィットの x 軸の交点から潜在的なシフトが計算されます。両方の電極をテストするために標準 AgCl 電極 (図 2B; 白ドット) とマイクロ寒天塩橋 (図 2B; 黒ドット) の x 軸の交点にシフトを行った。電圧ランプは行で 10 倍を記録した、時間に対して x 軸の平均値シフトが描かれています。測定、標準電極の 300 秒後にも mV が 30 までを様々 な寒天塩橋電極未満 5 の最大の変化があったに対し予期しない、ランダム、動作の mV。

次に、両電極が異なる pH 勾配 (図 3A) でテストされました。標準的な電極の 0.35 と 1.0 (白ドット) の pH 勾配が生成されました。寒天塩橋電極、0.35、0.7、および 1.0 (ブラック ドット) の pH 勾配。潜在的なシフトは、3 つの独立した測定で解析しました。どこのみ測定されたシフトが若干異なります、0.35 のグラデーションと対照をなして電圧シフトを大幅マイクロ寒天塩橋の不在で 1.0 の pH 勾配に変更します。データを線形フィット、関数の傾きは 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH 標準電極と 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH マイクロ寒天塩橋電極用。ネルンストの同等化に従って計算される潜在的なシフトは 60.7 mV/ΔpH t = 32 ° C

マイクロ寒天塩橋、プロトンの回転数を使用してミトコンドリア UCP1 の UCP3 κ は測定し、以前の計測結果 (図 3B) 比較されました。図 3はΔpH のような = 1.0 が生成され、逆のポテンシャルを測定しました。膜タンパク質の量が 4 μ g 脂質比蛋白質とプロトコルのセクション 4 の数式によると推定された/(脂質の mg)、蛋白質と脂質、3.53 × 10^{の膜面積 33,000、および 750 の Da の分子量-4} cm²、および脂質 7.8 × 10^-15 cm²の面積。UCP1 と、UCP3 κwas 5.56 ± 0.38 の^-1と 4.10 ± 0.71 の^-1をそれぞれ得られる (図 3B)。

図 1: マイクロ寒天塩橋と電気生理学的設定します。(A) このパネル セットアップのスケッチを示しています。(オレンジで示されて) 寒天培地の食塩を含むマイクロキャピ ラリー チップは、(青) (黒) の電極とバッファーを含むヒントの配置されます。(矢印で示される) バッファーを含むヒントの最後に表面に膜が形成されます。(B) このパネルは、マイクロ寒天塩橋の実装と電気生理学的設定のイメージを示しています。矢印は、電極、マイクロ寒天塩橋、参照電極および緩衝液とコンテナーをポイントします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: マイクロ寒天塩橋と標準塩化銀電極の比較。(A) このパネル番組代表の電流-電圧測定 (グレー ドット) の存在と 1 の pH 勾配の不在 (白ドット)。行は、どの電気伝導度と x 軸の交点値を取得データを線形フィットを表します。両方の録音の交点の値の違いによる電圧シフトの評価します。(B) このパネルは、時間でマイクロ寒天塩橋電極 (ブラック ドット) に標準の AgCl 電極 (白ドット) の潜在的な膜のシフトを示しています。連続で 10 電流-電圧測定を記録し、潜在的な拡散によって平均電圧シフトは時間に対してプロットされます。すべての実験で 45:45:10 mol %15 mol % アラキドン酸 1.5 mg/mL の濃度で再構成した DOPC:DOPE:CL の膜をしました。バッファー含まれる 50 mM Na₂SO₄、10 mM MES、トリス、10 mM と 0.6 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 ph = 7.34 および T = 32 ° Cこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: UCP1、UCP3 のプロトン回転数 pH 勾配の存在下で逆の可能性から計算します。(A) このパネル標準 AgCl 電極 (白ドット) とマイクロ寒天塩橋電極 (ブラック ドット) の様々 な pH 勾配の UCP1 を含む膜の潜在性のシフトを示しています。行は、データへの線形フィットを表します。(B) このパネルは、UCP1 のプロトンの回転数を示しています (最初のデータ セット)、UCP3 (2 番目のデータ セット) プロトコルのセクション 4 の数式によるとネルンストの潜在的な電圧シフトの比から計算した結果。各セットの最初のバーは、マイクロ寒天塩橋で測定した離職率を表します。各データ セットの 2 番目のバーは、標準の塩化銀電極を用いた以前の計測結果を表します。UCP1 と UCP3 の値は、Urbankovaらから撮影されました。³ Macherら⁸. 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL 15 mol %aa と UCP1/UCP3 再構成のすべての測定で膜が作られました。脂質とタンパク質の濃度は 1.5 mg/mL と脂質、4 μ g/mg であった。バッファー含まれる 50 mM Na₂SO₄、10 mM MES、トリス、10 mM と 0.6 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 ph = 7.34 および T = 32 ° C勾配の測定用バッファーの pH は 7.66、8.00、または 8.33 トリスを追加することによって増加したし、ソリューションを含むピペットで変更されました。値は、3 つの独立した測定の平均 ± 標準偏差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

電極を用いたマイクロ寒天塩橋の実装はその拡散の可能性を最小限に抑え、膜電位 pH 勾配による生成のより正確な測定が可能します。様々 な膜貫通 pH 勾配の存在下で両電極の潜在的なシフトが ΔpH で受け入れられた潜在的なネルンストの平衡の理論値と比較するとき、0.35 を = (Φ_{ネルンスト}= 23.8 ΔpH の mV = 0.4)。しかしより多くの生理学的 pH 勾配として ΔpH で潜在的なシフトを正確に測定するミトコンドリア マトリックスと間部の標準の塩化銀電極間のインスタンスが失敗した = 1 (図 3A)。マイクロ寒天塩架橋電極は配信が多く理論に匹敵する値です。

潜在的な拡散が塩化銀参照電極で発生するは、緩衝液が実験中に変更された場合も可能性があります。塩素フリーの緩衝液は、塩化物イオンを輸送する脱共役蛋白質が示唆されたので pH はトリスや MES を使用して調整された実験で使用されました。電極電位、塩化物の相当な濃度の不在では主に緩衝溶液に塩化物の不純物に依存します。実験中にその組成が変更されない、単に定数オフセット電位になります。ただし、絶対 2 つの電極電位差の測定、簡単な寒天塩橋システム (銀/塩化銀 3 M KCl) される可能性がありますも参照電極用。

マイクロ寒天塩橋は、電極電位の平衡化して潜在的な拡散を分散します。塩の溶液を安定させるために 1% (w/v) アガロースは緩衝液の塩溶液の混合を防ぐために追加されました。K⁺と^-の Cl 塩イオン液体に似たような移動があるし、電極電位のバランスをとる。塩橋を正しくインストールするには、寒天培地の食塩水は空気の泡なしマイクロキャピ ラリー チップを充填し、塩化銀電極をカバーする十分な熱されるしています。さらに使用の前に、塩橋の電極と参照電極間の電気接触がチェックします。塩橋の使用時間に応じて塩溶液は、バッファーと塩溶液の混合を防ぐために十分にゼリー状になることとあります。これは K⁺または Cl^-トランスポーターを調査した場合に特に重要です。塩橋は非常に短い時間のために使用された、アガロースの溶出はこの時間範囲でごくわずか。寒天や寒天 (3%-5%)、5% までの高濃度は、長い期間時間^6,12の塩橋を使用できます。

このメソッドは、(i) 低離職率と膜トランスポーターと (ii) 標準パッチ クランプ セットアップ¹³で調べることができますほとんど内膜ミトコンドリア蛋白質の輸送速度を決定することができます。その精度はどの精度が低い合計膜コンダクタンスと記録のノイズ下潜在的な膜を誘発する小型の濃度勾配で減少、逆電位測定に主に依存しています。

この設定を使用すると、UCP1 と UCP3 同じ条件の下で生産の離職率を測定しました。高い pH 勾配による取得率はより正確なマイナーな電極の潜在的なシフトに起因する工芸品によってと思われます。さらに分析し、同様の条件で生成されるミトコンドリア膜輸送体を比較に使用できます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microloader tips	Eppendorf	5242956.003	Microcapillary pipette tip
Ethanol 99%	AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H	AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid	Carl Roth GmbH + Co. Kg	6781.3
DC supply	Voltcraft	V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3810.2
Patch Clamp Amplifier	Heka
Sample tube	Carl Roth GmbH + Co. Kg	5863.1
Na2SO4	Carl Roth GmbH + Co. Kg	8560.3
MES	Carl Roth GmbH + Co. Kg	4256.2
TRIS	Carl Roth GmbH + Co. Kg	AE15.2
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3054.1
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-100ML
Hexadecane	Sigma-Aldrich	296317-100ML
Heating wire	Voltcraft	USPS-2250