コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造

要約

この記事で私たちはコナガ (コナガ) からリアノジン受容体の N 末端ドメインの蛋白質の発現、精製、結晶化、構造決定のプロトコルを説明します。

要約

強力かつ効率的な農薬の昆虫リアノジン受容体 (RyRs) をターゲットとして開発されている農業害虫コントロールの領域に大きな関心。日付、著者殺虫 RyRs が製品化されている害虫を対象、20 億ドルの年間売り上げ高を生成します。RyR を対象とした殺虫剤の作用のモードの理解は昆虫 RyR に関する構造情報の不足によって制限されます。これは順番の害虫に殺虫剤抵抗性の発達の理解を制限します。コナガ (DBM) は、著者の殺虫剤に抵抗性を示すことも報告されている世界、アブラナ科作物を破壊する壊滅的な害虫です。したがって、それは DBM RyR、特に伝統的な著者の結合部位とは異なる地域をターゲットをターゲット新しい殺虫剤を開発する非常に実用的な重要なのです。構造的に特徴付ける DBM から RyR の N 末端ドメイン プロトコルを紹介します。X 線結晶構造の解像度で分子の交換によって解決された Å、2.84 のベータ トレフォイル折りたたみモチーフと並ぶ α ヘリックスを示しています。このプロトコルは一般的に式、浄化および他のドメインまたは蛋白質の構造解析の合わせることができます。

概要

リアノジン受容体 (RyRs) は、特定のイオン チャンネルは、筋細胞の筋小胞体 (SR) 膜を渡る Ca^{2 +}イオンの透過を仲介します。したがって、彼らはプロセスを結合励起収縮に重要な役割を果たします。その機能の形で RyR 分子質量とホモ四量体としてアセンブル > 2 MDa、各サブユニットから成る 〜 5000 アミノ酸残基と。哺乳類では、3 つのアイソ フォーム: RyR1 - 骨格筋型、RyR2-心筋型および RyR3-普遍的組織¹で表されます。

昆虫は、筋肉や神経組織²で表現される RyR の 1 種類のみです。昆虫 RyR は約 47% のシーケンス id を持つ哺乳類 RyR2 に似て³。RyR 鱗翅目や鞘翅目のターゲット著者殺虫剤を開発し、バイエル (フルベンジアミド)、デュポン (chlorantraniliprole)、シンジェンタ (cyantraniliprole) のような主要な企業によって販売されています。比較的最近の発売以来、著者殺虫剤は殺虫剤の急成長しているクラスの一つなっています。現在、これらの 3 つの殺虫剤は年間の売り上げ高は、2009 年 (Agranova) 以来 50% 以上の成長率で 20 億米ドルを越えています。

最近の研究では、これら殺虫剤^4,5,6,7,8の使用法の数世代後の昆虫の抵抗の開発を報告しています。抵抗膜貫通ドメインの変異 RyRs コナガ (DBM)、コナガ(G4946E、I4790M) およびトマト マメハモグリバエに対応する位置から、このトゥタ(G4903E、I4746M) 領域を表示します。この地域はチャネル^4,8,9のゲートのために重要であること知られている著者の殺虫剤の結合に関与するかもしれない。この分野で広範な研究にもかかわらず著者殺虫剤の正確な分子メカニズムはとらえどころのないままです。また、耐性変異がジアミドとの相互作用に影響するかどうか、直接またはアロステリックはクリアです。

以前の研究は、哺乳類からいくつかの RyR ドメインの構造と x 線結晶構造解析と電子顕微鏡で、それぞれ^{10、11、フルレングスの哺乳類 RyR1 と RyR2 の構造を報告しています。 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}.しかし、これまでのところ、昆虫 RyR の構造が報告されていない、受容体機能の分子の複雑さと同様、殺虫剤作用分子機序と殺虫剤抵抗性の発達を理解することから私たちを禁止します。

本稿では、コナガ、アブラナ科作物の世界²²に感染する破壊的な害虫からリアノジン受容体の N 末端 β トレフォイル ドメインの構造特性の一般化されたプロトコルを提案する.公開されたウサギ RyR1 NTD 結晶構造^23,24と低温電子顕微鏡構造モデル^16,17,18,19,によると設計された構造^20,21。 これは最初の高分解能構造昆虫 RyR チャネルの開閉機構を明らかにし、構造基づかせていた薬剤の設計を使用して特異的殺虫剤の開発の重要なテンプレートが提供するために報告します。構造解明のため近くの原子分解能での蛋白質の構造の決定の「ゴールド スタンダード」として考慮される x 線結晶解析を採用。結晶化プロセスは予測不可能な労働集約的なこのステップバイ ステップのプロトコルはエクスプレス、浄化し、一般的に昆虫 RyR または他の蛋白質の他のドメインを特徴づける研究者に役立ちます。

プロトコル

1. 遺伝子クローニング、タンパク質の発現と精製

1. PCR の興味の蛋白質に対応する DNA を増幅 (DBM RyR、Genbank の残留 1 205 なし準拠。AFW97408) と結紮独立クローン (LIC)²⁵ペット 28 a HMT ベクターにクローン。このベクトルには、ヒスチジンの札には、MBP タグには N 末端の TEV プロテアーゼ切断部位が含まれています¹⁵ 。
   1. LIC LIC 互換 5' 拡張子を持つターゲット遺伝子の増幅用プライマーを設計します。
      LIC プライマーを転送します。
      5 ' 3' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG
      逆 LIC 入門:
      5 ' 3' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC
   2. 反応コンポーネント (50 μ L) を組み合わせて: テンプレート DNA (100 ng/μ L)、前方のプライマー (10 μ M)、逆プライマー (10 μ M)、0.5 μ L の DNA ポリメラーゼ (NEB) 10 倍反応の 5 μ L の 1 μ L の 1 μ L の 1 μ L バッファー、dNTP (25 mM) の 1 μ L、RNase の 40.5 μ L 無料 ddH₂o.
      1. PCR マシンで反応混合物を置き、次のプログラムを実行します。
      2. 95 の ° C、3 分間インキュベートし、30 サイクルを実行 (95 ° C、30 s、58 ° C、15 秒、1 分の 72 ° C)。72 ° c 5 分間インキュベートし、4 ° C で押し
      3. 2% の agarose のゲルの全体反応混合物 (50 μ L) を実行し、ゲルの抽出キットを抽出します。製造元のプロトコルに従ってください。
   3. 結紮独立クローン (LIC)
      1. SspI 消化 (60 μ L) を実行: ベクトル DNA の 20 μ L (50 ng/μ L)、6 μ L 反応バッファー、SspI の 4 μ L、ddH₂o. 全体の反作用を実行 3 h の 37 ° C に加温の 30 μ L x 10 の 1% アガロースゲルのミックスし、ゲルの抽出キットを抽出します。製造元のプロトコルに従ってください。
      2. ベクターの処理を T4 DNA ポリメラーゼ、DNA を挿入します。次の結合: ベクトルまたは挿入 DNA の 5 μ L (50 ng/μ L)、10 x T4 DNA ポリメラーゼ バッファー、ベクター、挿入 DNA、地デジ (100 mM)、0.4 μ L (LIC 修飾) T4 DNA ポリメラーゼの 1 μ L の dCTP (25 mM) の 1 μ L dGTP (25 mM) の 1 μ L の 2 μ L、および 75 ° C、20 分、40 分の熱不活化酵素の常温 ddH₂O. 加温反応の 9.6 μ L。
         注: 別の反応に LIC ベクター、挿入 DNA を扱われなければなりません。
      3. アニーリング反応 LIC を実行します。次の結合: T4 扱われる挿入 DNA、T4 扱わ LIC の 2 μ L の 2 μ L のベクトル DNA。10 分間室温で反応を孵化させなさい。
2. BL21 を変換この組換えプラスミド (DE3)エシェリヒア属大腸菌のセル。
   1. 氷の上の有能なセル (マイクロ遠心チューブに 50 μ L) を解凍します。
   2. 約 1 μ L を追加 (50 ng) 管にプラスミッドの。優しくフリック チューブに 2-3 回移動し細胞および DNA をミックスします。20 分間氷の上管を配置します。
   3. 40 s. 場所追加 1 mL のチューブに室温 LB 培地 2 分にもう一度氷の上管の 42 ° C で衝撃を熱します。
   4. 45 分の 37 ° C で 250 rpm シェーカーに混合管の場所は広がる選択の版の上に混合物の 150-200 μ L です。プレートを反転し、37 ° C で一晩インキュベート
3. 単一コロニー文化一晩 37 ° C で 50 μ g/mL カナマイシンを含む 100 mL 2YT 培地で細胞をピックアップします。次の朝、一晩かけて培養 10 mL で 50 μ g/mL カナマイシンを含む 1 L 2YT 培地に接種、外径 φ₆₀₀まで 0.6 〜 250 rpm で 37 ° C シェーカー インキュベーターで孵化させなさい。その後最終濃度 0.4 mM の IPTG と文化を誘導し、30 ° C で別の 5 h の成長
4. 4 ° C で 10 分間 8,000 × gで遠心分離によって細胞を収穫、細胞を収集し、40 mL の溶解バッファー (10 mM HEPES pH 7.4 では、250 mM KCl、10 mM β-メルカプトエタノール、25 μ g/mL リゾチーム、25 μ g/mL DNase すべて 10 g 細胞を再懸濁します、1 mM PMSF)。
   1. 1 と 8 分のための 65% 振幅で sonication によって混乱させる s オフに 1 秒。4 ° C で 30 分間 40,000 × gで遠心分離によって細胞の残骸を削除します。0.22 μ m のフィルターを通過して上清をフィルターし、サンプル ループを読み込みます。
5. 融合蛋白質を浄化する、タグの切断、再ターゲット蛋白質を浄化します。
   1. Ni NTA 列を使用して融合蛋白質を浄化する (結合バッファー: 10 mM HEPES pH 7.4 では、250 mM KCl; 溶出バッファー: 10 mM HEPES pH 7.4 では、250 mM KCl、500 mM のイミダゾール) 20-250 mM のイミダゾールの線形グラデーションでの浄化システムで浄化して。
   2. TEV プロテアーゼ溶出ターゲット蛋白質を切断 (1:50 比) 4 ° C でオーバー ナイト
   3. アミロース樹脂カラムを使用して胸の谷間の反応混合物を浄化する (結合バッファー: 10 mM HEPES pH 7.4 では、250 mM KCl; 溶出バッファー: 10 mM HEPES pH 7.4 では、250 mM 10 mM マルトース KCl) とタグを取り外して、TEV プロテアーゼに Ni NTA 列。ターゲット蛋白質はこれらの 2 つの列の通過割合になります。
   4. Dialyze 透析バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.8, 50 mM KCl、塩濃度を削減する 10 mM β-メルカプトエタノールに対してサンプル。陰イオン交換カラムのサンプルを浄化 (結合バッファー: 10 mM トリス塩酸 pH 8.8, 10 mM β-メルカプトエタノール; 溶出バッファー: 10 mM トリス塩酸 pH 8.8, 1 M の KCl、10 mM β-メルカプトエタノール) 20-500 mM KCl 溶出バッファーの線形グラデーションで。
   5. 精製プロセスの最後のステップとして遠心濃縮器 (MWCO 10 kDa) を使用して蛋白質を集中し、均一性を確認する Superdex 200 26/600 ゲルろ過カラムに注入します。
6. 蛋白質の純度を調べるには、15 %sds のページで実行します。
   注:すべての列をバインド 2 mL/min の流量と 1 mL/分でゲルろ過を除いて 4 mL/分の溶出流量タンパク質精製システムで実行しています。

2. タンパク質合成と結晶化

1. 10 mg/ml-80 ° C で保存する前に遠心濃縮器 (MWCO 10 kDa) と結晶化バッファーにバッファー交換を使用して浄化された蛋白質のサンプルを集中します。
2. 結晶化スクリーニングを実行 (1:1 の比率、200 の蛋白質および 200 nL 貯留層バッファーの nL) 座ってリキッドハンド リング 96-well フォーマットにおけるロボット システムを使用していくつかの結晶化キットで 295 k の蒸気拡散法を破棄しています。
   注:我々 は分子の大きさとハンプトンの研究からキットを使用し、グリフォン自動液体ハンドリング システム。
3. 蒸発を防止し、貯留層バッファーと蛋白質の低下の平衡 96 ウェルの結晶化プレートをシールします。18 ° C で結晶のインキュベーターでプレートを保つ
4. 結晶の形成と成長を監視するための光学顕微鏡を用いて定期的に 96 ウェルのプレートを確認します。
5. 塩の結晶からタンパク質結晶を区別するため、タンパク質染料を使用します。ターゲットのドロップに色素の 1 μ L を追加します。約 1 時間待って、顕微鏡下で観察します。タンパク質結晶が青くなります。
6. 肯定的な結晶化条件 (硫酸アンモニウム 1.5 M、0.1 M トリス pH 8.0) を使用して、ぶら下げを使用して結晶をさらに最適化ドロップ蒸気拡散法 24 ウェルのプレート。
   1. PH 7.0 8.5 0.5 pH 単位間隔にすべてのステップを最適化します。1.2 M から 1.7 m の硫酸アンモニウムの濃度 0.1 M 間隔ですべてのステップを最適化します。(ここで大きな板状結晶を製造する最高の条件だった 0.1 M HEPES pH 7.0 と 1.6 M 硫酸アンモニウム)

3. 結晶のマウント、x 線データ コレクション、および構造決定

1. Cryoloop の結晶とフラッシュのクールな液体窒素の低温耐性 20% グリセロールを含む貯留層ソリューションを使用してマウントします。保管および輸送用の unipuck に結晶を配置します。
2. 中古リガク社内 x 線 diffractor を用いたタンパク質結晶を画面します。(私たちのデータセットは上海放射光施設で BL17U1 から収集された) 放射光施設データ収集のため、最高の解像度で最高のものを選択します。
   1. ビームライン制御ソフトウェア BluIce²⁶を使用してマウントし、自動または手動のセンタリング機能で結晶の中心します。開始角度、露出時間、検出器距離、フレームの幅と番号を含むデータ収集戦略を決定するテストのエクスポー ジャーを実行します。
   2. データセットをそれに応じて収集 (露出時間 1 秒、1 ° フレーム幅 350 mm の検出器距離と 180 フレームを集めました)。
3. インデックス、統合 HKL2000 スイート²⁷を使用してデータセットを拡張します。まず回折スポットを見つけるピーク検索機能を遂行しスポットをインデックスし、右側のスペース グループを選択します。ピーク統合後適切なエラー モデルを持つデータセットをスケールし、出力 .sca ファイルを保存します。
4. フェニックス²⁹フェイザー²⁸を使用して分子の交換によって位相問題を解決します。
   1. Xtriage³⁰非対称単位中のタンパク質分子の可能なコピー数を計算します。
   2. 高いシーケンスの id と構造の類似性文学または Phyre2³¹など構造予測サーバによって生成されたモデルから知られている構造を用いた標的タンパク質として適切な構造のテンプレートを検索 (RyR1 NTD のウサギを用いて、検索モデル、PDB ID 2XOA)。
   3. フェイザー回折データ ファイル、テンプレート構造体ファイルおよび蛋白質シーケンス ファイルを使用して、解決策を見つけるを実行します。
5. フェニックス²⁹フェイザーから出力ファイルとターゲット蛋白質からシーケンス ファイルを使用して、初期モデルを生成するために毎晩³²を実行します。
6. 手動でオオバン³³を使用して変更された実験的電子密度に構造を構築し、反復的なサイクルで phenix.refine³⁴を使用して絞り込みます。
7. フェニックス¹⁸の検証ツールを使用して最終的なモデルを検証します。

結果

浄化

DBM RyR の N 末端ドメインは、hexahistidine タグ、MBP タグ TEV プロテアーゼ切断部位との融合蛋白質として表現されました。我々 は、結晶化の目的に適した高純度のタンパク質を得るために 5 つのステップ浄化戦略を追った。最初は、融合タンパク質は、Ni NTA 列 (HisTrap HP) によって細胞ライセートの可溶性画分から精製した...

ディスカッション

本稿では recombinantly エクスプレス、浄化、結晶化、DBM RyR NTD の構造を決定する手順をについて説明します。結晶化の重要な要件は、高溶解性、純度、均一性タンパク質を得ることです。プロトコル、hexahistidine タグとより高い倍純度を取得する浄化に利用できるどちらの MBP タグが含まれているペット 28 a HMT ベクターを使用にしました。さらに、MBP タグがターゲット蛋白質の溶解度で補助さ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37