小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

要約

ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA を提供できます。

要約

免疫応答の調節に重要な役割のためマクロファージは集中的な研究の対象とされている継続的に、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの多くの疾患で有望な治療上のターゲットを表します。プローブおよびマクロファージ機能を操作する任意の貴重なアプローチは、RNAi による遺伝子サイレンシングただし、マクロファージ siRNA トランスフェクションが頻繁に技術的に挑戦すると考慮し、現時点では、マクロファージに siRNA に専念ほとんど方法論 。ここでは、大食細胞への siRNA のターゲット配信の手段としてポリエチレンイミン被覆された超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (PEI SPIONs) を使用してのプロトコルを提案する.プリンスエド ワード島 SPIONs は、バインドおよび Fe: siRNA の重量比が 4 になったら完全に siRNA を凝縮、上記が可能です。生体外で、これらのナノ粒子が効率的に提供 siRNA プライマリ マクロファージとマクロファージのような未加工 264.7 のセル行の transfection のため最適な用量での妥協のセル実行可能性なしに、最終的には、彼らを誘導します。siRNA を介したターゲット遺伝子の沈黙。体外siRNA トランスフェクションに使用されている、離れて PEI SPIONs、また体内のマクロファージに siRNA を配信する有望なツールです。その磁気特性と遺伝子サイレンシングの能力の機能の組み合わせの観点から全身投与のペイ-スパイ/siRNA 粒子は、マクロファージの機能を調節するのみならず、マクロファージをイメージして追跡を有効にするを期待されています。PEI SPIONs が大食細胞への siRNA 配信簡単、安全、かつ効果的 nonviral プラットフォームを表します本質的の in vitroとin vivoの両方。

概要

マクロファージは、さまざまな量とはいえ体のすべての組織に分布する自然免疫系細胞の種類です。様々 なサイトカインや他のメディエーターを生産することによって、彼らは、微生物病原体の侵入に対する生体防御、損傷組織の修復、¹組織の恒常性を維持するために重要な役割を果たします。その重要性のためマクロファージ継続的に集中的な研究の対象とされています。しかし、にもかかわらずその、遺伝子機能研究の有病率、siRNA による遺伝子サイレンシングはためマクロファージでは成功しにくいこれらの細胞、特に、プライマリ マクロファージ-transfect に困難が多い。これは毒性細胞膜は化学的に最もよく確立されたトランスフェクション アプローチに関連付けられている時 (例えばポリマーと脂質) の比較的高度に起因することができますまたは物理的に (例えば、電気穿孔法によると遺伝子銃) 中断 siRNA 分子マクロファージの生存率^2,3を大幅に削減、膜を通過させる。さらに、マクロファージが専用食細胞分解酵素が豊富です。これらの酵素は、siRNA、特定遺伝子の siRNA は、細胞^3,4に配信されている場合でも、その沈黙の効率を弱体化の整合性を損なうことができます。したがって、効果的なマクロファージ標的 siRNA 送達は配信⁴整合性および siRNA の安定性を保護する必要があります。

ますます機能不全マクロファージが開始し、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの特定の一般的な臨床疾患の進行に関与していることは明らかです。このためと、例えば、siRNA、マクロファージの機能を調節することは、これら疾患^5,6,7を治療するための魅力的な方法論として発展しています。多くの進歩を遂げて、siRNA を用いた治療戦略の主要な挑戦は全身投与の siRNA とマクロファージは、望ましくない副作用につながる不十分な siRNA 吸収の悪い細胞の特異性。最適な細胞選択性に乏しいし、頻繁にオフ対象薬物ロードのナノ粒子 (NPs)、細網内皮系によってキャプチャされるの彼らの自発的な傾向により、副作用につながる無料核酸治療薬と比較してください。大食細胞は生体内で、最小限の副作用⁸と治療効果の向上を可能にする、受動的ターゲティングを設計することができます。無機ナノキャリア、様々 なリポソームや高分子⁹現在 NPs RNA 分子の配信のために探検が含まれます。その中でも、ポリエチレンイミン (PEI)、カチオン性高分子結合し、安定した NPs に核酸を凝縮できるのタイプは容量^9,10を提供する最高の RNA を示しています。PEI は、核酸の酵素的及び非酵素的分解を防ぐ、セル膜を渡る彼らの転送を仲介する、自分の細胞内放出を促進します。当初 DNA 配信試薬として導入されたが、プリンスエド ワード島その後体内siRNA 配信、いずれかのローカルまたは全身^9,10の魅力的なプラットフォームとなることを示した。

超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPIONs) は、生物医学、その磁気特性、生体適合性、生物学的に重要なオブジェクト、高表面面積、体積比に匹敵するサイズのために偉大な約束を示していると容易に適応病原体の添付ファイル¹¹面。例えば、造影剤とマクロファージによる急速な吸収としてその潜在的なユーティリティのため SPIONs は、イメージ組織マクロファージ¹²好きな臨床ツールとして浮上しています。文献にはためのキャリアとして SPIONs のいくつかのレポートが含まれています SPIONs は核酸配信車^11,13,14,15、我々 の知識としては広く研究もされている中マクロファージ標的 siRNA 送達。SPIONs による遺伝子デリバリーの彼らの表面は親水性カチオン性ポリマー、負荷電の核酸静電魅了できテザーの層でコーティング通常。その表面が低分子量 (10 kDa) 分岐プリンスエド ワード島 (PEI SPIONs) と変更された SPIONs を合成する方法を紹介します。これらの磁気 nanoplatforms の採用 siRNA は、細胞への siRNA トランスポートを有効にするプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を形成を凝縮していますし。我々 は、細網内皮のシステム¹⁶の細胞によって SPIONs の自発的な貪食能を理由バインディングの強力な能力と相まって、PEI SPIONs に siRNA の効率的な輸送に適したレンダリングしますペイによる核酸を凝縮マクロファージ。ここで表示されるデータは、PEI スパイ/siRNA による遺伝子サイレンシング文化だけでなく、体内のマクロファージの可能性をサポートします。

プロトコル

含む生きた動物は動物に従って実行されたすべてのメソッドは気し、中国・東南大学のガイドラインを使用します。

1. プリンスエド ワード島 SPIONs の作製

1. オレイン酸変性 SPIONs の作製
   1. した FeCl₃•6H₂O および FeSO₄•7H₂O N₂の保護の下で水に溶解します。
      1. ビーカーにした FeCl₃•6H₂O の 28 g と 20 g の FeSO₄•7H₂O に 80 mL の脱イオン水を追加します。ガラス管を通して水に N₂を導入して固形物が溶解するまで攪拌します。
      2. アンモニア水 (28%) の 40 mL の添加に続いて 800 の rpm の撹拌速度の 72 ° C に反応混合物を加熱します。5 分間かき混ぜます。
   2. 上記の溶液に滴下オレイン酸の 9 mL を追加し、72 ° C、3 h でかき混ぜます。
   3. 部屋の温度 (RT) に得られた溶液を冷却します。磁気分離によるソリューションを沈殿させます。
   4. SPIONs 3 を含む沈殿物を洗うエチルアルコールを絶対 x、その後、N-ヘキサン 100 mL で沈殿物。
2. ジメルカプトコハク酸変性 SPIONs の作製
   1. オレイン酸 (OA) の 800 mg を追加-N-ヘキサン 200 mL に分散 SPIONs を変更し、60 ° C の水浴中で 3 首フラスコにアセトン 200 mL に分散したジメルカプトコハク酸 (DMSA) 400 mg
      注: 前の手順から得られる OA 変更スパイの濃度を決定するには、スパイの分散の少量 (1 mL など) を取る N-ヘキサンを揮発し、結果の粉の重量を量る。
   2. 1,000 rpm で攪拌、還流と上記の溶液に滴下トリエチルアミンの 200 μ L を追加します。
   3. 撹拌し、還流の 5 h は後に、、磁気分離による黒い沈殿物を取得します。
   4. 水酸化テトラメチル アンモニウムを用いた水溶液の pH を調整することによって脱イオン水中の親水性の SPIONs を均一分散させます。
3. SPIONs-PEI の準備
   1. PEI ソリューション (10 kDa) 2 時間 1,000 rpm で機械的攪拌下で 500 mL 三首フラスコ内に滴下 DMSA 変更スパイ コロイド溶液を追加 (W_Fe: W_ペイ= 1:3)。
      注: 電荷とプリンスエド ワード島 SPIONs のサイズは W_ペイする W_Feの比率によって異なります。W_Fe: W_{プリンスエド ワード島}比 1:3 は PEI SPIONs siRNA 配信に適したを合成するための良い出発点にすることができます。
   2. 100 kDa の分子量カットオフと 15 mL の内容を持つ限外ろ過チューブに得られた溶液を追加します。その後、残りの溶液が 1 mL になるまで 10 分間 5,400 × g で遠心します。ボリューム 15 mL を再び作るし、上記の手順 10 を繰り返しますソリューションに脱イオン水を追加 x 最終製品を入手します。その後、0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターし、4 ° C で最終的な製品をストア
   3. フェナントロリン¹⁷を用いた比色法によるプリンスエド ワード島 SPIONs の Fe の濃度を決定します。1 mg Fe/mL の濃度に無菌純水で PEI SPIONs を希釈し、4 ° C で保存
   4. プリンスエド ワード島スパイ ソリューション (1 mg Fe/mL) の 10 μ L を脱イオン水に 1 mL に希釈します。次に、動的光散乱装置による流体サイズ、ゼータ電位をテストします。
      注: についての範囲で PEI SPIONs を準備する 30-50 nm。このサイズの範囲で siRNA 結合と細胞内取り込みに及ぼす NP サイズは重要であると表示されません。PEI SPIONs 軸受の平均電位以上 37 mV は、トランスフェクションの線量範囲に有毒であることし、安全性を確保するための細胞毒性の試金を実行必要があります。表面電荷とナノ粒子のサイズは、プリンスエド ワード島のコンテンツを調整することによって目的の範囲内で制御できます。

2. 準備中とプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs の Agarose ゲル電気泳動

1. 最終濃度 20 μ M (0.26 μ g/μ L) を生成するための水の RNase フリーで siRNA を希釈します。
2. 0、1、2、4、および 8 というラベルの付いた 5 つの RNase フリー遠心チューブを準備します。ラベルは、異なる Fe: siRNA の重量比を表します。ピペット 3 μ L のすべてのチューブ (siRNA/チューブの ~0.8 μ g) に siRNA ソリューション。
3. プリンスエド ワード島 SPIONs の形でそれぞれ 0、1、2、4、および 8、ラベルの付いたチューブに Fe の 6.4 μ g、3.2、1.6 0.8 0 を追加します。各管の総サンプル ボリューム未満 20 μ L をまま。上下に軽くピペッティングで混ぜます。
4. プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合体の形成を許可する 30 分間常温混合物を孵化させなさい。この期間の間に 3% の agarose 高純度 agarose のゲルを作る。
   注: (たとえば、5 または 6) 他の Fe: siRNA 比追加ペイ-スパイ-sirna 複合は準備およびテストが可能します。
5. 6 x 5 μ L のサンプルごとの DNA の読み込みバッファーの 1 μ L を追加し、慎重に混ぜます。すべてのサンプルをロードし、ブロモフェノールの青ゲルの長さの 3 分の 2 まで移行まで 5 V/cm で電気泳動を実行します。エチジウム ブロマイド (EB) 15 ~ 20 分でゲルを染色します。
   注: 作りたて電気泳動バッファーと EB 液使用する必要があります。
6. UV のイメージング システムの下で siRNA バンドを視覚化します。PEI SPIONs と錯体を形成する siRNA で Fe: siRNA 比を確認し、その結果、無料 siRNA を表すバンドが遅滞または検出されません。

3. RAW264.7 マクロファージのIn Vitroトランスフェクション

1. マウスのマクロファージ様 RAW264.7 細胞 DMEM を使用して 10 cm 皿中含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 5% CO₂インキュベーターで 37 ° C で 100 μ g/mL ストレプトマイシンあたり 100 U/mL ペニシリンあたりを完了します。
2. トランスフェクション前日細胞から培地を吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) でそれらをすすいでください。10 cm 皿に 0.25% トリプシンの 1 mL を追加します。5% CO₂インキュベーターで 37 ° C で約 5-10 分のための RAW264.7 細胞を trypsinize します。
3. ときに細胞の大半をデタッチ (5-10 分) 後、トリプシンを不活化する料理に DMEM 完全培地 5 mL を追加します。単一セルの細胞塊の分散を上下にピペットで移しなさい。
4. 細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。それは清ルート削除で 3 分間 300 × g で遠心します。
5. 新鮮な DMEM 完全培地 5 mL で細胞を再懸濁し、セルをカウントします。
6. プレート 9 × 10⁴セルごと完全 DMEM 培地 2 mL で 6 ウェル プレートでよく、37 ° c 24 時間約 5% CO₂インキュベーターで孵化させなさい。
   メモ: 異なるサイズのプレートを使用している場合は、細胞のトランスフェクション時に 80% の confluency に到達できるように相対的な表面積に比例してめっきセル密度を調整します。
7. セル密度が 80% と、細胞からメディアを取り出して、ウェルあたり DMEM 完全培地 1 mL を置き換えます。プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合が用意されている (約 30 分) の使用のため準備ができているまでプレートをインキュベーターに戻ります。
8. プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合の準備: プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合トランスフェクション実験に必要な量を計算します。1.5 mL 遠心チューブ RNase フリー、指定された Fe: siRNA の比率で siRNA を PEI SPIONs の適切な量をミックスします。例えば、4 の Fe: siRNA 比率で fe 100 μ g を含むペイ-スパイ/siRNA NPs を準備する 100 に追加 μ (1 mg Fe/mL) PEI SPIONs sirna (0.26 μ g/μ L)、96 μ L にはマイクロ ピペットをゆっくり混合すること続きます。室温 30 分間インキュベートします。
   注: 任意の付随的損失の勘定合計の最終的な質量を超える 10% は、プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合体のボリュームを準備します。低鉄: siRNA 比、する siRNA 分子は PEI SPIONs に完全に読み込まれ、潜在的な細胞毒性を最小限に抑えるためしたがって、PEI SPIONs の少量を使用できますでペイ-スパイ-sirna 複合体を作る。Fe: siRNA 比の最適化のためのパイロット実験 (遅滞ゲルの試金) が必要です。
9. インキュベーター (ステップ 3.7) から 6 ウェル プレートを取り出してください。各ウェルに滴下ペイ-スパイ-sirna 複合体の必要なボリュームを追加し、均一な配分を確保するように慎重にプレートを旋回します。細胞摂取または遺伝子ノックダウン効率 (1-3 d) の評価まで、インキュベーターにプレートを返します。
   注: ~ 15 μ g 鉄/mL の濃度でペイ-スパイ/siRNA 株マクロファージが潜在的な細胞毒性を最小限に抑えながらトランスフェクション効率を最大化します。

4. 実験的関節炎ラットにおけるマクロファージへの siRNA の全身配信

1. 7 週齢は、特定の病原体フリー男性 Wistar ラットを取得します。7 d 使用前のラットを慣らすし、十分な食料と水を提供します。上記¹⁸としてラットにアジュバント関節炎 (AA) を誘導します。
2. プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合 3.8 の手順で説明するように準備します。
3. AA ラット経由尾静脈にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs (0.3 mg/kg の siRNA の) を挿入します。細胞内取り込みを介して、例えば、フローサイトメトリー、組織体内を介して、例えば、リアルタイム蛍光イメージング システム、評価や治療効果に基づいて、例えば、臨床的、組織学的、およびレントゲン写真希望の時間に分析は、^{18 を}をポイントします。
   注: 細胞およびティッシュの体内研究目的の NPs 内の単回投与でラットを扱う治療学 3 週連続週 × テスト 1 NPs でラットを注入します。

結果

サイズとゼータ 29 48 nm の範囲、PEI SPIONs このプロトコルで準備の潜在性 (多分散性インデックス: 0.12 - 0.23) と 30 48 mV、それぞれ。12 ヶ月以上明らかな集計なしの 4 ° C で水に安定していた。彼らの siRNA の結合能を評価するには、PEI SPIONs Fe: siRNA 重量比はさまざまな siRNA と混合。図 1は、Fe: siRNA の重量比に達する 4 から無料 siRNA のバンドは完全に...

ディスカッション

マクロファージは、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム、脂質種などの一般的に使用される nonviral アプローチを使って耐火物。ここでマクロファージ siRNA を使って信頼性と効率的な方法について説明しました。現在のプロトコルを使用して、以上マクロファージのような未加工 264.7 のセル (図 2 b) とラット腹腔マクロファージ¹⁸の 90% こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum	Gibco	A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit	Promega	G3582	For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
Tissue culture plates (6-well)	Corning	3516
Tissue culture dishes (10 cm)	Corning	430167
RNase-free tubes (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar rats	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder	National Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	E107079
Ammonia water	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	A112077
Oleic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	O108484
Dimethylsulfoxide	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D103272
FeSO4•7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3•6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D107254
ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	T100882
Particle size and zeta potential analyzer	Malvern, England	Nano ZS90